一种坛紫菜纯系种苗培育方法
【专利摘要】一种坛紫菜纯系种苗培育方法，涉及坛紫菜。将单株坛紫菜叶状体表面清洗后阴干，冷冻保存后取出，再静水弱光复苏培养；取营养组织块放置于葡萄糖溶液中浸泡，将营养组织块剪成小块，再放置于海螺酶溶液中酶解，观察细胞解离状况，当观察到藻体碎片游离出单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后重复离心；将收集到的细胞放入消毒海水中黑暗培养后，在1/2MES培养液继续培养，直至培养液恢复正常海水盐度后继续培养20～30d后，将丝状体吸出，即为纯系种质丝状体，再静水培养，进行保种，然后经一级扩增、二级扩增和三级扩增后得纯系自由丝状体；将纯系自由丝状体移植到贝壳进行种苗培育。
【专利说明】
_种坛紫菜纯系种苗培育方法
技术领域
[0001]本发明涉及坛紫菜，尤其是涉及一种坛紫菜纯系种苗培育方法。
【背景技术】
[0002]坛紫菜(Pyropia haitanensis)是我国紫菜人工栽培的两个主要种类之一，原产于我国福建沿海，是我国特有的暖温带性种类。自上世纪60年代全人工栽培取得成功以来，坛紫菜的栽培面积不断扩大，目前已成为我国南方沿海海水养殖的主要对象之一，其产量占全国紫菜总产量的75%以上。
[0003]坛紫菜的生活史可以分为形态结构完全不同的两个世代:叶状体世代和丝状体世代。叶状体世代是海上人工栽培和收获的对象，而丝状体则是室内人工育苗的对象，可以作为种质材料长期保存。在传统的坛紫菜育苗生产中，一般采用从野生或人工栽培的坛紫菜成熟叶状体中选取种藻，从这些种藻上采集果孢子进行种苗的培育。采用这种方法培育的种苗，由于叶状体来源不一致，是个大杂系，种源遗传背景复杂，导致培育的种苗良莠不齐，无法实现纯种化生产，保证种苗的质量(黄春恺，严志洪.坛紫菜苗种室内培育技术[J].水产科技情报，2004,31(5): 200-202.)。
[0004]细胞工程技术的发展为坛紫菜培育纯系种质丝状体，实现纯种化育苗提供了条件。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种坛紫菜纯系种苗培育方法。
[0006]本发明包括以下步骤:
[0007]I)将单株坛紫菜叶状体表面清洗后阴干，冷冻保存，将冷冻后的单株坛紫菜叶状体取出，再次清洗后静水弱光复苏培养；
[0008]2)取单株坛紫菜叶状体的营养组织块，放置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将单株坛紫菜叶状体的营养组织块剪成小块，再放置于海螺酶溶液中酶解，酶解期间观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后重复离心；
[0009]3)将收集到的细胞放入消毒海水中黑暗培养后，在1/2MES培养液继续培养，直至培养液恢复正常海水盐度后继续培养20?30d后，将丝状体吸出，即为纯系种质丝状体，再静水培养，进行保种；
[0010]4)将步骤3)静水培养后的纯系种质丝状体经一级扩增、二级扩增和三级扩增后得到纯系自由丝状体；
[0011]5)将步骤4)得到的纯系自由丝状体移植到贝壳进行种苗培育。
[0012]在步骤I)中，所述清洗可采用毛笔清洗;所述冷冻的温度可为_18°C;所述再次清洗可采用消毒海水清洗;所述培养的条件可为:温度20 土 I °C，光照lOOOLx，12L: 12D，时间24h0
[0013]在步骤2)中，所述取单株坛紫菜叶状体的营养组织块可采用消毒过的剪刀剪取
0.5?Icm2单株坛紫菜叶状体的营养组织块;所述葡萄糖溶液的摩尔浓度可为2mol/L;浸泡的时间可为1min;所述将单株坛紫菜叶状体的营养组织块剪成小块可采用剪刀剪成小块；所述酶解的酶液配方可为:0.12g海螺酶+1.27g甘露醇+2.2mg无水CaCl2+2.4mgMgS04+10ml盐度为37的消毒海水，pH 6.0?6.2;酶解的条件可为:黑暗振荡，温度为27°C，酶解时间为I?2h;所述酶解期间观察细胞解离状况可每隔30min观察细胞解离状况;所述过滤可采用300目筛絹过滤;所述离心可在1500r/min下离心3min;所述洗涤可用盐度37的消毒海水洗涤;所述重复离心的次数可为2次。
[0014]在步骤3)中，所述消毒海水可采用盐度为37的消毒海水;所述黑暗培养的时间可为12h;所述在1/2MES培养液继续培养可每隔12h更换1/2MES培养液，连续更换3?4次，直至培养液恢复正常海水盐度;所述继续培养的条件可为:光照1000?2000Lx，12L: 12D;温度20± 1°C ;所述继续培养20?30d时，可每7d更换一次培养液;所述静水培养可将纯系种质丝状体放置于125ml广口瓶中静水培养。
[0015]在步骤4)中，所述一级扩增的具体方法可为:将步骤3)静水培养后的纯系种质丝状体用消毒后的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于500ml的锥形瓶中黑暗静置培养Id，第2d更换200?300ml培养液后恢复正常光照静置培养，培养浓度为每10ml培养液约含Ig湿重自由丝状体，培养期间每15d更换300?400ml培养液;培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需高温消毒(90?95°C )，培养条件:温度(21 ± I) °C、光强1000?2000Lx，光周期 12L:12D;
[0016]所述二级扩增的具体方法可为:将经过一级扩增的纯系丝状体用高温消毒的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于2000ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换1200?1500ml培养液后恢复正常光照静置培养，3?5d后加入充气管进行充气培养，空气需要经过3道过滤处理，使进入瓶内的空气无污染，培养浓度为每10ml培养液含2?3g湿重自由丝状体，如丝状体密度超过3g/100ml培养液时，及时分瓶培养，培养期间每1d更换1200?1500ml培养液;培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需高温消毒(90?95 °C)，培养条件:温度(21 ± I) °C、光强1000?2000Lx，光周期12L: 12D;
[0017]所述三级扩增的具体方法可为:二级扩增的纯系丝状体用高温消毒的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于5000ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换3000?4000ml培养液后恢复正常光照静置培养，3?5d后加入充气管进行充气培养。空气需要经过3道过滤处理，使进入瓶内的空气无污染。培养浓度约每10ml培养液含4?5g湿重自由丝状体，如丝状体密度超过5g/100ml培养液时，及时分瓶培养，培养期间每1d更换3000-4000ml培养液。培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需高温消毒(90?95°C )，培养条件:温度(21 ± I) °C、光强1000?2000Lx，光周期12L: 12D。
[0018]在步骤5)中，所述培育的培养基质可采用传统紫菜育苗使用的贝壳;培育的设施可采用传统紫菜育苗使用的育苗设施；
[0019]所述移植的具体方法可为:
[0020](I)纯系自由丝状体移植前处理:接种前1d用组织粉碎机将自由丝状体藻团切碎至2000?3000μπι，然后静置于玻璃瓶中黑暗培养ld，第2d更换3/4培养液，正常光照静置培养3?5d后加入充气管进行充气培养，丝状体采苗前Id再用组织粉碎机将其切碎到200?500μπι备用；
[0021](2)纯系自由丝状体移植密度:平面采苗丝状体用量按照300?500段/cm2计算，立体采苗按照60?100段/cm3计算；
[0022](3)纯系自由丝状体移植:移植用的丝状体计数后用海水稀释至约0.1亿段/L，用喷壶分4?5遍均匀泼洒至放置好贝壳的池中，再用竹竿搅拌池内的海水，使池中的丝状体片段均匀分布，然后在池子表面盖上黑布，3d后移走黑布，静置培养18?25d后即可按常规育苗方法进行正常管理，直至贝壳丝状体发育成熟用于秋季壳孢子采苗。
[0023]采用本发明可以选择已知优良性状的单株叶状体，取微小组织切块后用一定浓度的海螺酶酶解成单细胞，然后挑选单细胞在控制的条件下进行单细胞克隆培养直接萌发成丝状体，然后经过丝状体的逐级扩繁获得足够量的丝状体后，即可取代果孢子移植到贝壳上，进行纯系种苗的培育。采用该方法培育的种苗均来自于单株性状优良的叶状体，培育的种苗性状均一，质量好，有利于推广纯种化生产，避免栽培种质退化，保证坛紫菜栽培产量。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0025]1、在自然海区选择坛紫菜“闽丰I号”叶状体I株，叶状体表面用毛笔清洗干净后进行阴干和冷冻保存(_18°C);将冷冻后的藻体取出，再次用消毒海水清洗后静水弱光复苏24h (培养条件为:温度20 土 I °C，光照 I OOOLx，12L: 12D)。
[0026]2、用消毒过的剪刀剪取0.5?Icm2种藻的营养组织块，置于2mol/L的葡萄糖溶液中浸泡1min，然后用剪刀将种藻块剪成小块，放置于海螺酶溶液中酶解(酶液配方:0.12g海螺酶+1.27g甘露醇+2.2mg无水CaCl2+2.4mgMgS04+10ml盐度为37的消毒海水，pH 6.0?6.2)，酶解条件:黑暗振荡，温度为27°C，酶解时间为I?2h;酶解期间每隔30min观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，用300目筛絹过滤细胞液，滤液在1500r/min下离心3min，离心后弃上清液保留沉淀，用盐度37的消毒海水洗涤后再重复离心2次。
[0027]3、将收集到的细胞放入盐度为37的消毒海水中黑暗培养，每隔12h更换1/2MES培养液(配方:)，连续更换3?4次，直至培养液恢复正常海水盐度。接着，继续置于正常培养条件(光照1000?2000Lx，12L:12D;温度20±1°C)培养，每7d更换一次培养液。培养20?30d后，将培养皿中的丝状体吸出，即获得坛紫菜“闽丰I号”的纯系种质丝状体，将其放置于125ml广口瓶中静水培养，进行保种。
[0028]4、获得的“闽丰I号”纯系丝状体经一级扩增、二级扩增和三级扩增:
[0029]一级扩增:将纯系丝状体用高温消毒后的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于500ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换200?300ml培养液后恢复正常光照静置培养。培养浓度为每10ml培养液约含Ig湿重自由丝状体，培养期间每15d更换300?400ml培养液。
[0030]培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需高温消毒(90?950C) ο培养条件:温度(21 ± I) °C、光强1000?2000Lx，光周期12L: 12D。
[0031]二级扩增:将经过一级扩增的纯系丝状体用高温消毒的组织粉碎机切碎至100-500μπι，然后置于2000ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换1200?1500ml培养液后恢复正常光照静置培养，3?5d后加入充气管进行充气培养。空气需要经过3道过滤处理，使进入瓶内的空气无污染。培养浓度为每10ml培养液含2?3g湿重自由丝状体，如丝状体密度超过3g/100ml培养液时，及时分瓶培养，培养期间每1d更换1200?1500ml培养液。培养液及培养条件同一级培养。
[0032]三级扩增:二级扩增的纯系丝状体用高温消毒的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于5000ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换3000?4000ml培养液后恢复正常光照静置培养，3?5d后加入充气管进行充气培养。空气需要经过3道过滤处理，使进入瓶内的空气无污染。培养浓度约每10ml培养液含4?5g湿重自由丝状体，如丝状体密度超过5g/10ml培养液时，及时分瓶培养，培养期间每1d更换3000?4000ml培养液。培养液及培养条件同一级培养。
[0033]5、“闽丰I号”纯系自由丝状体移植贝壳进行种苗生产
[0034](I)培养基质:与传统紫菜育苗使用的贝壳相同。
[0035](2)育苗设施:与传统紫菜育苗使用的育苗设施相同。
[0036](3) “闽丰I号”自由丝状体移植贝壳:
[0037]自由丝状体移植前处理:接种前1d用组织粉碎机将自由丝状体藻团切碎至2000?3000μπι，然后静置于玻璃瓶中黑暗培养Id，第2d更换3/4培养液，正常光照静置培养3?5d后加入充气管进行充气培养。丝状体采苗前Id再用组织粉碎机将其切碎到200?500μπι备用。
[0038]自由丝状体移植密度:平面采苗丝状体用量按照300?500段/cm2计算，立体采苗按照60?100段/cm3计算。
[0039]自由丝状体移植:移植用的丝状体计数后用海水稀释至约0.1亿段/升，用喷壶分4?5遍均匀泼洒至放置好贝壳的池中，再用竹竿搅拌池内的海水，使池中的丝状体片段均匀分布，然后在池子表面盖上黑布，3d后移走黑布，静置培养18?25d后即可按常规育苗方法进行正常管理，直至贝壳丝状体发育成熟用于壳孢子采苗。
【主权项】
1.一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将单株坛紫菜叶状体表面清洗后阴干，冷冻保存，将冷冻后的单株坛紫菜叶状体取出，再次清洗后静水弱光复苏培养； 2)取单株坛紫菜叶状体的营养组织块，放置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将单株坛紫菜叶状体的营养组织块剪成小块，再放置于海螺酶溶液中酶解，酶解期间观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后重复离心； 3)将收集到的细胞放入消毒海水中黑暗培养后，在I/2MES培养液继续培养，直至培养液恢复正常海水盐度后继续培养20?30d后，将丝状体吸出，即为纯系种质丝状体，再静水培养，进行保种； 4)将步骤3)静水培养后的纯系种质丝状体经一级扩增、二级扩增和三级扩增后得到纯系自由丝状体； 5)将步骤4)得到的纯系自由丝状体移植到贝壳进行种苗培育。2.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤I)中，所述清洗采用毛笔清洗;所述冷冻的温度可为_18°C;所述再次清洗可采用消毒海水清洗;所述培养的条件可为:温度20 土 I °C，光照100Lx，12L: 12D，时间24h。3.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤2)中，所述取单株坛紫菜叶状体的营养组织块采用消毒过的剪刀剪取0.5?Icm2单株坛紫菜叶状体的营养组织块;所述葡萄糖溶液的摩尔浓度可为2mol/L;浸泡的时间可为1min;所述将单株坛紫菜叶状体的营养组织块剪成小块可采用剪刀剪成小块。4.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤2)中，所述酶解的酶液配方为:0.12g海螺酶+1.27g甘露醇+2.2mg无水CaCl2+2.4mgMgS04+10ml盐度为37的消毒海水，PH 6.0?6.2;酶解的条件可为:黑暗振荡，温度为27°C，酶解时间为I?2h;所述酶解期间观察细胞解离状况可每隔30min观察细胞解离状况;所述过滤可采用300目筛絹过滤;所述离心可在1500r/min下离心3min;所述洗涤可用盐度37的消毒海水洗涤;所述重复离心的次数可为2次。5.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤3)中，所述消毒海水采用盐度为37的消毒海水;所述黑暗培养的时间可为12h;所述在I /2MES培养液继续培养可每隔12h更换1/2MES培养液，连续更换3?4次，直至培养液恢复正常海水盐度;所述继续培养的条件可为:光照1000?2000Lx，12L: 12D;温度20 ± TC ;所述继续培养20?30d时，可每7d更换一次培养液;所述静水培养可将纯系种质丝状体放置于125ml广口瓶中静水培养。6.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤4)中，所述一级扩增的具体方法为:将步骤3)静水培养后的纯系种质丝状体用消毒后的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于500ml的锥形瓶中黑暗静置培养Id，第2d更换200?300ml培养液后恢复正常光照静置培养，培养浓度为每10ml培养液约含Ig湿重自由丝状体，培养期间每15d更换300?400ml培养液;培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需90?95 °C消毒，培养条件:温度21 ± 1°C、光强1000?2000Lx，光周期12L: 12D。7.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤4)中，所述二级扩增的具体方法为:将经过一级扩增的纯系丝状体用高温消毒的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于2000ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换1200?1500ml培养液后恢复正常光照静置培养，3?5d后加入充气管进行充气培养，空气需要经过3道过滤处理，使进入瓶内的空气无污染，培养浓度为每10ml培养液含2?3g湿重自由丝状体，如丝状体密度超过3g/100ml培养液时，及时分瓶培养，培养期间每1d更换1200?1500ml培养液;培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需90?95 0C消毒，培养条件:温度21 土 I0C、光强 1000?2000Lx，光周期 12L: 12D。8.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤4)中，所述三级扩增的具体方法为:二级扩增的纯系丝状体用高温消毒的组织粉碎机切碎至100?500μπι，然后置于5000ml的锥形瓶中黑暗静置培养ld，第2d更换3000?4000ml培养液后恢复正常光照静置培养，3?5d后加入充气管进行充气培养，空气需要经过3道过滤处理，使进入瓶内的空气无污染;培养浓度约每10ml培养液含4?5g湿重自由丝状体，如丝状体密度超过5g/10ml培养液时，及时分瓶培养，培养期间每1d更换3000-4000ml培养液;培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需90?95°C消毒，培养条件:温度21± TC、光强1000 ?2000Lx，光周期 12L:12D。9.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤5)中，所述培育的培养基质采用传统紫菜育苗使用的贝壳；培育的设施采用传统紫菜育苗使用的育苗设施。10.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤5)中，所述移植的具体方法为: (1)纯系自由丝状体移植前处理:接种前1d用组织粉碎机将自由丝状体藻团切碎至2000?3000μπι，然后静置于玻璃瓶中黑暗培养Id，第2d更换3/4培养液，正常光照静置培养3?5d后加入充气管进行充气培养，丝状体采苗前Id再用组织粉碎机将其切碎到200?500μπι备用; (2)纯系自由丝状体移植密度:平面采苗丝状体用量按照300?500段/cm2计算，立体采苗按照60?100段/cm3计算； (3)纯系自由丝状体移植:移植用的丝状体计数后用海水稀释至约0.1亿段/L，用喷壶分4?5遍均匀泼洒至放置好贝壳的池中，再用竹竿搅拌池内的海水，使池中的丝状体片段均匀分布，然后在池子表面盖上黑布，3d后移走黑布，静置培养18?25d后即可按常规育苗方法进行正常管理，直至贝壳丝状体发育成熟用于秋季壳孢子采苗。
【文档编号】A01G33/02GK105993909SQ201610319288
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】谢潮添, 徐燕, 纪德华, 陈昌生
【申请人】集美大学