一种快速培育转基因玉米自交系的方法
【专利摘要】本发明属于作物育种领域，具体为一种快速培育转基因玉米自交系的方法。该方法包括如下步骤：1)转基因基础材料组配：将转基因阳性材料与优良玉米自交系杂交；2)杂交诱导：利用诱导系与转基因基础材料进行杂交；3)单倍体鉴选：通过籽粒和田间植株鉴选单倍体植株；4)单倍体加倍：利用自然或人工化学加倍方法对单倍体植株进行加倍并自交；5)转基因DH系鉴定：对获得的DH系进行PCR水平检测，确认含有目标基因的转基因自交系。本发明方法大大缩短了转基因玉米自交系的培育过程。
【专利说明】一种快速培育转基因玉米自交系的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于作物育种领域，具体为一种快速培育转基因玉米自交系的方法。
【背景技术】
[0002]基因工程与转基因作为一种农作物遗传改良的新方法，极大地提供了育种工作质量和效率。由先正达公司开发的抗虫转基因玉米BT176作为世界首例转基因玉米商业化自1996年开始种植以来，转基因作物种植面积持续增加，从1996年的170万公顷增加到2013年的1.752亿公顷，18年中增加了 100倍以上，2013年仅转基因种子的全球市场价值就达到了 156亿美元，占全球450亿美元商业种子市场的35%。这一增长使得转基因技术以可观的利润成为现代农业史上应用最迅速的作物技术。目前，转基因作物主要集中在大豆、玉米、棉花等七大类农作物上。玉米是世界三大粮食作物之一，重要的粮、经、饲作物，2013年，全球转基因玉米种植面积为5740万公顷，占全球玉米总种植面积的32%。但我国还未种植转基因玉米，以棉花、木瓜为主。
[0003]针对保障食物安全和发展生物育种产业的战略需要，2008年国务院批准实施转基因生物新品种培育重大专项，最终目标是要培育一批抗病虫、抗逆、优质、高产、高效的重大转基因生物新品种，提高农业转基因生物研宄和产业化整体水平，为我国农业可持续发展提供强有力的科技支撑。这对于增强农业科技自主创新能力，提升我国生物育种水平，促进农业增效和农民增收，提高我国农业国际竞争力，具有重大战略意义。
[0004]转基因玉米新品种的培育是一个综合的系统工程，建立良好的受体系统是玉米遗传转化的重中之重，受植物遗传转化技术的限制，现有的遗传转化方法的转化效率不高，如玉米中应用最为广泛的农杆菌介导的幼胚遗传转化方法，由于基因型限制，绝大多数生产上主推的骨干自交系无法诱导出胚性愈伤组织，并且对农杆菌侵染的敏感性极低，因此无法直接用于玉米遗传转化。目前国内外应用广泛的玉米转基因受体基因型主要集中在H1-1I, A188、H99等少数几个材料上，这些材料含有控制胚性愈伤组织高诱导率、易感农杆菌的隐性基因，作为受体材料具有较高的遗传转化效率。然而，这几个易于转化的受体材料的农艺性状较差。因此，需利用转化获得的这几个少数转基因玉米受体材料与骨干玉米自交系进行回交转育，一般需回交6-7代，再自交3代以上，最终才能创制出具有优良农艺性状的、且导入外源基因的转基因玉米新自交系，这一漫长的育种过程极大地延缓了转基因玉米育种的研发速度。因此，建立一种快速培育转基因玉米自交系的方法成为加速转基因玉米新品种培育的助燃剂。
[0005]近年来，单倍体育种技术已经逐步成为我国玉米常规育种的关键性技术。双单倍体(doubled haploid，DH)技术是选育玉米自交系的一种最快、最简便、经济、实用和直接的方法。它的基本流程是以生物诱导的单倍体植株，经人工或自然加倍获得纯合的二倍体植株，再从中筛选新系。其主要特点是选系速度快，仅需2个世代即可获得稳定纯系(传统的自交系选育需经7代以上)。目前，已经逐步大规模应用于常规玉米自交系选育。而在转基因玉米自交系选育上还未曾尝试。基于转基因玉米育种的需要和单倍体育种技术的优势，将单倍体技术应用于转基因玉米自交系培育上，对于加速转基因玉米自交系的培育具有重要意义，具备很好的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种快速培育转基因玉米自交系的方法。
[0007]本发明所提供的一种快速培育转基因玉米自交系的方法，包括如下步骤:
[0008](I)转基因基础材料组配
[0009]利用杂交诱导单性生殖方法从中选育转基因玉米自交系的遗传基础材料可以是含有转入抗虫、抗除草剂等目标性状基因的杂交组合、杂交种(包括单交种、三交种、双交种)或各类群体(包括综合杂交种等)或由其衍生的F2、F3代群体等，可通过将含有目标转基因性状的种质与优良自交系、各类群体等材料在隔离条件下进行杂交获得。含目标转基因性状的种质可通过农杆菌介导法、基因枪法等获得。基础材料要具有高产、优质、抗病抗逆、综合农艺性状好等优良特性。
[0010]⑵杂交诱导
[0011]在隔离条件下，将组配的转基因基础材料和诱导系种植，转基因基础材料为100株，以4:1配播诱导系，通常选用Stock6、吉高诱3号、农大高诱系列等诱导系，尽量选用花期与基础材料相近的诱导系，或采取分2-3期播种等措施，确保二者花期相遇，顺利完成杂交。
[0012]诱导杂交授粉方式与常规杂交授粉相同。以被诱导转基因基础材料为母本，在转基因基础材料刚露出雌穗后，立即使用硫酸纸袋对雌穗人工套袋隔离，并在其抽出花丝长到5cm(或吐丝3天)左右后，以单倍体诱导系做父本，取其新鲜花粉(前一天套袋)进行授粉。极端高温天气时授粉时间在上午11:00前为好。杂交果穗成熟后收获并妥善保管。
[0013](3)单倍体鉴选
[0014]单倍体籽粒鉴定:秋天选择籽粒糊粉层为黑色或紫红色的玉米果穗进行收获，自然晾晒20-30天后进行脱粒。根据籽粒表型性状(籽粒顶部和胚芽颜色)对单倍体作初步鉴选，胚乳糊粉层着色(黑色、或紫红色)、胚盾状体无色(盾状体呈倒三角型，向内凹陷明显)的为拟单倍体籽粒。
[0015]如采用人工化学加倍方法可进行二次鉴定，在拟单倍体幼芽长至l_2cm时，淘汰胚根长且粗壮、长势强壮的幼芽，选择胚根纤细、长势弱小的幼芽。
[0016]单倍体田间确认:在田间，拟单倍体植株长到8-10叶期前后，依据植株ABPl紫色标记及形态学特征对单倍体进行鉴别。凡幼苗叶鞘和叶片为紫色、植株高大粗壮的植株均予以淘汰，而幼苗长势慢、株高低、叶片较少、狭窄、短且较上冲、叶色浅则可确认是单倍体植株，要进行加倍处理。
[0017](4)单倍体加倍
[0018]单倍体加倍有自然和人工加倍两种方法。
[0019]自然加倍率较低，一般在1%-5%之间，不同的基础材料、生态环境、种植时间均可对自然恢复率有影响。对于散粉率较高的单倍体基因型可依靠育性的自然恢复就可实现自交结实。选择隔离条件好、地势平坦，肥力较好地块种植单倍体，及时浇水并进行田间精细管理。当单倍体植株雄穗有花药外露并有明显花粉产生时，取其花药进行精细自交授粉，授粉后严格封闭好套雌穗的袋，避免外来花粉污染。
[0020]对自然加倍率很低的单倍体基因型必须进行人工加倍处理。主要加倍方法有浸种法、浸根法、浸芽法、注射法、田间喷除草剂等。这里介绍浸(切)芽法和浸根法。
[0021]浸(切)芽法即用秋水仙素溶液浸泡切过的幼芽的方法。当单倍体子粒萌发的幼芽长到2?3cm时，人工切去胚芽鞘尖端l_2mm左右，用秋水仙素0.06%和二甲基亚砜5%的混合溶液浸泡芽9小时，再用清水清洗1.5小时，放入发芽盘中进行缓苗处理，缓苗2天后，选择隔离条件好、地势平坦，肥力较好地块进行移苗，按照株距20cm进行移栽，及时浇水并进行田间精细管理。
[0022]浸根法即用秋水仙素溶液浸泡单倍体幼苗根。可在幼芽期或幼苗期进行，将3叶期的单倍体幼苗根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24小时，用清水冲洗处理后，幼苗移栽于隔离条件好、地势平坦，肥力较好地块，按照株距20cm进行移栽，及时浇水并进行田间精细管理。
[0023]在授粉时，及时给雌穗套上小袋，仔细并反复观察每一个单株的雄穗，及时取花粉，发现雄穗散粉，立刻授粉(以上午9点-12点为宜)。一般每个单株授粉2次为宜，花粉量大的I次即可。
[0024](5)转基因DH系鉴定
[0025]自交果穗成熟后或授粉后35d左右，收获籽粒。下季度或在温室大棚中将获得的双单倍体子粒精密播种，如果植株长势整齐一致，子粒无分离，符合自交系性状特征，可确认为纯合的DH自交系。
[0026]生长期间，取每份DH系新鲜叶片lOOmg，剪碎放入2ml的EP管中，利用高通量组织研磨机进行研磨，然后使用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取样本的DNA，用10ul的ddH20溶解，_20°C保存备用。利用Nanodrop2000紫外分光光度计测定样板的DNA浓度，依据测得的浓度将DNA溶液稀释到25ng/ μ L_50ng/ μ L，_20°C保存。
[0027]将稀释后的样本DNA、阳性样本、阴性对照、空白对照进行PCR扩增。PCR反应体系25 μ L，包括 10XPCR 缓冲液(含 Mg2+)2.5 yL，2.5mmol.L-1 dNTPs2yL^ft dNTP 终浓度为 200 μ Lmol.L-l)，10 μ mo 1.L-1 引物各 0.5 μ L (终浓度为 200nmol.L_l)，5U.μ L-1rTaqDNA聚合酶0.125 μ L，模板DNA 2 μ L(10ng)，加超纯水至终体积为25 μ L。
[0028]PCR反应程序:94°C变性5min ;进行35次循环扩增反应(94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s。根据不同目标性状基因的引物序列的Tm值，可将PCR反应的退火温度适当改变)；72°C延伸lOmin。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像照相观察，如检测到目的PCR扩增产物条带即可确定为阳性转基因自交系。
[0029]当前，转基因生物新品种培育重大专项正在实施进程中，目标是鉴定评价出一批目标性状突出的转基因新种质。采用传统的回交转育、二环选系法获得纯合转基因自交系一般需要7代以上，且每代需进行大量的分子检测，因此如何快速回交转育从而选育出纯合转基因自交系迫在眉睫。本发明可以应用于快速获得转基因自交系，仅需2个世代。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1鉴选的转M0N89034基因的拟单倍体籽粒
[0031]图2 M0N89034基因的PCR检测
[0032]图3 M0N89034基因的蛋白水平检测
[0033]I:DH7 ；2:DH9 ；3:DH15 ；4:DH17
[0034]图4获得的转M0N89034基因的自交系果穗
[0035]左为DH7;右为 DH9
[0036]下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0038]实施例1:
[0039]1、供试材料
[0040]以优良玉米自交系吉201000与含M0N89034基因的材料进行杂交获得Fl。第二生长季以孤雌生殖诱导系农大高诱3号(由中国农业大学提供)为父本，以转基因杂交组合Fl植株为母本进行杂交，秋季对收获的Fl果穗籽粒鉴选单倍体，鉴定出拟单倍体籽粒226粒(图1)。
[0041]2、单倍体加倍
[0042]采用化学加倍的浸芽方法，药剂使用秋水仙素(Colchicine，COL)和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，方法同前，获得拟单倍体幼苗205株，并移栽到隔离的田间，通过田间鉴定确定准单倍体植株190株，夏季进行自交授粉40穗，秋季收获自交果穗30穗，籽粒数在3-50粒之间，并脱粒保存。
[0043]3、PCR 检测
[0044]选取获得籽粒较多的其中4份DH系(DH7、DH9、DH15、DH17)在温室内进行种植，在五叶期时，取叶片进行目的基因检测。检测方法按中华人民共和国国家标准(农业部1861号公告-4-2012)【转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米89034及其衍生品种定性方法】的规定执行。
[0045]结果表明:DH7和DH9检测到目标基因扩增产物条带，而DH15和DH17未检测到目标基因扩增产物条带。
[0046]I:Marker DL2000 ;2:空白对照；3:阳性对照；4:阴性对照；5:DH7 ；6:DH9 ；7:DH15 ；8:DH17
[0047]4、蛋白水平表达检测
[0048]取叶片进行PCR检测的同时，另取一部分叶片进行蛋白水平表达检测。蛋白水平表达检测采用转基因检测试纸条，选用美国Envirologix公司的AS 003 BG, LS，检测项目CrylAb0
[0049](I)提取叶片组织方法
[0050]a)用离线管盖切下2层叶片，用锥放置管底部；b)用锥研磨20-30秒；c)吸取
0.5ml提取液倒入离心管；d)重复研磨。
[0051](2)试纸条检测方法
[0052]a)将试纸条放置研磨液体中；b)在5分钟以内，出现控制线表明这个试纸是有功能的，如果样品含有CrylAb基因，第2条线(检测线)将在5分钟之内出现在控制线和保护带之间，任何清晰可识别的粉色检测线都将被认为是阳性。
[0053]结果表明(图3):检测结果与分子检测结果一致，DH7和DH9出现检测线，而DH15和DHl7未出现检测线。
[0054]由此，确认DH7和DH9为转基因自交(DH)系，成熟后收获其果穗(图4)。
[0055]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种快速培育转基因玉米自交系的方法，包括如下步骤: (1)转基因基础材料组配 (2)杂交诱导 (3)单倍体鉴选 (4)单倍体加倍 (5)转基因DH系鉴定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的材料组配过程为，利用杂交诱导单性生殖方法从中选育转基因玉米自交系的遗传基础材料可以是含有转入抗虫、抗除草剂等目标性状基因的杂交组合、杂交种(包括单交种、三交种、双交种)或各类群体(包括综合杂交种等)或由其衍生的F2、F3代群体等，可通过将含有目标转基因性状的种质与优良自交系、各类群体等材料在隔离条件下进行杂交获得。含目标转基因性状的种质可通过农杆菌介导法、基因枪法等获得。基础材料要具有高产、优质、抗病抗逆、综合农艺性状好等优良特性。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的杂交诱导过程为:在隔离条件下，将组配的转基因基础材料和诱导系种植，转基因基础材料100株，以4: I配播诱导系，选用Stock6、吉高诱3号、农大高诱系列等诱导系，尽量选用花期与基础材料相近的诱导系，或采取分2-3期播种措施，确保二者花期相遇，顺利完成杂交； 诱导杂交授粉方式与常规杂交授粉相同。以被诱导转基因基础材料为母本，在转基因基础材料刚露出雌穗后，立即使用硫酸纸袋对雌穗人工套袋隔离，并在其抽出花丝长到5cm(或吐丝3天)左右后，以单倍体诱导系做父本，取其新鲜花粉(前一天套袋)进行授粉。极端高温天气时授粉时间在上午11:00前为好。杂交果穗成熟后收获并妥善保管。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:单倍体籽粒鉴定:秋天选择籽粒糊粉层为黑色或紫红色的玉米果穗进行收获，自然晾晒20-30天后进行脱粒。根据籽粒表型性状(籽粒顶部和胚芽颜色)对单倍体作初步鉴选，胚乳糊粉层着色(黑色、或紫红色)、胚盾状体无色(盾状体呈倒三角型，向内凹陷明显)的为拟单倍体籽粒； 如采用人工化学加倍方法可进行二次鉴定，在拟单倍体幼芽长至l_2cm时，淘汰胚根长且粗壮、长势强壮的幼芽，选择胚根纤细、长势弱小的幼芽； 单倍体田间确认:在田间，拟单倍体植株长到8-10叶期前后，依据植株ABPl紫色标记及形态学特征对单倍体进行鉴别。凡幼苗叶鞘和叶片为紫色、植株高大粗壮的植株均予以淘汰，而幼苗长势慢、株高低、叶片较少、狭窄、短且较上冲、叶色浅则可确认是单倍体植株，要进行自交授粉处理。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:采用自然加倍或以浸(切)芽法为主的人工化学加倍。 不同的基础材料、生态环境、种植时间均可对自然恢复率有影响。对于散粉率较高的单倍体基因型可依靠育性的自然恢复就可实现自交结实。选择隔离条件好、地势平坦，肥力较好地块种植单倍体，及时浇水并进行田间精细管理。当单倍体植株雄穗有花药外露并有明显花粉产生时，取其花药进行精细自交授粉，授粉后严格封闭好套雌穗的袋，避免外来花粉污染。 对自然加倍率很低的单倍体基因型必须进行人工加倍处理。主要加倍方法有浸种法、浸根法、浸芽法、注射法、田间喷除草剂等。这里介绍浸(切)芽法和浸根法。 浸(切)芽法即用秋水仙素溶液浸泡切过的幼芽的方法。当单倍体子粒萌发的幼芽长到2?3cm时，人工切去胚芽鞘尖端l_2mm左右，用秋水仙素0.06%和二甲基亚砜5%的混合溶液浸泡芽9小时，再用清水清洗1.5小时，放入发芽盘中进行缓苗处理，缓苗2天后，选择隔离条件好、地势平坦，肥力较好地块进行移苗，按照株距20cm进行移栽，及时浇水并进行田间精细管理。 浸根法即用秋水仙素溶液浸泡单倍体幼苗根。可在幼芽期或幼苗期进行，将3叶期的单倍体幼苗根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24小时，用清水冲洗处理后，幼苗移栽于隔离条件好、地势平坦，肥力较好地块，按照株距20cm进行移栽，及时浇水并进行田间精细管理。 在授粉时，及时给单倍体雌穗套上小袋，仔细并反复观察每一个单株的雄穗，及时取花粉，发现雄穗散粉，立刻授粉(以上午9点-12点为宜)。一般每个单株授粉2次为宜，花粉量大的I次即可。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于:自交果穗成熟后或授粉后35d左右，收获籽粒。下季度在温室大棚中将获得的双单倍体子粒精密播种，如果植株长势整齐一致，子粒无分离，符合自交系性状特征，可确认为纯合的DH自交系； 生长期间，取每份DH系新鲜叶片lOOmg，剪碎放入2ml的EP管中，利用高通量组织研磨机进行研磨，然后使用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取样本的DNA，用10ul的ddH20溶解，-20°C保存备用。利用NanOdrOp2000紫外分光光度计测定样板的DNA浓度，依据测得的浓度将DNA溶液稀释到25ng/ μ L_50ng/ μ L，_20°C保存； 将稀释后的样本DNA、阳性样本、阴性对照、空白对照进行PCR扩增。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于:PCR反应体系25μ L，包括10XPCR缓冲液(含 Mg2+) 2.5 μ L，2.5_1.L-1dNTPs 2 μ L (每种 dNTP 终浓度为 200 μ Lmol.L_l)，10 μ mol.L-1 引物各 0.5 μ L (终浓度为 200nmol.L_l)，5U.μ L-1rTaq DNA 聚合酶0.125 μ L，模板DNA 2 μ L(10ng)，加超纯水至终体积为25 μ L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于:PCR反应程序:94°C变性5min;进行35次循环扩增反应(94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s。根据不同目标性状基因的引物序列的Tm值，可将PCR反应的退火温度适当改变)；72°C延伸lOmin。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像照相观察，如检测到目的PCR扩增产物条带即可确定为阳性转基因自交系。
【文档编号】C12Q1/68GK104488694SQ201410646659
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】刘文国, 路明, 岳尧海, 张志军, 王敏, 刘宏伟, 周旭东, 赵万庆, 张建新, 马英杰, 张佩, 李岩, 王绍平 申请人:吉林省农业科学院, 吉林吉农高新技术发展股份有限公司