一种金线莲组织培养快速增殖方法
【专利摘要】本发明公开金线莲组织培养快速增殖方法，对外植体清洗消毒，接入MS培养基，前一周弱光培养，一周后强光培养，光照时间10小时/天，温度23±2℃，培养40天；接入配比为MS培养基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA0.2-0.3mg/L的液体培养基中增殖培养，培养条件为暗培养，温度23±2℃，培养周期45天；壮苗培养基为MS培养基，光照培养，光照时间8小时/天，温度23±2℃，培养周期12-15天；生根培养基配比：1/2MS、香蕉60g/L、活性炭1g/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照时间10小时/天，温度23±2℃，培养周期3个月。该方法实现金线莲工业化快速繁育，缩短了培养周期。
【专利说明】一种金线莲组织培养快速增殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是指一种金线莲组织培养快速增殖方法。
【背景技术】
[0002]金线莲(Anoectochilusroxburghii (Wall.) Lindl)是兰科开唇兰属的多年生草本植物，具有清热解毒、祛风利湿、滋阴润肺及降血压等功效。同时，金线莲株型小巧美观，叶形优美，叶脉金黄色，呈网状排列，具有极高的观赏价值。
[0003]然而，金线莲种子自然萌发率和繁殖率低，生长缓慢，加上人为大量采挖及生态环境的破坏，野生金线莲资源日渐枯竭。现有技术中，通过组织培养建立无性繁殖系，对金线莲资源进行保护和合理利用。目前，金线莲培育主要是固体培养基实现芽诱导、增殖与壮苗，其缺陷在于:增殖倍率低，培养时间长，成本高，使得金线莲得不到较快的发展。
[0004]金线莲培育的另一种方法为液体培养基培育，液体培养基通过摇床浅层震荡进行金线莲增殖比固体增殖速度更快。液体培养能让所有的外植体充分而均匀的吸收养分，同时能够避免褐化物对培养物生长的影响，有鉴于此，本发明人研发出一种金线莲组织培养快速增殖方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种金线莲组织培养快速增殖方法，解决金线莲增殖率低，繁殖周期长及成本高等问题，实现金线莲工业化快速繁育。
[0006]为达成上述目的，本发明的解决方案为:
一种金线莲组织培养快速增殖方法，包括以下步骤:
外植体诱导:采取金线莲植株作为外植体，先对外植体进行清洗、消毒，接入不添加激素的MS基本培养基诱导培养,前一周弱光培养，光照强度500-800Lux, —周后强光培养,光照强度1500-2000Lux，光照时间10小时/天，温度23±2°C，培养40天；
增殖培养:接入液体培养基中进液体增殖培养，液体增殖培养基配比:MS培养基、6-BA(6-卞基嘌呤)1.4-1.6 mg/L、NAA (萘乙酸)0.2-0.3 mg/L，培养条件为暗培养，温度为23±2°C，培养周期45天；
壮苗培养:壮苗培养基为无激素液体改良MS培养基，光照培养，光强为1200-1500LUX，光照时间为8小时/天，温度为23±2 °C，培养周期为12-15天；
生根培养:生根培养基配比:1/2MS、香蕉60g/L、活性炭lg/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照培养，光照时间10小时/天，光照强度1500-2500 Lux，温度为23±2 °C，培养周期为3个月。
[0007]所述外植体清洗、消毒的具体步骤为:先用洗衣粉水溶液浸泡5 min (分钟)，自来水冲洗干净；置于无菌工作台中， 75% (体积分数)的酒精消毒30s (秒)，无菌水冲洗I次，再用0.1% (质量分数)的升汞(HgCl2)消毒3min，无菌水冲洗3次，最后用10% (质量分数)的次氯酸钠消毒6-8min，无菌水冲洗5次。[0008]所述外植体消毒完成后，吸干水分切成I ±0.1 cm的茎段，然后接入不添加激素的MS基本培养基中进行诱导培养，pH5.6-5.8。
[0009]所述增殖培养及壮苗培养均采用液体浅层震荡培养，采用直径80cm (厘米)、高IOOcm耐高温PP组培瓶培养，培养液的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液的2/3-3/4，并置于大型工业摇床上，转速80-100r/min。
[0010]所述增殖培养每隔15天更换一次培养液并分瓶，45天后转入壮苗培养基中。
[0011]采用上述方案后，本发明的种金线莲组织培养快速增殖方法解决了增殖倍率低，培养时间长及生产成本高等问题，实现金线莲工业化快速繁育，缩短了培养周期，45天增殖倍率达25倍。【具体实施方式】
[0012]运用本发明进行金线莲组织培养的具体实施例:
一、外植体诱导培养
采取健壮的无病虫害的金线莲植株，去除根、根毛、叶片及顶芽，自来水清洗干净，洗衣粉水浸泡5min，然后自来水冲洗干净，移至无菌操作台上。75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗I次，0.1%的升汞消毒3min，无菌水冲洗3次，10%的次氯酸钠消毒6_8min，无菌水冲洗5次，浙干水分，放入无菌的接种盘中备用。将消毒好的茎段在接种台上剪成Icm左右，含一个茎节的若干茎段，接种于诱导培养基中，每瓶接一个茎段。若是采用无菌苗直接接种，则只需要在接种台上将组培苗去叶，将茎段剪成1±0.1 cm，含一个茎节的若干茎段，直接接入诱导培养基中进行诱导分化培养。培养条件:前一周弱光培养，光照强度500-800Lux(勒克斯)，一周后强光培养，光照强度1500-2000Lux，光照时间IOh/天，温度为23±2°C，诱导培养基为不添加激素的MS基本培养基，40天诱导出1-2个腋芽。
[0013]二、金线莲液体增殖培养
金线莲经过诱导阶段后，每个茎段带1-2个腋芽，高度在0.2-0.5 cm,接入液体增殖培养基中，液体增殖培养基的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液2/3-3/4为宜。本实施例中采用直径80cm，高100 cm耐高温PP组培瓶培养，接种量为10个带1_2个腋芽、高
0.5-1.0cm的10个茎段，置于大型工业摇床上进行浅层震荡培养，转速80-100 r/min。培养基配比是MS培养基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA 0.2-0.3mg/L,培养条件是暗培养，培养室温度23±2°C，培养周期45天，每隔15天更换一次培养液并且分瓶，见表1，金线莲通过液体培养基增殖，增殖倍率可达25倍。
[0014]表1金线莲不同时间段增殖特点
【权利要求】
1.一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，包括以下步骤: 外植体诱导:采取金线莲植株作为外植体，先对外植体进行清洗、消毒，接入不添加激素的MS基本培养基诱导培养,前一周弱光培养，光照强度500-800LUX, —周后强光培养,光照强度1500-2000Lux，光照时间10小时/天，温度23±2°C，培养40天； 增殖培养:接入液体培养基中进液体增殖培养，液体增殖培养基配比:MS培养基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA0.2-0.3mg/L，培养条件为暗培养，温度为23±2°C，培养周期45天； 壮苗培养:壮苗培养基为无激素液体改良MS培养基，光照培养，光强为1200-1500LUX，光照时间为8小时/天，温度为23±2°C，培养周期为12-15天； 生根培养:生根培养基配比:1/2MS、香蕉60g/L、活性炭lg/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照培养，光照时间10小时/天，光照强度1500-2500Lux，温度为23±2°C，培养周期为3个月。
2.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述外植体清洗、消毒的具体步骤为:先用洗衣粉水溶液浸泡5min，自来水冲洗干净；置于无菌工作台中，75%的酒精消毒30s,无菌水冲洗I次,再用0.1%的升萊消毒3 min,无菌水冲洗3次,最后用10%的次氯酸钠消毒6-8min，无菌水冲洗5次。
3.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述外植体消毒完成后，吸干水分切成1±0.1 Cm的茎段，然后接入不添加激素的MS基本培养基中进行诱导培养，pH 5.6-5.8。
4.如权利要求1所述的一种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述增殖培养及壮苗培养均采用液体浅层震荡培养，采用直径80cm、高IOOcm耐高温PP组培瓶培养，培养液的量为瓶身的1/6-1/5，接种量为培养液的2/3-3/4，并置于大型工业摇床上，转速80-100r/min。
5.如权利要求1所述的一`种金线莲组织培养快速增殖方法，其特征在于，所述增殖培养每隔15天更换一次培养液并分瓶，45天后转入壮苗培养基中。
【文档编号】A01H4/00GK103858762SQ201410096819
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】石斗开, 陈瑞凤, 陈秀环, 赖鹭挺, 赖鹭捷, 陆利春 申请人:厦门涌泉科技有限公司