扩增蝰科蛇类物种dna条形码coi序列的引物及pcr方法和试剂盒的制作方法

扩增蝰科蛇类物种dna条形码coi序列的引物及pcr方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于蝰科蛇类物种及中药材鉴定【技术领域】，公开了一种扩增蝰科蛇类物种COI序列的引物及PCR方法和试剂盒，包括DNA提取、PCR扩增、电泳检测等步骤。本发明具有简便快捷、DNA用量少、通用性好等特点，弥补了现有技术中COI序列通用引物(LCO1490和HCO2198)在蝰科蛇类基因扩增及药材鉴定中的不足。本发明可用于蝰科蛇类药材COI序列的扩增，为该科蛇类药材的分子鉴定奠定基础。
【专利说明】扩增蝰科蛇类物种DNA条形码COI序列的引物及PCR方法和试剂盒

【技术领域】
[0001]本发明属于蝰科蛇类物种及中药材鉴定【技术领域】，具体涉及一种能扩增蝰科蛇类物种COI条形码序列的通用引物及PCR方法和试剂盒。

【背景技术】
[0002]蛇类药材在我国使用历史悠久，可追溯至公元前的春秋战国时期，历代本草特别是李时珍的《本草纲目》更是广收博蓄，成为古代本草中收载蛇类药物最多的药著。《中国药典》(2010年版)收载了蕲蛇(五步蛇)、乌梢蛇、金钱白花蛇(银环蛇)和蛇蜕(乌梢蛇、锦蛇、黑眉锦蛇)等5个种，4味药材。
[0003]蛇是一个生态相对脆弱的种群，一是本身繁殖能力不强，二是生态环境易遭破坏。由于各种目的的捕捉及蛇类资源面临的较大压力，使得药用蛇类的市售价格居高不下。在这种供不应求的局势及利益最大化的驱使下，一些不法商家以次充好，对药用蛇类进行造假。随着分子生物学的发展，DNA分子技术用于各种蛇类药材鉴定的研究越来越多。
[0004]DNA条形码(DNA barcoding)是由加拿大动物学家Herbert首次提出的,其科学理论是通过使用一段标准DNA片段，对物种进行快速、准确的鉴定。2003年，Herbert等对动物界中11个门13320个物种对的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (COI)基因序列进行分析，发现该序列种间变异能较好地区分除刺胞动物门以外的物种。随后的研究表明，COI序列种间变异大而种内变异小，其DNA序列本身很少存在插入和缺失，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。 目前，推荐用于COI序列扩增的通用引物为LC01490和HC02198，但本发明人在研究中发现，通用引物LC01490和HC02198在蝰科蛇类物种鉴定中不能获得较好的扩增产物。


【发明内容】

[0005]针对现有技术存在的上述情况，本发明人研究设计了能扩增蝰科蛇类物种COI序列的引物，用于各种蝰科蛇类物种COI序列扩增，弥补COI序列通用引物在蛇类物种鉴定中的不足。本发明提供了蝰科蛇类物种COI序列扩增的PCR引物及其方法。本发明方法简便快捷、通用性好，能快速准确地扩增得到该蝰科蛇类物种的COI序列，为蝰科蛇类物种及来源于本科动物的药材的分子鉴定奠定了基础。
[0006]本发明提出了一对能用于扩增蝰蛇科物种COI基因的引物，所述引物为DKl-COl和DK1-C02，其序列为:
[0007]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0008]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0009]本发明还提出了一种扩增蝰蛇科物种COI基因的PCR方法，包括以下步骤:
[0010]I) DNA样本的提取；
[0011]2)用本发明引物进行PCR反应，PCR反应参数包括:93°C预变性5min，55°C 2min ；93°C变性30s，55。。复性45s，70。。延伸45s，35个循环;70°C延伸5min。所述引物DKl-COI和DK1-C02，其序列为:
[0012]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0013]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0014]3)电泳检测前述所得的扩增产物:在所述扩增产物的电泳图谱中，如果存在分子量为700bp的单一清晰DNA条带，则确定扩增成功，所得PCR产物可用于后续分析。
[0015]在本发明鉴定方法的步骤I)中，采用现有技术的试剂盒提取DNA的方法，不需要配制任何试剂，使得提取时间大大缩短，样本量只需30mg，可以提取所述蛇体任何组织的DNA。
[0016]本发明还提出一种试剂盒，用于所述扩增蝰蛇科物种COI基因的PCR方法中。该试剂盒包括:引物DKl-COl(1yM);引物DK1-C02 (10 μ M) ；2XTaq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括:Taq DNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各 500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl(10yM)，MgCl2 (3 μ Μ)等；灭菌双蒸水。
[0017]综上所述，本发明提供了蝰科蛇类物种COI基因扩增的引物及PCR方法和试剂盒，以各蝰科蛇类DNA为模板，能将该蝰科蛇类样本的COI基因高效、准确地扩增出来，为蝰科蛇类药材的分子鉴定奠定了基础。本发明具有简便快捷、DNA用量少、通用性好等特点，弥补了现有技术中COI序列通用引物(LC01490和HC02198)在蝰科蛇类基因扩增及药材鉴定中的不足。

【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为COI序列通用引物(LC01490和HC02198)扩增10种蛇类DNA模板电泳结果:1.尖吻蝮蛇2.山烙铁头蛇3.圆斑蝰蛇4.原矛头蝮蛇5.越南烙铁头蛇6.白唇竹叶青蛇7.福建竹叶青蛇8.云南竹叶青蛇9.冈氏竹叶青蛇10.短尾蝮蛇11.阴性对照(其它反应条件不变，水替代模板DNA) ；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、lOObp。
[0019]图2为按本专利所述的引物及方法扩增10种蛇类DNA模板电泳结果:1.阴性对照(其它反应条件不变，水替代模板DNA) 2.尖吻蝮蛇3.山烙铁头蛇4.圆斑蝰蛇5.原矛头蝮蛇6.越南烙铁头蛇7.白唇竹叶青蛇8.福建竹叶青蛇9.云南竹叶青蛇10.R氏竹叶青蛇11.短尾蝮蛇；MK.DNA分子量标准:从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、lOObp。

【具体实施方式】
[0020]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0021]1、材料
[0022]10份蝰蛇科原动物，其来源详见(表1)。全部样本均由华南濒危动物研究所张亮进行性状鉴定。
[0023]表1蜂科蛇类样本
[0024]

【权利要求】
1.一对扩增蝰科蛇类物种COI序列的引物，其特征在于，所述引物包括DKl-COl和DK1-C02，其序列为:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一种扩增蝰科蛇类物种COI序列的PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 1)DNA样本的提取； 2)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，获得扩增产物；所述PCR反应参数包括:.93°C预变性 5min, 55°C 2min ;93°C变性 30s, 55°C复性 45s，70°C延伸 45s，35 个循环；70°C延伸 5min ； .3)电泳检测前述所得的扩增产物:在所述扩增产物的电泳图谱中，如果存在分子量为.700bp的单一清晰DNA条带，则确定扩增成功，得到目标扩增产物，即COI基因片段。
3.一种用于扩增蝰科蛇类物种COI序列的PCR方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:10 μ M引物DKl-COl ;10yM$*DKl-C02 ；2XTaq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括:.0.1U/ μ L Taq DNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 500 μ Μ, 20 μ M Tris-HCl (ρΗ8.3)，.100μΜ KCl，3yM MgCl 2 ;灭菌双蒸水。
【文档编号】C12N15/10GK104164426SQ201410348913
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】晁志 申请人:晁志