由培养的肌肉细胞制成的干燥的食物制品的制作方法

本专利申请要求2014年2月5日递交的美国临时专利申请No.61/936,064(名称为“DRIED FOOD PRODUCTS FORMED FROM CULTURED MUSCLE CELLS”)的优先权。

本专利申请还可与以下一个或多个(或全部)文件有关：2014年9月15日递交的美国专利申请No.14/486,850(“EDIBLE AND ANIMAL-PRODUCT-FREE MICROCARRIERS FOR ENGINEERED MEAT”)；2013年11月27日递交的名称为“ENGINEERED COMESTIBLE MEAT”的美国专利申请No.14/092,801(其为2012年7月26日递交的美国专利U.S.8,703,216的继续申请)；以及2013年9月9日递交的名称为“SPHERICAL MULTICELLULAR AGGREGATES WITH ENDOGENOUS EXTRACELLULAR MATRIX”的PCT申请No.PCT/US2013/058684。这些专利和专利申请分别通过引用方式全部并入本文中。

援引加入

在本说明书中提到的全部出版物和专利申请在此以相同的程度通过引用方式全部并入本文中，如同单独的出版物或专利申请分别被明确地且单独地被指出以通过引用方式并入。

技术领域

文中所描述的为由培养的细胞和载体(例如水凝胶)的脱水混合物制成的可食用的(例如，适合人类食用)食物制品、以及制作和使用该可食用的食物制品以制成工程肉类制品的方法。

背景技术：

人体需要用以生长和维持的蛋白质。除了水之外，蛋白质是身体内最丰富的分子。根据美国和加拿大的膳食参考摄入量指南(Dietary Reference Intake guidelines)，年龄为19-70岁的女性需要每天消耗46克蛋白质，而年龄为19-70岁的男性需要每天消耗56克蛋白质以避免缺乏。然而，该推荐量适于没有疾病的久坐不动的人。蛋白质缺乏可导致智力下降或智力迟钝以及带来诸如夸希奥科病(kwashiorkor)的疾病的流行。在发展中国家、尤其在受战争、饥荒和人口过剩影响的国家中，蛋白质缺乏是一个严重的问题。蛋白质的动物来源，诸如肉类，经常是以足够比例充分补充全部的必需氨基酸的来源。

肉类的营养好处由于潜在相关的环境恶化而减弱。根据联合国粮农组织(FAO)的标题为畜牧业的长期阴影-环境问题和选择(Livestock's Long Shadow--Environmental Issues and Options)的报告(2006)，畜牧业是造成世界范围的环境恶化的最大因素之一，且现代化的饲养动物用于食物的做法普遍地造成空气污染和水污染、土地退化、气候变化和生物多样性丧失。肉类和蛋白质的其他动物来源的生产和消耗也与雨林的消失和物种灭绝有关。因此，需要一种对于由活的动物生产的肉类的替代方案的需求的解决方案。

食物，诸如薄片(例如薯片、松脆物、泡芙、饼干、肉干等)，在美国是一种很受欢迎的小吃食物。可购买到的薄片通常包含高含量的脂肪和钠，暗示着高的热量摄取。过度消耗可引起增加的健康风险，诸如高血压。例如，马铃薯薄片包含高热值，通常每盎司150-160卡路里(其中的90-99卡路里来自脂肪)。被宣传作为对于传统的油炸薄片的更健康的替代者的烘焙的马铃薯薄片，通常包含120卡路里，在相同的食用分量下其中的18卡路里来自脂肪。当与消极的生活方式结合时，高的热量摄取可造成肥胖、高血压和外周动脉疾病。另外，传统的马铃薯薄片通常包含基于2000卡路里的饮食其量在日常推荐值的7％至8％的范围内的高含量的钠；考虑到一盎司一般由不到15个薄片构成，这是令人吃惊的量。据报道，高含量的钠造成诸如高血压的症状的发生，其可引起增加的心脏病的风险。油炸马铃薯薄片经常包含高含量的脂肪和饱和脂肪，每食用分量10克至11克的脂肪，其中3克为饱和脂肪(基于2000卡路里的饮食占每日推荐值的15％至17％)。高的脂肪含量可造成严重的健康风险，这是因为高的脂肪摄取可导致形成动脉斑块，增加了心脏病和中风的倾向。类似地，在正常的基础上消耗过量的脂肪可增加糖尿病和肥胖的风险。

需要一种小吃食物，尤其是可类似广泛流行的薄片，即高蛋白、高纤维和高钙且低脂肪的小吃食物。尽管在过去已经提出了所谓的“肉类薄片”，但这类制品已经被证实是昂贵的、缺乏味道且潜在地高蛋白质也具有高的钠和脂肪，这阻止这些制品成为传统的薄片的有效替代者。还重要的是，这类“肉类薄片”已经以与大多数可购买的肉类相同的方式由长大的且被屠宰的动物制成。如上所提到的，这不仅在环境上存在问题，而且对于消费者可引起道德和伦理上的问题。

例如，与马铃薯薄片类似的或者与其他基于碳水化合物的小吃类似的基于松脆的肉类(crisp meat)的小吃，例如在美国专利No.3,497,363中进行描述，其提出了一种通过深油炸冷冻干燥的肉片形成的松脆的油炸肉类小吃。该冷冻干燥据说对于该薄片的松脆的、可咀嚼的性质是关键的。冷冻干燥在商业化规模上会是相当贵的，且深油炸增加了薄片的脂肪含量，导致昂贵的、高脂肪的小吃。美国专利No.3,512,993提出了将肉类或海鲜与水以及马铃薯和玉米淀粉的50/50混合物相混合，以形成在压力下烹饪且切片的面团。所得到的切片在食用之前被干燥和深油炸。油炸使该薄片具有薄酥的质地，而不是干燥的薄片的“坚硬、角质的质地”。该制品具有高含量的脂肪(具有所提出的30％-40％的脂肪含量)和淀粉，这使得该薄片对于那些控制来自小吃食物的热量和碳水化合物摄取的人们是不太理想的。其他人已经提出了用于干燥香肠切片以制作小吃食物而不必油炸该切片的方法。例如，美国专利No.6,383,549和美国专利申请公布2003/0113433和2004/0039727提出了这类方法。然而，多数这些方法不能够很好地适于廉价的小吃食物的商业化规模的生产且受限于家庭规模的一批生产量或昂贵的特色产品。

文中描述解决了上述的缺陷的可制成薄片的脱水食物。

技术实现要素：

本发明涉及食物制品，其可以由与脱水的水凝胶(例如，植物源多糖或基于多糖的水凝胶，例如果胶)组合(例如，混合)的培养的细胞制成。所述食物制品可制成任何传统的干燥的美食制品，包括但不限于薯片、饼干、棒、麦片、面团、肉干等。尽管文中描述的实施例阐述了食物制品以及将所制成的食物制品制成与传统薯片类似的薄片的方法，但是文中描述的本发明还可应用于制作其他食物制品。所得到的制品可是小吃食物，诸如薄片，其在对动物无害的情况下制作，且具有高蛋白和低脂肪。所述食物制品可提供健康的、无麸质的富含蛋白质、纤维和钙的小吃，且可类似传统薯片的质地(例如，松脆性和/或易碎性)，但没有被油炸或烘焙，从而去除了脂肪，尤其是饱和脂肪。文中还描述了由培养的细胞(例如，来自动物的肌肉细胞)制作诸如薄片的食物制品的方法。

例如，文中描述了可食用的、脱水的食物制品，其包括培养的动物肌肉细胞以及香料，所述培养的动物肌肉细胞与植物源水凝胶组合，其中所述培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶被制成脱水的材料片。

通常，培养的细胞与水凝胶混合，然后进行凝固或胶化和脱水。混合物可是均质的(例如，比较均一的)或非均一的，如细胞可结块。所述细胞当混合时可是非附着的，或者它们可是成团的，例如以小的团簇或块。因此，所述混合物可包括在水凝胶中分布的各个细胞和/或细胞的团簇，该水凝胶然后进行脱水。在最终的食物制品中，所述培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶可分布在整个材料片中。

所述香料可被涂覆在食物制品上和/或在食物制品内(包含在培养的细胞和水凝胶的混合物内)。所述香料可在脱水之前、脱水期间或脱水之后添加。

例如，文中描述了诸如薄片的小吃食物。可食用的小吃薄片可包括：培养的动物肌肉细胞，所述培养的动物肌肉细胞与植物源水凝胶组合；和香料，其中，所述培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶被制成脱水的材料片。

可使用任何合适的培养的动物肌肉细胞。例如，培养的肌肉细胞(肌细胞)可源自以下中的一种或多种：牛肉、小牛肉、猪肉、鸡肉或鱼肉。所述培养的动物肌肉细胞可包括以下中的一种或多种：骨骼肌细胞、平滑肌细胞和心肌细胞(或其混合物)。所述培养的细胞可全部是肌细胞或大多数是培养的肌细胞。例如，食物制品的细胞组分可具有大于70％的肌细胞、大于80％的肌细胞、大于85％的肌细胞、大于90％的肌细胞、大于95％的肌细胞、大于98％的肌细胞、大于99％的肌细胞等。

可使用任何合适的水凝胶，尤其是植物源多糖。例如，所述植物源多糖可包括果胶。所述植物源多糖(基于多糖的水凝胶)可为低甲基(LM)酯化果胶。通常，植物源水凝胶为起源于非动物来源的水凝胶。例如，植物源水凝胶可从植物来源中提取、纯化或其他方式从植物来源中获取。植物源水凝胶也可为被识别为植物的天然产物的水凝胶。尽管植物源水凝胶可被识别来自植物来源，但在文中所描述的食物制品中所使用的植物源水凝胶的直接来源可是合成的，例如植物源水凝胶可是合成的或精炼的。在文中描述的任何植物源水凝胶也可被非植物起源的水凝胶所替代和/或与非植物起源的水凝胶混合。

例如，如文中描述的可食用的、脱水的食物制品可包括：培养的动物肌肉细胞，所述培养的动物肌肉细胞与植物源水凝胶组合；以及(可选地)香料；其中，所述培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶被制成脱水的材料片。

在食物制品中，所述培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶可分布在整个材料片中，使得穿过材料片的截面具有离散的肌肉细胞(培养的肌肉细胞)，该肌肉细胞可具有约2μm至50μm(例如2μm至40μm、2μm至35μm、5μm至50μm、5μm至40μm、5μm至30μm等)的直径且可分布在整个截面中。所述培养的肌肉细胞可通过形态学进行识别，以及通过其肌肉蛋白的标记物的表达进行识别，该标记物的表达在超微结构上可见。例如，培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶可分布在整个材料片中，使得穿过材料片的截面具有脱水的培养的肌肉细胞的图案。所述培养的肌肉细胞可是相对完整的，即使在脱水后，且作为培养的细胞其起源可通过一个或多个标记物，例如通过识别在脱水的培养的肌肉细胞内的诸如肌动蛋白和肌球蛋白的肌肉蛋白的图案得以证实。因此，甚至在脱水的食物制品中，穿过食物制品的截面将呈现出由于使用培养的细胞和植物源的混合物所产生的独特的图案

文中描述的任何食物制品(“薄片”)还可包括可食用的微载体，培养的动物肌肉细胞生长在该微载体上。

在食物制品的背景下，文中所用的术语“脱水”或“脱水的”可指去除食物制品中的水，尤其与非脱水形式的食物制品相比去除食物制品中的大部分水，使得食物制品的含水量小于例如70％(例如小于65％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％、小于95％等)。

在一些变型中，构造成小吃薄片的可食用的、脱水的食物制品包括：培养的动物肌肉细胞，所述培养的动物肌肉细胞与植物源水凝胶(例如多糖)组合；和香料，其中，所述培养的动物肌肉细胞和植物源水凝胶被布置成脱水的材料片，其中分布在整个该材料片中的肌肉蛋白的团簇具有在2μm和50μm(例如2μm至40μm、2μm至30μm、2μm至20μm、5μm至50μm、5μm至40μm、5μm至30μm等)之间的直径。

文中所描述的可食用的食物制品还可被制成或成形为容易消耗的形式，且可类似于传统的小吃食物(例如马铃薯薄片、条状物、脆饼干(pretzel)等)。例如，厚度(或高度)可通常比诸如宽度和长度的表面尺寸(例如，阔度、直径等)小得多。在一些变型中，薄片的可食用主体的直径(例如，表面直径/片直径)可大于其厚度的十倍。

文中还描述了制作可食用的食物制品的方法。例如，文中描述了制作可食用的食物制品的方法，所述方法包括将培养的肌肉细胞和植物源水凝胶组合以形成混合物；以及对所述混合物脱水以制成可食用的材料片。

例如，所述方法可用于制作可食用的小吃食物。例如，制作小吃薄片的方法可包括：将培养的肌肉细胞与植物源水凝胶组合以形成混合物；以及对所述混合物脱水以制成薄片。

这些方法的任一种方法还可包括添加香料。所述香料可在混合步骤期间加入，或者可在混合步骤之前与任何组分(例如，培养的细胞)混合。例如，组合步骤可包括将香料添加到肌肉细胞和植物源水凝胶的混合物中。可在混合之后加入所述香料。例如，可在脱水前、脱水期间、或脱水后加入所述香料。可将香料涂覆到食物制品上。

通常，组合步骤可包括将培养的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、和心肌细胞中的一者或多者与植物源水凝胶组合以形成混合物。如上所述，可包括任何合适的细胞类型。

在一些变型中，额外的组分也可与细胞和水凝胶混合。例如，组合可包括将培养的肌肉细胞和植物源水凝胶与氯化钙溶液组合。氯化钙溶液可有助于使水凝胶胶化，还可将钙加入到食物制品中，这可是有益的。例如，组合可包括将培养的肌肉细胞与植物源水凝胶、香料和氯化钙溶液组合。

这些方法的任一种方法可包括如下步骤：从组织培养室中收获培养的细胞，和在与植物源水凝胶组合之前洗涤所述细胞。所述培养的细胞可通过反复地冲洗和旋转(例如，离心)进行洗涤以将该培养的细胞团块化且去除该洗涤溶液。在一些变型中，可采集所述细胞和/或在包括香料的溶液中冲洗所述细胞。

在文中所述的任一方法中，在混合前一刻，细胞可以是活的、死的或干燥的。因此，所述洗涤和/或混合可减小细胞活性，而不影响最终的食物制品的品质(例如，味道、质地、营养含量)。然而，在一些变型中，所述细胞可直到脱水都保持存活。

文中描述的任一方法还可包括在脱水之前将混合物散布到表面(例如，模具)上且使得植物源水凝胶进行胶化。该脱水步骤可在同一表面(例如，模具)上执行或者可将它们转移至不同的表面上。可使用任何合适的模具(包括涂覆的模具)。例如，模具可以为平坦的表面(例如，箔、聚合物、纸等)。在一些变型中，模具可适于与脱水机一起使用。例如，模具可是热导的和/或通风的或透水的。

在一些变型中，制作小吃薄片的方法可包括：将培养的肌肉细胞、植物源水凝胶和香料组合以形成混合物；以及使混合物脱水以制成脆性的(例如，易碎的)薄片。

例如，制作可食用的食物制品的方法可包括：将培养的肌肉细胞与植物源水凝胶组合以形成混合物；以及使混合物脱水以制成可食用的材料片。所述植物源水凝胶可构造成可食用的微载体(其也可包括多肽，该多肽包括细胞附着基序)，培养的肌肉细胞生长在可食用的微载体上。可替选地或附加地，在一些变型中，组合包括将在可食用的微载体上生长的培养的肌肉细胞与植物源水凝胶组合以形成混合物。

组合可包括将培养的肌肉细胞与植物源水凝胶以及氯化钙溶液组合，且使植物源水凝胶凝固(例如，胶化)。这些方法中的任一方法可包括在脱水之前将混合物散布(例如，倾倒、涂覆、喷洒等)在表面上且使植物源水凝胶进行胶化。

另外，在这些方法中的任一方法中，脱水可包括使混合物脱水以制成脆性的(例如，易碎的)薄片。

例如，文中描述了将可食用的食物制品制成小吃薄片的方法，所述方法包括：将培养的肌肉细胞与植物源水凝胶组合以形成混合物；将所述混合物以层的形式散布在表面上；使所述混合物凝固；和使所述混合物脱水以制成薄片。

附图说明

尤其在下面的权利要求中提出本发明的新颖特征。通过参照下面的阐述了示例性实施方式的详细描述和附图，将更好的理解本发明的特征和优点，在该示例性实施方式中利用本发明的原理，在附图中：

图1A至图1D示出可组合以制作文中描述的食物制品的组分。图1A示出培养的肌肉细胞的团块(近似5亿个细胞)，其在图1B中更详细地示出。图1C示出调味的蔬菜汤(包括香料)，图1D示出4％的果胶溶液。

图2A和图2B示出构造成薄片的食物制品的形成。在图2A中，食物制品通过将在图1A至图1D中示出的组分以及氯化钙溶液组合而制成；该混合物被散布到模具上、进行胶化、然后脱水。图2B示出所得到的脱水的食物制品。

图3A1和图3A2分别示出如在文中所描述的构造为薄片的食物制品的一个构型的俯视图和侧视图。图3B1和图3B2分别示出构造为卵形薄片的食物制品的另一构型的俯视图和侧视图。图3C1和图3C2分别示出构造为薄的三角形薄片的食物制品的另一构型的俯视图和侧视图。

图4示出穿过如在文中所述的脱水的薄片的横截面。所述截面已经使用抗α平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体进行染色。所述SMA呈现为较暗的、有点圆形的(细胞状的)形状。该组织学表明在制成薄片的培养的细胞内的肌肉蛋白(例如肌动蛋白)的特征分布，其示出与基于动物的水凝胶的混合的脱水的培养的肌肉细胞的图案。

图5为示出如文中所述的干燥的食物制品(薄片)的一个实施例的组成分析的表，其示出高百分含量(例如，大于50％)的蛋白质。该组合还可指出基于动物的水凝胶的存在，以及示出在该实施例中，对于脱水的食物制品的主体，脱水的食物制品的含水量小于5％(例如，在该实施例中为4.01％)。

具体实施方式

通常，文中描述了由培养的细胞、尤其是体外生长的培养的肌肉细胞(肌细胞)制成、而不需要另外处理起源的动物的食物制品。所述培养的细胞可使用不起源于动物来源的(例如植物源的、酵母源的、单细胞源的等)培养基进行生长。另外，文中描述的食物制品可通过将培养的细胞与水凝胶组合以形成混合物、使混合物胶化、以及使所得到的混合物脱水以形成可食用的食物制品来制作。可食用的食物制品的形状和/或味道可被操控以确定所制作的食物制品的类型，包括薄片、饼干、棒、麦片、面团等。可在将培养的细胞和水凝胶组合和脱水之前、期间、或之后加入一种或多种香料和/或强化剂。

通常，可使用任何合适的培养细胞的方法，包括在表面、溶液、生物反应器等上培养。培养的细胞典型地为肌肉细胞，诸如非人类肌细胞，但是可使用其他细胞类型。细胞可起源于任何合适的来源。例如，合适的细胞可源自哺乳动物，诸如羚羊、熊、海狸、野牛、公猪(boar)、骆驼、北美驯鹿、牛、鹿、大象、麋鹿(elk)、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、北山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、驼鹿、野猪(peccary)、猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、牦牛和斑马、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自鸟类，诸如鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自爬行动物，诸如龟、蛇、鳄鱼和短吻鳄、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自鱼类，诸如凤尾鱼、鲈鱼(bass)、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼(cod)、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、枪鱼、橙连鳍鲑(orange roughy)、河鲈(perch)、梭子鱼、鳕鱼(pollock)、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎鱼(sole)、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼和白斑鱼、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自甲壳动物，诸如蟹、小龙虾、龙虾、对虾和小虾、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自软体动物，如鲍鱼、蛤、海螺、贻贝、牡蛎、扇贝和蜗牛、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自头足类动物，如乌贼、章鱼和鱿鱼、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自昆虫类，如蚂蚁、蜜蜂、甲壳虫、蝴蝶、蟑螂、蟋蟀、豆娘(damselfly)、蜻蜓(dragonfly)、蠼螋、跳蚤、苍蝇、蚱蜢、螳螂、蜉蝣、飞蛾、蠹虫、白蚁、黄蜂、或其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自非节肢动物无脊椎动物(例如蠕虫)，诸如扁虫、绦虫、吸虫、线虫、蛔虫、钩虫、环节蠕虫(例如蚯蚓、环节虫等)、或其组合。培养的细胞可以是原生的或改性的(例如，转基因的)。

通常，培养的细胞可生长至足够的密度、收获、然后在与食物制品混合物的其他组分(包括水凝胶)组合之前进行洗涤。洗涤可去除培养基，且可在水中(包括缓冲溶液，诸如PBS)进行洗涤。培养的细胞可反复地进行团块化(例如，通过离心)且冲洗以洗涤。在一些变型中，可利用微载体培养细胞，尤其利用可食用的微载体培养细胞。如将在下文中更详细地描述的，所述可食用的微载体可为可食用的植物源多糖，该植物源多糖还可包括多肽，该多肽包括细胞附着基序。用于不用可食用的微载体生长的细胞的植物源水凝胶也可与在如文中所述的可食用的微载体上生长的细胞组合使用；可替选地，在一些变型中，没有添加另外的水凝胶，且仅仅可食用的微载体和细胞可用于制作薄片。

如上所述，可使用任何合适的水凝胶。通常，水凝胶必须是可食用的(例如，对于人类消耗是安全的)。所述水凝胶可包括能够交联的多糖，诸如果胶。例如，可使用的一类多糖为低甲基(LM)酯化果胶(已经在食物中使用的丰富的植物衍生物)。

文中描述的任何食物制品可被称为干燥的食物制品或脱水的食物制品。

文中描述的任何食物制品可包括一种或多种香料。术语“香料”可指天然品种和人工品种两者。这用于包括“天然香料”，例如由美国联邦法规(U.S.Code of Federal Regulations)的第21篇所限定的“天然香料”，即精油、油树脂、香精或提取物、蛋白水解物、馏出物、或者任何烧烤、加热或酶解的产物，其包含源自香辛料、水果或果汁、蔬菜或蔬菜汁、可食用酵母、药草、树皮、芽、根、叶片或植物的任何其他可食用部分、肉类、海鲜、家禽、蛋、奶制品、或其发酵产物的调味成分，其在食物中的主要功能是调味而不是营养(21CFR101.22)。

香料还可包括“人工香料”，尤其是不一定满足上述的规范的天然香料的化学合成的化合物。人工香料可包括在“天然香料”中发现的化学化合物。

另外，“香料”还可是用以表示赋予味道的试剂、调味芳香剂和感觉因子的一般术语。味道是通过舌头上的受体而处理的感觉，且通常包括咸的、甜的、酸的和苦的味道。调味芳香剂是那些在咬、咀嚼、喝、以及吞咽食物时发出的调味挥发物，且通过嗅觉受体来感觉。调味语言中的感觉因子描述了在口中、舌头上、或者在鼻腔通道中(或者在口腔/鼻腔中的任何地方)感知到的感觉。这些感觉可是独立的且与咸的、甜的、酸的和苦的味道不同，且与通过嗅觉受体感知到的无数调味芳香剂不同。产生这些感觉的化合物在挥发性上是变化的，但是许多化合物易受气相转移的影响。这类感觉因子包括烟味的辛辣、水果的涩味、薄荷的凉爽、或者辣椒的热辣。更具体地，香料可增强或改变物品的味道或者气味，或者味道和气味两者。该变化可以增强所期望的味道或香味，或者掩盖不期望的味道或气味。应意识到，在多数应用中，香料是无毒的且可摄取的。

香料可包括调味芳香剂，但是香料的一些组分并不具有嗅觉刺激性能。例如，包括人工甜味剂的调味品、一些香辛料和佐料，尽管缺乏嗅觉刺激性能，但仍是实施本发明的有用的香料。用于调味包装的小吃食物(包括代表性的例子，如马铃薯薄片、玉米薄片、烤肉薄片、奶酪饼干、以及其他)的某些香辛料或香辛料的混合物，可利用固态的或者微粒的香辛料和调味品、诸如辛辣的烤肉香料的均匀和不均匀的组合来进行调味。它们具有增强香料(味道)的性能，因此在制造过程中与其他通常应用于食品作为调味剂的香辛料一起作为有用的香料。

下文并不是全面的列举，而仅仅代表一些常用的味道香料，以及一些产生感觉的香料。产生味道和感觉的香料的例子包括人工甜味剂、谷氨酸盐、甘氨酸盐、鸟苷酸盐、肌苷酸盐、核糖核苷酸盐、和有机酸(包括醋酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸)、多酚等。

该列举仅仅是常见的调味芳香剂的示例。存在成千上万的可组合或者独自使用以形成特殊的所期望的香味的分子化合物。一些代表性的常见调味芳香剂的例子包括乙酸异戊酯(香蕉)、肉桂醛(肉桂)、丙酸乙酯(果味的)、柠檬烯(橘子)、乙基-(E,Z)-2,4-癸二烯酸酯(梨)、己酸烯丙酯(菠萝)、乙基麦芽酚(糖、棉花糖)、水杨酸甲酯(冬青)、及其混合物。

文中描述的任一食物制品还可包括一种或多种强化剂。强化剂可为维生素、矿物等，包括任何合适的微量养分。例子可包括但不限于必需的微量元素、维生素、辅助维生素(co-vitamin)、必需脂肪酸、必需氨基酸、光合养分(photonutrient)、酶等。

如上所述，任一食物制品以及制作它们的方法可形成为任何合适的形状因子。例如，食物制品可构造为薄片(例如，马铃薯薄片、玉米圆饼或松脆物的形状因子)。如在文中所使用的，薄片可一般指食物的薄的片(通常通过手来消耗)，其经常通过油炸、烘焙、或干燥制成松脆物，且通常作为小吃或者作为餐食的一部分来食用。

实施例

在一个实施例中，由培养的细胞制作脱水的食物制品的方法适用于生产具有高的动物蛋白含量的薄片。

可食用的薄片通过使动物细胞和水凝胶溶液(诸如植物源多糖)的混合物脱水来制备。可使用的多糖的一个例子为低甲基酯化果胶(已经用在食物中的丰富的植物衍生物)。为了对薄片进行调味，可添加专门制备的蔬菜汤和/或佐料。混合物可散布在模具(例如，假羊皮纸模具)上，然后脱水，例如在食物脱水机中脱水，以增强风味和获得松脆性。

图1A至图1D示出可被组合以制作食物制品的组分。在该实施例中，进入到每一个薄片的组合物中的成分包括近似5亿个细胞(在图1A和图1B中示出团块化的)、800微升的调味汤(图1C)、和300微升的4％的植物源水凝胶溶液(在图1D中所示，在该实施例中为多肽果胶)。如在图2A中所示，在混合物散布到诸如假羊皮纸模具的表面上之后，钙的添加可使得果胶胶化。在使得水凝胶凝固后，可进行脱水。可在60℃下执行脱水，持续19小时。最终的制品是酥脆的、有味道的薄片(在图2B中所示)。

食物制品(其在本文可被称作薄片、可食用的小吃薄片、培养的细胞的小吃薄片等)可具有任何形状，包括传统的“薄片”的形状，包括正方形、长方形、三角形、卵形、圆形等，且可为平坦的、弯曲的或弧形的。可通过脱水过程(例如，在模具上)形成所述形状。一旦脱水，则所述形状可从基底(模具表面)上去除且进一步加工。进一步加工可包括添加额外的调味剂，包括添加盐、糖等或可食用的包衣。

例如，图3A1至图3C2示出如在文中所描述的可制成的培养的细胞的小吃薄片的形状的实施例。在实施例1中，如在文中所描述的可形成任何合适的尺寸和形状。在该实施例中，所述形状是平面的(但也可是弧形的或弯曲的)；也可形成更复杂的形状。例如，图3A1示出所制作的培养的细胞的小吃薄片具有类似于传统的脊状的马铃薯薄片的显现出脊状的、有点不规则的形状。图3A2示出该形状的侧视图。类似地，图3B1示出具有卵形形状的培养的细胞的小吃薄片，同时图3B2示出该薄片的侧视图。图3C1示出具有三角形形状和相对薄的截面(图3C2)的薄片。如所提到的，培养的细胞的小吃薄片可形成有任何尺寸(表面直径、阔度、长度等)和厚度，包括可易于通过手来食用的尺寸和厚度。例如，培养的细胞的小吃薄片可具有在约1cm和15cm之间(例如在约2cm和10cm之间等)的尺寸(例如，平均表面直径或在一些变型中中值表面直径)和在约0.1mm和10mm之间(例如在0.5mm和5mm之间、在0.5mm和4mm之间、在0.5mm和3mm之间、在0.5mm和2mm之间等)的厚度。

培养的肌肉细胞可在脱水前即刻与植物源水凝胶溶液组合或者它们可利用水凝胶进行培养。在一些变型中，如上所述，细胞可在可食用的微载体上培养，该微载体可由多糖(其还可包括具有细胞附着基序的多肽)和/或其他可食用的材料制成。所述细胞可为来自所建立的细胞系的肌肉细胞，包括永生化的肌肉细胞，或者它们可为原代培养物，或者它们可为这些的混合物。

例如，可收获体外培养的细胞以制作食物制品。例如，在上文所示的样品薄片中，5亿细胞产量的培养物可从多层细胞培养室(CellStack culture chamber)移除(即接种3000万牛平滑肌细胞且培养5天)。细胞可通过离心以使细胞团块化且用PBS冲洗进行洗涤。然后去除所述PBS。在该实施例中，可将800微升的专门制备的汤(辛辣照烧酱)加入到细胞中，还可加入在70℃温热的300微升的果胶溶液(4％，在蒸馏水中)。细胞、汤和果胶混合物可通过涡旋等进行混合(例如，使用Eppendorf combitip)。然后，可加入近似50微升的氯化钙溶液(0.5M，在水中)和再次混合混合物(例如，使用Eppendorf combitip以均质化)。在该步骤中可并入一些空气。

与在图2A至图2B中所示的类似，所述混合物然后可分布到假羊皮纸模具中，该假羊皮纸模具已经被喷洒有50微升的氯化钙溶液(0.5M，在水中)。使所述果胶在室温下进行胶化，持续5分钟。此后，所述模具和凝胶可置于60℃的脱水机中19小时以使食物制品脱水然后制成薄片。所述薄片可然后从模具(假羊皮纸)中去除。

该方法可按比例放大和/或自动化以制作多个薄片。如所述，所述方法还可被修改以制作其他的食物制品。

文中所述的制作培养的细胞的小吃薄片的方法通常产生与现有的食物制品结构上不同的薄片。当检查所得到的薄片的超微结构性能时，这是明显的。例如，穿过培养的细胞的小吃薄片的截面示出在脱水的水凝胶的基质内的脱水的培养的肌肉细胞。培养的肌肉细胞的身份可通过对识别标记物(包括蛋白质标记物(例如肌动蛋白、肌球蛋白等))进行染色来证实。例如，在图4所示的穿过干燥的可食用的食物制品的截面中，超微结构示出在脱水的水凝胶内分布的剩余的细胞形状(例如，培养的肌肉细胞)。通常，在脱水的薄片中，超微结构可示出离散的且脱水的表达特异性标记物(诸如动物蛋白标记物)的培养的细胞(或细胞的团簇)。这些细胞通常与植物源水凝胶混合。这些薄片也可被称作含有动物蛋白的薄片。视觉化可示出在植物源水凝胶内的培养的细胞(或培养的细胞的脱水的残留物)的不同图案。培养的肌肉细胞在脱水的制品中可仍是明显的(且适度地完整的)。

在图4中，穿过如在文中描述的所制成的干燥的薄片的一个例子的截面示出平滑肌肌动蛋白(通过与α平滑肌肌动蛋白抗体反应检测出)。在脱水的样品中的离散的细胞形状的主体的图案为用于制作薄片的培养的步骤的特征，即，使培养的细胞与水凝胶混合，然后使片状的混合物脱水。

与不是由与水凝胶混合然后脱水的培养的细胞制成的其他可食用的食物制品相比，制成为薄片小吃的可食用的食物制品的组成也可是特有的。例如，图5的表格示出如文中所述制作的薄片的营养分析的结果，且示出该薄片在该实施例中具有近似70％的高含量蛋白质，但更普遍地蛋白质含量可在约40％和90％之间(例如在约40％和80％之间、在约45％和90％之间、在约45％和80％之间、在约50％和90％之间、在约50％和80％之间、在约60％和90％之间、在约60％和80％之间、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％等)。

可食用的微载体

如上所述，文中描述的任何食物制品可使用在可食用的微载体(包括微珠)上生长的培养的细胞。可食用的微载体可由一种不含动物制品的材料或多种不含动物制品的材料制成，这意味着所述一种材料或多种材料源自非动物(包括植物)的来源。可食用的微载体可通常由可食用的(营养的和/或大量食用是安全可消化的)材料以及具有细胞附着域或基序的材料制成。在一些变型中，可食用的微载体可至少部分地通过多糖和包括细胞附着基序(诸如RGD)的多肽的交联结构制成。作为特定的实施例，可食用的微载体可通过使果胶(例如硫醇改性的果胶，PTP)和包含RGD的多肽(诸如cardosin)交联而制成。

文中描述的任一可食用的微载体还可包括另外的(补充的)材料，包括香料(用于增强风味的添加剂)、用于增强可食用的微载体的外观和/或营养值的添加剂，且所得到的食物制品(例如薄片)使用可食用的微载体制作。这些添加剂(例如香料)可用于替代在脱水之前或在脱水之后加入的香料，或者除了在脱水之前或在脱水之后加入的香料之外还可使用这些添加剂(例如香料)。

例如，可食用的微载体可包括可食用的微海绵和/或可食用的微珠。这些微载体可是多孔的(例如海绵状的)或光滑的。用于形成工程肉类的可食用的微载体可制成用在生物反应器中的微珠/微粒，且直径可在约3mm和约0.02mm之间(例如在约2mm和约0.05mm之间、在约1mm和0.1mm之间、在约1mm和0.3mm之间等)。例如，微珠的直径可为大约0.5mm。该尺寸可代表平均尺寸或中值尺寸，或最大尺寸/最小尺寸。微载体的形状可以是规则的(例如球形的、圆形的等)或者不规则的，例如球形的、立方形等；任何这些形状可以是多孔的。

可食用的微载体可通过任何合适的工艺制作，包括形成可食用的微载体的材料的模制、挤压、注射、输注等。可用在利用生物反应器的细胞培养技术中且可保持最终的工程化的可食制品(例如薄片)的整体部分的可食用的、高度多孔的微载体，可由可食用的不含动物的材料(包括可来自长期培养的培养的动物细胞或者可在不杀死动物的情况下可去除的培养的动物细胞)制成。这类可食用的微载体可通过使组分(诸如多糖和多肽)形成交联的水凝胶、冻干交联的水凝胶、以及使该冻干的凝胶成形(例如，切割)为合适的尺寸来制备。

形成可食用的微载体的方法的一个例子包括形成微载体的主要组分(多糖和多肽)。例如，可使用的一类多糖为低甲基(LM)酯化果胶(在食物中已经使用的丰富的植物衍生物)。例如，所使用的LM酯化果胶可被衍生化以形成硫醇改性的果胶(PTP)，其为100％可食用的和可消化的。在大蒜和洋葱中发现硫醇官能团。可使用的一类多肽包括cardosin。cardosin为可从刺苞菜蓟(Cynara cardunculus L.)中提取的且包含促进细胞附着的细胞结合RGD基序的天冬氨酸蛋白酶。例如，cardosin可通过其半胱氨酸衍生化以引入新的硫醇基团。cardosin已经被食品行业所使用，尤其在奶酪制作中。在其他变型中，cardosin能被另一多肽所替代(或补充)，该另一多肽包括合成肽，具有可食用的RGD序列。

在一些变型中，PTP和衍生化的cardosin可通过氧化的二硫键形成而被交联。在该实施例中，PTP-cardosin水凝胶可使用(氧化形式的)谷胱甘肽二硫化物(GSSG)在温和的条件下进行交联，该(氧化形式的)谷胱甘肽二硫化物(GSSG)通过将空气鼓泡进入高级的谷胱甘肽(GSH，例如诸如健康食品储存级的谷胱甘肽)的溶液中而获得。也可以加入额外的添加剂(例如调味剂、营养物、颜料等)。

然后可使水凝胶定型或成形。例如，微海绵(1mm至5mm厚)可通过将水凝胶溶液浇注到模具中而成形且使交联在空气中继续过夜，然后冻干且切割成所需的尺寸(较大的海绵用于组织工程应用，约0.5mm的小段用于生物反应器应用)。

为了大量生产微珠，可使用同轴气流式制珠装置。例如，珠可由改性的交联的果胶和cardosin水凝胶(例如PTP-cardosin水凝胶)组成。在一个变型中，制作PTP和cardosin的微载体的方法可通过以下步骤来执行：(1)通过利用胱胺在两个改性级别下(例如10％，25％)对果胶进行衍生化，然后进行还原形成果胶-硫代丙酰酰胺(PTP)；(2)通过cardosin的衍生化作用引入新的硫醇基团(例如cardosin A)；(3)利用PTP和硫醇化的cardosin形成板形式的GSSG交联的水凝胶(pH、浓度等可被优化以用于形成水凝胶；也可包括添加剂，例如着色剂、营养物等)，且可冻干水凝胶；(4)使用珠生成器、诸如Nisco同轴气流式珠生成器形成珠，且冻干GSSG水凝胶球体以获得微载体。

在使用时，微载体可被用于大量地培养细胞，例如平滑肌细胞，以制作可食用的材料(例如薄片)。如上所述，通常，除了肌肉细胞外(或者取代肌肉细胞)，其他细胞类型也可用在微载体上，包括卫星细胞等。

比如，如文中所述的微载体可接种肌肉细胞(例如平滑肌细胞)，然后培养。尤其，所述细胞和微载体可在生物反应器中进行培养。所得到的培养物可生长至所期望的水平且可直接被使用以制成薄片，而不需要分离或者去除微载体。该薄片可如上文所述制成，其中(替代仅将细胞和水凝胶组合)，在其上已经生长了培养的细胞的微载体与水凝胶组合，然后脱水。在一些变型中，在进行脱水之前，具有细胞的微载体可直接地被施加(例如倾倒、喷洒等)至形成表面(诸如模具)上，而没有添加水凝胶；例如，在所述表面上的微载体可被培养以使得细胞和/或微载体至少部分地融合。例如，具有细胞的微载体可在表面上培养一定量的时间(例如，4小时、12小时、18小时、24小时、48小时、3天等)，或者可被立即脱水。

在一些变型中，与上文实施例1中所示的和描述的类似，可与包括香料的添加剂和水凝胶的溶液(例如植物源多糖)一起添加具有细胞的微载体(该细胞可生长至密集，包括在微载体上融汇)。然后，可以使混合物脱水。

例如，可食用的微载体与培养的细胞可在生物反应器中孵化合适的时间以使得细胞在微载体上生长且繁殖(例如，12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天等)以形成细胞化的微载体之后，来制成薄片。通常，细胞化的微载体为其上已经附着且生长有细胞(例如肌肉细胞)的(例如可食用的、不含动物制品的)微载体。如所提到的，微载体上的细胞可生长至融汇，尽管这不是必需的。另外，所述细胞可在微载体的表面上和/或在微载体的表面中融合。细胞化的微载体可至少部分地融合。

在这些实施例中，食物制品的主体还可包括微载体，其可被可视化(例如，在放大的情况下)。

例如，在使用可食用的微载体的变型中，制作如文中所述的薄片的方法可包括在悬浮液中的可食用的且不含动物制品的微载体上培养多个肌肉细胞以形成多个细胞化的微载体。所述细胞化的微载体可与植物源水凝胶混合，且在一些变型中与诸如香料的添加剂混合。细胞化的微载体和水凝胶的混合物(具有额外的添加剂或不具有额外的添加剂)，然后可被置放、倾倒、喷洒或者以其他方式施加在适合于用在脱水机中的基底(例如，模具或者其他表面)上。混合物然后可如上所述进行脱水。然后可加入额外的香料/添加剂(例如盐等)，然后薄片可进一步被加工和/或包装。

细胞可通常利用在悬浮液中的如文中所述的任何可食用的微载体进行培养，包括在生物反应器中进行培养。例如，细胞可与可食用的微载体一起接种到培养基中，并且可以允许细胞接触合适的可食用的微载体、附着至合适的可食用的微载体、且在合适的可食用的微载体上生长。例如，培养可包括在包含具有硫醇改性的果胶(PTP)和cardosin的水凝胶的可食用的且不含动物制品的微载体上培养多个肌肉细胞。在一些变型中，培养包括在可食用的且不含动物制品的微载体上培养多个肌肉细胞，其中，所述不含动物制品的微载体包含调味剂、增味剂、着色剂、增色剂、和营养强化剂。

在一些变型中，细胞化的微载体覆盖有细胞(例如大于50％被覆盖、大于60％被覆盖、大于70％被覆盖、大于80％被覆盖、大于90％被覆盖、覆盖至细胞融汇)。如在先前通过引用方式全部并入的U.S.8703216中所述，所使用的细胞可具有一种类型或多种类型，尤其包括肌肉细胞。利用细胞覆盖至合适的程度(例如>50％、>60％、>70％、>80％、>90％等覆盖)的微载体可被称作细胞化的微载体。

尽管如文中所述的可食用的微载体的使用是可选的，但是相对于传统地培养的细胞它可提供一些优势。例如，用于文中所述的可食用的薄片的细胞(其可包括例如平滑肌细胞、卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞祖细胞等)通常是贴壁依赖型的，需要用以附着的表面。当前的细胞培养方法可使用烧瓶、管和/或板(例如cellStacks或者hyperflasks)以提供细胞可以附着和生长的表面，这会引起体力劳动密集的过程，且会需要酶来使细胞从该表面和大量的培养基中脱离以收获细胞。大多数的材料是一次性使用的，因此产生废弃物；随着培养进展，细胞的扩增通常通过接种更多的具有更大数量的层的板来实现。

文中描述的微载体可提供用于细胞附着的大的表面积/体积，尤其如果微载体是微孔的或大孔的。细胞扩增的初始步骤可包括在小型生物反应器中混合细胞和微载体。细胞在保持在悬浮液中的微载体上附着和繁殖。当实现最大生长时，微载体可被收集且可用于接种更大体积的生物反应器，或者如果生长足够量的情况下则可直接使用。细胞不必须与微载体分离，因为文中描述的微载体是可食用的，从而消除了酶的使用以及损坏细胞的风险。该工艺是省时的且易于按比例扩大。工业化生物反应器可以比传统的细胞培养孵化器以更小的空间实现大的体积(例如大于1000L)。

文中使用的术语仅仅出于描述特定的实施方式的目的，且不用于限制本发明。例如，如在文中使用的单数形式“一”和“该”也用于包括复数形式，除非上下文另有清楚地说明。还应理解到，术语“包括”，当在该说明书中使用时，指定存在所述的特征、步骤、操作、元素和/或组分，但不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、元素、组分、和/或其群组的存在或添加。如文中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关的所列举的项目中的任一的及全部的组合，且可缩写为“/”。

如本文在说明书和权利要求中所使用的，包括如在实施例中使用的以及除非另有说明，否则所有的数值可被理解为犹如以词“大约”或“近似”开始，即使该术语并没有明确地显现。当描述幅度和/或位置时，短语“大约”或“近似”可用于表示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理的预期范围内。例如，数值可具有为所述值(或者值的范围)的+/-0.1％的值，所述值(或者值的范围)的+/-1％的值，所述值(或者值的范围)的+/-2％的值，所述值(或者值的范围)的+/-5％的值，所述值(或者值的范围)的+/-10％的值等。在文中所记载的任何数值范围旨在包括其中所包含的所有子区间。

尽管上文描述了多个示例性实施方式，但在不偏离如由权利要求所述的本发明的范围的情况下，可对各种实施方式进行许多修改中的任一种修改。例如，在可替选的实施方式中，执行多个所描述的方法步骤的次序可经常进行改变，且在其他可替选的实施方式中，一个或多个步骤可一起被略过。各种装置和系统实施方式的可选特征可包括在一些实施方式中，而不被包括在其他实施方式中。因此，上述的描述主要出于示例性目的而提供，不应被解释为限制如在权利要求中提出的本发明的范围。

作为示例且非限制的目的，文中包括的实施例和说明示出了可实施主题的具体的实施方式。如所提到的，其他实施方式可被利用且由此得出，使得在不偏离该公开的范围的情况下可进行结构和逻辑上的替代和改变。仅仅出于方便，本发明的主题的这种实施方式在文中可被单独地或集中地称作“发明”，且不用于随意地将该申请的范围限制为任何单个的发明或发明概念，如果实际上大于一个的发明或发明概念被公开的话。因此，尽管文中已经说明和描述了具体的实施方式，但是任何预计实现相同目的的布置可被用于替代所示出的具体的实施方式。该公开内容旨在涵盖各种实施方式的任何以及全部的改变或变型。当评述上述描述时，上述实施方式的组合、以及在文中没有明确地描述的其他实施方式对于本领域技术人员来讲将是显而易见的。