本发明涉及酵素领域，尤其涉及一种高活性功能成分酵素的制备与测定。
背景技术：
酵素又称为“酶”，是一种比细胞单位更小的一种蛋白质，是一种生物催化剂，它承担人体内新陈代谢中各种化学反应，能增加组织各种生化反应(氧化、还原、分解、合成、转化)的速率，人体内凡是细胞的代谢，新生，分解，消化，合成等，都依靠酵素来完成，所以酵素又被称之为“生命之泉”。
伴随着人们年龄的增长，人们体内的酵素会日益减少，由于现代社会竞争激烈，生活节奏加快，环境污染日益严重，酵素的活性也在下降，代谢功能也在不断衰退。酵素的减少及活性的下降，会导致各种症状的出现，由于酵素作用的单一性，要预防和治疗这些疾病，我们必须从膳食中摄取更多的酵素，然而酵素是非常脆弱的，在高温烹饪(60℃以上就完全失去活性)、加工过程中就会失去活性，造成人们从食物中摄取的酵素很低，无法满足人们的正常需要。
现有酵素的生产技术一般都是用多种杂果、谷物或者菌类等混合自然发酵而成，发酵所需时间过长(发酵加陈化一般最短需要6个月，有的甚至需要一年)，且发酵完得到的酵素产品中有益活菌含量比较低，保健功效不够显著。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高活性功能成分的酵素的制备方法，该工艺能大大缩短发酵时间，并且能提高酵素产品中功能性活性成分的含量，能最大化利用菌种的发酵产酶能力，使酵素功能更强大，有效提高酵素的各种保健功能。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种高活性功能成分酵素的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备酵素原液：取水果作为原料，进行紫外消毒处理后，在洁净条件下，切碎，然后加入蜂蜜，常温下发酵30天，过滤，得到水果酵素原液；此处除了选择水果之外，也可以选择蔬菜、食用菌、谷物、豆类、中药材等其他食材作为原料。
(2)二次发酵：将酵素原液，接种双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，发酵30-60天后，得到本发明的高活性功能成分酵素，将其保存于密封罐中。发酵时间根据取样测脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶活力变化来确定，通常为30-60天。
步骤(2)中，双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的接种量均为1-10％。优选双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的接种量均为5-8％。
步骤(1)中，所述水果选自苹果、梨、猕猴桃、石榴、火龙果、柚子、香蕉、柠檬、芒果、木瓜、葡萄、橙子、山楂、草莓中的一种或两种以上任意比例的混合物。
步骤(1)中，所述原料水果与蜂蜜的重量比为1:0.5-2，优选为1:1。
步骤(2)中，所述双歧杆菌和嗜酸乳杆菌市售可以购得，也可以通过下述方法制得：取培菲康三联活菌胶囊3颗加入到灭菌后的锥形瓶中，加入50ml生理盐水混匀，从锥形瓶中取1ml于试管中，再加入9ml无菌生理盐水混匀，如此稀释3次；
无菌条件下，从第三次稀释后的菌液中取出0.5ml菌液，涂布于BBL培养基平皿上，半小时后37℃恒温培养箱内厌氧倒置培养48h，将平皿中菌落进行革兰氏染色镜检，取阴性菌落接种于BBL培养基平板上，37℃恒温厌氧培养18h，制得双歧杆菌；
无菌条件下，从第三次稀释后的菌液中取出0.5ml菌液，涂布于酸化MRS培养基平皿上，半小时后37℃恒温培养箱内厌氧倒置培养48h，将平皿中菌落进行革兰氏染色镜检，取阳性菌落接种于酸化的MRS培养基平板上，37℃恒温厌氧培养24h，制得嗜酸乳杆菌。
有益效果：本发明的制备方法有效的缩短了发酵时间(发酵时间一般是3-4个月，较现有技术整整缩短一半时间以上)，大大提高了生产效率，通过对复合菌发酵过程中活性成分的随时监测，最终确定了酵素整个发酵过程终止的最佳时间，从而确保活性成分达到最高值，显著提高了其保健功效。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
备注：1.下述实施例中，脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶含量的测试方法如下：
(1)脂肪酶含量测定方法参考GB/T 23535-2009；
酶活定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在40℃温度和pH7.5条件下，1min水解底物产生1umol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
脂肪酶在一定条件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单脂和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用PH计或酚肽指示液指示反应终点，根据消耗的碘量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。
(2)蛋白酶含量测定方法参考GB/T23527-2009；
酶活定义：1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在40℃(酸性pH＝3.0、中性pH＝7.5、碱性pH＝10.5)条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。
用双蒸水配制浓度为2％的酵素待测溶液,规定1g固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH条件下,1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以μg(U/mL)表示。蛋白酶活力以“酵素1min水酪蛋白生成1μg氨基酸为一个酶活力单位”来表示。
(3)超氧化物歧化酶(SOD)的测试方法参考GB/T5009.171-2003。
25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50％时所需的SOD量为一个活力单位。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3～4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶定量为一个活力单位。
2.下述实施例中，采用的双歧杆菌和嗜酸乳杆菌通过如下方法制得：
取培菲康三联活菌胶囊3颗加入到灭菌后的锥形瓶中，加入50ml生理盐水混匀，从锥形瓶中取1ml于试管中，再加入9ml无菌生理盐水混匀，如此稀释3次，以此标记为10-1、10-2、10-3；
无菌条件下，从10-3试管中取出0.5ml菌液，涂布于BBL培养基(市场购买)平皿上，半小时后37℃恒温培养箱内厌氧倒置培养48h，将平皿中菌落进行革兰氏染色镜检，取阴性菌落接种于BBL培养基平板上，37℃恒温厌氧培养18h，制得双歧杆菌；
无菌条件下，从10-3试管中取出0.5ml菌液，涂布于酸化MRS培养基(市场购买)平皿上，半小时后37℃恒温培养箱内厌氧倒置培养48h，将平皿中菌落进行革兰氏染色镜检，取阳性菌落接种于酸化的MRS培养基平板上，37℃恒温厌氧培养24h，制得嗜酸乳杆菌。
实施例1
(1)制备酵素原液：取苹果、梨、猕猴桃、石榴、火龙果、柚子、香蕉、柠檬、芒果、木瓜各200g作为原料，进行紫外消毒处理后，在洁净条件下，切成片状，混合均匀，加入蜂蜜，蜂蜜与水果重量比为1:1，常温下发酵30天，过滤，得到酵素原液；测定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活达到11.5u/ml,蛋白酶酶活达到1056.6u/ml,超氧化物歧化酶酶活达到526.5u/ml；
(2)二次发酵：接种双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，接种量各为8％，二次发酵30天，即得，将酵素液保存于密封罐中。
测得：脂肪酶酶活达到52.8u/ml,蛋白酶酶活达到2859.3u/ml,超氧化物歧化酶酶活达到1347.4u/ml。
对比例
(1)制备酵素原液：取苹果、梨、猕猴桃、石榴、火龙果、柚子、香蕉、柠檬、芒果、木瓜各200g作为原料，进行紫外消毒处理后，在洁净条件下，切成片状，混合均匀，加入蜂蜜，蜂蜜与水果重量比为1:1，常温下发酵30天，过滤，得到水果酵素原液；
(2)将步骤(1)得到的水果酵素原液自然二次发酵30天，即得，将酵素液保存于密封罐中。
测得：脂肪酶酶活达到20.7u/ml，蛋白酶酶活达到1502.3u/ml，超氧化物歧化酶酶活达到701.8u/ml。
通过实施例1和对比例的检测结果可以看出：二次发酵采用自然发酵得到的酵素中，三种酶的酶活相较于一次发酵酵有一定的提高，但变化不大；加入了双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的二次发酵得到的酵素中，三种酶的酶活有明显提高。
实施例2
(1)制备酵素原液：取猕猴桃300g、石榴400g、橙子200g，山楂100g,草莓300g,柠檬400g作为原料，进行紫外消毒处理后，在洁净条件下，切成片状，混合均匀，加入蜂蜜，蜂蜜与水果重量比为1.5:1，常温下发酵30天，过滤，得到水果酵素原液；测定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活达到13.5u/ml，蛋白酶酶活达到1508.7u/ml，超氧化物歧化酶酶活达到554.1u/ml；
(2)二次发酵：接种双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，接种量各为5％，二次发酵35天，即得，将酵素液保存于密封罐中。
测得：脂肪酶酶活达到62.2u/ml，蛋白酶酶活达到2922.1u/ml，超氧化物歧化酶酶活达到1415.5u/ml。
实施例3
(1)制备酵素原液：取金针菇200g、猴头菇300g、木耳200g、银耳100g、香菇300g、茶树菇100g作为原料，进行紫外消毒处理后，在洁净条件下，切成片状，混合均匀，加入蜂蜜，蜂蜜与食用菌重量比为0.5:1，常温下发酵30天，过滤，得到酵素原液；测定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活达到5.5u/ml,蛋白酶酶活达到912.5u/ml,超氧化物歧化酶酶活达到658.2u/ml；
(2)二次发酵：接种双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，接种量各为6％，二次发酵45天，即得，将酵素液保存于密封罐中。
测得：脂肪酶酶活达到8.2u/ml,蛋白酶酶活达到1204.6u/ml,超氧化物歧化酶酶活达到815.5u/ml。
实施例4
(1)制备酵素原液：取糙米400g、大豆100g、玉米胚芽200g，薏仁米200g，大麦150g作为原料，进行紫外消毒处理后，在洁净条件下，混合均匀，加入蜂蜜，蜂蜜与谷物重量比为0.6:1，常温下发酵30天，过滤，得到酵素原液；测定脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的酶活，脂肪酶酶活达到0.5u/ml,蛋白酶酶活达到655.5u/ml,超氧化物歧化酶酶活达到911.4u/ml；
(2)二次发酵：接种双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，接种量各为8％，二次发酵50天，即得，将酵素液保存于密封罐中。
测得：脂肪酶酶活达到0.8u/ml,蛋白酶酶活达到774.1u/ml,超氧化物歧化酶酶活达到1155.8u/ml。
以上所述为本发明较为优选的具体实施例，但本发明保护范围并不局限于此，根据本发明的技术方案及发明构思进行相应改变的都应包含在本发明的保护范围之内。