三叶青侧枝诱导的种苗培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种Ξ叶青侧枝诱导的种苗培育方法，属于组织培养植物再生技术领 域。
【背景技术】
[0002] Ξ叶青是民间常用药，块根或全草可W入药，可用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝 炎、肾炎、风湿搏痛、跌打损伤、痴疗疮巧、湿疹、蛇伤等（国家中医药管理局（中华本草)编委 会（1999)中华本草，上海科学技术出版社）。《本草纲目》记载"Ξ叶崖爬藤，性味苦、辛、凉， 清热解毒、活血桂风"；《植物名实图考》记载"蛇附子可治小儿高热、止腹痛、取浆冲服"；《浙 江民间常用草药》记载"治小儿风热，惊风和痛气痛;治蛇咬"；《江西草药》记载"治小儿高热 惊厥，肺炎，肝炎，外伤出血"等等。近年来在现代药理学、化学成分等方面取得了一些进展， 本文对Ξ叶青的化学成分、药理作用、临床应用及生物工程等研究现状进行较为系统的阐 述，为研究者提供借鉴。
[0003] 在S叶青的栽培技术方面，Dai等化ffects of shade treatments on the photosynthetic c曰p曰city,chlorophyll fluorescence,曰nd chlorophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.Environmental and Experimental Botany， 65,177-182)将Ξ叶青在强、中、弱光照条件下培养一个月后，通过观察叶片形态、净光合速 率及叶绿素巧光反应，发现遮光率低于50%会降低Ξ叶青光合活性而高于75%则限制碳同 化作用，都会抑制植物生长，对于Ξ叶青培养，约67%的遮光率才是最适合的光照条件;牟 豪杰和董爱兰(CN 101822166A)提供了一套Ξ叶青人工栽培的实施步骤，从选择种植地、种 植时间、繁殖材料类型，到施肥、追肥、使用遮荫棚，到最后的采收等都进行了优化选择;吉 庆勇（Ξ叶青杆插繁殖技术研究，现代中药研究与实践，2,12-14)根据生根剂用量、插穗年 龄和基质对插穗生根的影响进行了研究，发现2~3年生老枝用lOOOmg/L IBA溶液浸溃10s 后杆插于黄±中生根效果最佳;吉庆勇（CN 102919013A)发明了一种高效仿野生栽培技术 方法，与人工栽培不同的是，增加了滴灌设备、微生物菌肥，并引导Ξ叶青上架进行立体种 植。傅婷婷(Ξ叶青总黄酬的提取及纯化工艺研究，硕±论文，浙江大学)对Ξ叶青总黄酬提 取及纯化工艺进行研究，利用紫外/可见分光光度法建立了总黄酬含量测定方法，利用大孔 吸附树脂法优化了其纯化条件。严余明（不同工艺Ξ叶青制剂对人肺癌A549裸鼠移植瘤生长 抑制作用比较研究，浙江中医杂志，8,604-606)通过Ξ种不同工艺制得的Ξ叶青药剂(冻干 粉、水煎剂、饮片粉)灌喂人肺癌A549移植瘤裸鼠，测定其肿瘤生长动态体积和抑瘤率，发现 Ξ叶青冻干粉和饮片粉抗人肺癌A 549裸鼠移植瘤的作用强于水煎剂，而冻干粉发挥抑瘤 效果的时间要早于饮片粉。显而易见，Ξ叶青的栽培和加工工艺的研究比较滞后，需要进一 步加大投入研究力度，提高Ξ叶青的种植和加工工艺水平。
[0004] 目前，Ξ叶青生物工程主要设及组织培养。钱丽华(药用植物"Ξ叶青"的组培快繁 技术研究，杭州农业科技，6,22-23) 叶青蔽芽为材料，进行了蔽芽外植体诱导技术、不 定芽继代增殖技术及试管苗生根技术研究，实现了其离体快速繁殖，并发现23μπιο1 . πΓ2 · s^i的光照强度有利于蔽芽的萌发;钟銃倩(Ξ叶青的组织培养与快速繁殖研究，浙江中医杂 志，6,363)用Ξ叶青的茎尖、带蔽芽的茎段和叶片为外植体，研究发现最佳诱导外植体为茎 尖；Jiang W.Μ.等（High-frequency shoot regeneration of nodal explants from Tetrastigma hemsleyanum Diels et GiIg：Avaluable medicinal plant.African Journal of Biotechnology, 10,12177-12181)用Ξ叶青的带蔽芽的茎段为外植体，通过对 外植体的选取与处理、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽等步骤建立了一套组培快繁体 系；卢爱芳等ΓΞ叶青愈伤组织培养及其总黄酬含量的研究"，中药材，7，1042-1045)ΚΞ 叶青叶片、茎段和无菌苗叶片为外植体，诱导形成愈伤组织，并对其中两种愈伤组织、叶片、 块根中的总黄酬含量进行测定，发现总黄酬在愈伤组织中含量较高;彭昕Γ正交法优化Ξ 叶青继代增殖与生根培养的条件"，现代中药研究与实践，2,10-12)等用Ξ叶青的幼嫩带芽 茎段为外植体，通过正交试验对其蔽芽增殖、生根培养条件进行优化，得出最适培养基。
[0005] 上述培育方法通常是ΚΞ叶青的芽、叶片、根茎等作为培养对象，其优势在于生长 快，但所培养的植物苗弱，环境适应性差，尤其是在转移栽培过程中，成活率较低，并不利于 Ξ叶青的培养。
[0006] 基于此，做出本申请。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有Ξ叶青培养所存在的上述缺陷，本发明提供一种培养快捷、成活率 高、苗壮、环境适应性强的Ξ叶青侧枝诱导的种苗培养方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0009] Ξ叶青侧枝诱导的种苗培养方法，ΚΞ叶青带蔽芽的茎段作为处理对象，进行如 下操作：（1)无菌材料:剪取Ξ叶青带蔽芽的茎段，清洗得到无菌材料；（2)培养基：WMS或1/ 2MS作为基础培养基，添加生长素或/和细胞分裂素，分别得到初代培养基、继代培养基和生 根培养基，初代培养基、继代培养基与生根培养基中薦糖含量不同；（3)初代培养:将步骤 (1)中的无菌材料接种到初代培养基上，并露出蔽芽，培养30-45天，得到初代无菌苗，侧枝 发达；（4)继代增殖培养:将初代无菌苗侧枝分离，剪取带蔽芽和3-6片叶片的侧枝，转接于 继代培养基中增殖培养，诱导侧枝生长，得继代苗：（5)壮苗生根培育:继代苗分离并转入MS 培养基中，进行壮苗培养30天后，进入生根培养基，培养10-20天，得生根无菌苗；（6)驯化： 将生根无菌苗移至人工气候室，加水至高于培养基表面，光照驯化培养3-5天；（7)移栽:将 赔石:草炭±安装2:1的质量比混合，高压灭菌后作为基质，将驯化后的苗洗去培养基，在仅 保留顶端叶片的情况下移在基质中，即完成Ξ叶青的培养。
[0010] 进一步的，作为优选：
[0011] 步骤(1)中，所选取的Ξ叶青茎段是现在人工气候室中培养15-30天后所剪取的新 抽出枝条上半木质化的带蔽芽茎段，与常规直接剪取野外Ξ叶青枝条相比，预先培养，有利 于Ξ叶青的缓冲培养，大大减少污染率;所述的清洗是指:将剪取的Ξ叶青带蔽芽的茎段流 水冲洗1-2小时，洗洁精清洗3-5分钟（添加一滴洗洁精，去除外植体表面张力，有利于除 菌），再依次采用无菌水一道清洗、70%乙醇清洗20-30秒，无菌水二道清洗、升隶灭菌8-10 分钟，无菌水Ξ道清洗4-5次。
[0012] 步骤(2)中，所述的初代培养基和继代培养基中，薦糖质量百分比为2.5-3%;生根 培养基中，薦糖质量百分数为1.5-2% ;环境条件:光照时间16小时，光照强度2000LUX，溫度 26±2°C。
[001 引步骤(3)中，初代培养基组成为：（1/2-1 )MS+( 1-1.5mg/L)她A+(0-0.5mg/L)NAA。
[0014] 步骤（4)中，所述的继代培养基的组成为：（1/2-1)15+(1-1.5111旨几）684+(0- 0.025mg/L)GA+0.025mg/L NAA。
[0015] 步骤(5)中，壮苗培养采用纯MS培养基;生根培养基的组成为l/2MS+(0.5-1.5mg/ L)IBA或l/2MS+(0.5-1.5mg/L)NAA。
[0016] 本申请中，草炭±是指炭±有机质含量在30% W上，比重0.7-1.05，呈栋色或黑 色，pH值一般为5.5~6.5，呈微酸性反应，呈层状分布。
【附图说明】
[0017] 图1-1为第一种配方条件下茎尖较嫩蔽芽诱导长大的无菌苗；
[0018] 图1-2为第一种配方条件下半木质化茎段的蔽芽诱导长大的无菌苗；
[0019] 图1-3为第二种配方条件下茎尖较嫩蔽芽诱导长大的无菌苗；
[0020] 图1-4为第二种配方条件下半木质化茎段的蔽芽诱导长大的无菌苗；
[0021 ]图1-5为第Ξ种配方条件下茎尖较嫩蔽芽诱导长大的无菌苗；
[0022] 图1-6为第Ξ种配方条件下半木质化茎段的蔽芽诱导长大的无菌苗；
[0023] 图2-1为继代母株；
[0024] 图2-2为分离得到的继代子株；
[00巧]图2-3为继代增殖苗；
[00%] 图3-1为生根苗；
[0027]图3-2为生根培养15天时的生根状态；
[00%]图3-3为生根培养30天时的生根状态。