一种液态牛奶中单增李斯特菌的光动力杀灭方法与流程

本发明属于微生物杀菌技术领域，涉及一种食品杀菌非法，具体涉及一种液态牛奶中单增李斯特菌的光动力杀灭方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)简称单增李斯特菌，单增李斯特菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性短杆菌，是李斯特菌属中最为重要的人类食源性致病菌，90年代被列为食品中的四大病原菌之一。其感染人类后发病死亡率高达25％，而有免疫缺损的病人，致死率甚至高达70％。奶及奶制品中易发生单增李斯特菌的污染，我国的江苏和北京对冰淇淋中单增李斯特菌的检测显示污染率为2.2-7.3％；牛奶灭菌方法有巴氏灭菌法和超高温瞬时灭菌法，巴氏灭菌能最大程度保留牛奶的营养和风味，但灭菌不彻底，保鲜期短，且需冷藏保存，由于该菌在4℃冷藏环境下仍可生长繁殖，所以存在一定风险性。该菌还具有很强的耐盐性，研究表明单增李斯特菌可在4℃的含25.5％nacl胰蛋白胨大豆肉汤培养基的中存活132天。超高温瞬时杀菌能完全杀灭单增李斯特菌，但将其运用于食品则会破坏主要营养成分，且耗能大。所以，研究牛奶中单增李斯特菌杀灭方法对食品安全具有重要意义。

目前，出现了一些新的杀菌技术，如超高压灭菌技术、辐照杀菌技术、化学消毒剂灭菌技术等。超高压灭菌技术对生产设备的要求高，成本高，难以广泛应用于食品工业；辐照杀菌会导致食品发生不良变化，且对人体有害，需特殊防护；化学消毒剂灭菌技术易残留，消毒剂具有一定的腐蚀性。因此，需要开发一种快速简便，安全高效低能且最大程度保护营养成分的杀菌技术，而光动力技术即能满足此需求。

光动力技术是用特定波长的光照射使组织或细胞吸收的光敏剂被激发，光敏剂将能量传递给氧，生成具有损伤细胞蛋白质、dna等的活性氧。其在医学上的应用已成熟，如一些恶性肿瘤和良性疾病的治疗；同时，在血液制品消毒等方面的作用也得到了广泛认同，其安全性有较为详尽的论证。该方法具有以下优点：(1)可重复，对细菌不产生耐药性；(2)不需高温，对食品的营养及感官影响小；(3)快速简便；(4)安全高效；(5)是一种非特异性灭菌方法，具有广谱的杀菌性能；(6)成本低。其作为一项新的非热杀菌技术-光动力技术应用于食品安全领域，国内外少有报道，光动力技术作为牛奶中单增李斯特菌的杀灭方法国内外没有报道。

技术实现要素：

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种以亚甲基蓝为光敏剂、溴钨灯为光源的光动力杀灭牛奶中单增李斯特菌的非热杀菌方法，能够弥补现有热与化学杀菌方法的不足。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种液态牛奶中单增李斯特菌的光动力杀灭方法，该方法以溴钨灯为光源，以亚甲基蓝为光敏剂，采用非热光动力灭菌技术杀灭牛奶中单增李斯特菌。

优选的，所述方法具体为：将亚甲基蓝加入牛奶样品中，使亚甲基蓝在牛奶样品中终浓度为0.005-10μg/ml，孵育10-30min后，在溴钨灯光源下照射1-30min，溴钨灯的光功率密度为200mw/cm²以上。

更优选的，所述方法具体为：将亚甲基蓝加入牛奶样品中，使亚甲基蓝在牛奶样品中终浓度为5μg/ml，孵育30min后，在溴钨灯光源下照射10min，溴钨灯的光功率密度为200mw/cm²。

优选的，所述溴钨灯的功率为75w以上。

由于光功率密度参数对杀菌效果有影响，功率太小的溴钨灯达不到理想的杀菌效果。

光敏剂是光动力技术的核心物质，本发明以亚甲基蓝作为光敏剂。亚甲基蓝可作为氰化物和亚硝酸盐中毒的解毒剂；临床上作为治疗牙周炎、龋齿灭菌的两种可采用光敏剂之一；早在1992年，欧美等发达国家在临床上就且应用亚甲基蓝处理冷冻新鲜血浆，在我国部分血站也得到广泛推广及应用；且实验所采用的最大剂量为10μg/ml，以2l/50kg体重输注计算，输注量远低于《中华人民共和国药典》规定的临床低剂量(266μmol/50kg)，因此在毒理学方面对人是相对安全的。而采用溴钨灯，是由于亚甲基蓝对光源没有特殊的要求，而冷光源如溴钨灯，荧光灯等产热较少，更有实用价值。

本发明通过单因素实验，以感染单增李斯特菌的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)为实验参照组，采用平板菌落计数法研究在不同光照时间的溴钨灯光源下，不同剂量的亚甲基蓝(methyleneblue，mb)对不同牛奶浓度中单增李斯特菌的光动力杀灭效果，筛选光动力技术灭活牛奶中单增李斯特菌的最佳条件。实验结果显示：在光功率密度200mw/cm²的溴钨灯光源下，5μg/ml的亚甲基蓝经过10min照射可以杀灭牛奶菌悬液中99％的单增李斯特菌。

通过试验证明，本发明光动力技术对单增李斯特菌的杀伤效果明显且安全性高，快速方便，不会产生耐药性，对食品营养成分及感官影响小，在食品工业中具有很好的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)亚甲基蓝无明显化学毒性，具有较好的光敏活性，波长范围较广，适用于不同光源，易于渗透进组织细胞，无明显毒性，来源广，价格便宜，无污染。

(2)亚甲基蓝与溴钨灯结合使用的杀菌效果明显，且重复使用对细菌不产生耐药性，而使用过多的抗生素杀灭细菌会导致细菌产生耐药性。

(3)光动力杀菌对食品营养成分与感官影响小，在对液态牛奶单增李斯特菌杀灭的同时，能最大程度保证牛奶品质，极大减少热敏性营养成分和挥发性风味物质的损失，成本低，快速方便。而传统的牛奶巴氏杀菌法杀菌不彻底，超高温瞬时杀菌法能耗大，时间长，易造成热敏性营养成分损失。

附图说明

图1为不同亚甲基蓝浓度的光动力技术对牛奶中单增李斯特菌菌落总数的影响。

图2为不同照射时间的光动力技术对牛奶中单增李斯特菌菌落总数的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例使用的单增李斯特菌(listeriamonocytogenes)由广州市疾病预防控制中心提供。

本发明提供一种牛奶中单增李斯特菌的光动力杀灭方法，其使用亚甲基蓝为光敏剂，溴钨灯为光源来杀灭牛奶中的单增李斯特菌。

本发明通过以下实验步骤进行验证：

第一步：将活化后的单增李斯特菌离心收集菌体后用pbs调整；配制牛奶菌悬液；

第二步：将亚甲基蓝加入牛奶菌悬液，使亚甲基蓝浓度为0.005-10μg/ml，避光孵育30min后用75w溴钨灯距离20cm照射10min(实施例1)；

第三步：将亚甲基蓝加入牛奶菌悬液，使亚甲基蓝终浓度为2μg/ml，避光孵育30min后用75w溴钨灯距离20cm照射1-30min(实施例2)。

所述第一步中牛奶菌悬液浓度为10⁸cfu/ml。

所述第二步用pbs调整亚甲基蓝浓度分别为0.005、0.05、0.2、0.5、1、2、5和10μg/ml。

所述第三步用75w溴钨灯分别照射1、5、10、15、20和30min。

实验发现，最佳反应条件参数为：mb浓度达到5μg/ml时，光照时间为10min时，可使单增李斯特菌菌落总数降低7个数量级。

本发明旨在发明一种高效，安全，快速方便，低成本的非热杀菌技术应用于牛奶中单增李斯特菌的灭菌。在光敏剂的选择上，选取了价格便宜，毒性小，无污染，易于渗透进组织细胞，波长较广的亚甲基蓝，而舍去了光动力效果差的第一代光敏剂(如血卟啉衍生物)和成本高(如竹红菌甲素)等光敏剂。

本发明经过大量实验可知以亚甲基蓝为光敏剂的光动力技术对模拟受感染牛奶中的单增李斯特菌有很明显的杀伤作用，当mb浓度为5μg/ml，接受光功率密度为200mw/cm²的溴钨灯光照10min能杀死99％的单增李斯特菌，而光照对照组或光敏剂对照组就基本没有杀灭作用。这说明mb在接受一定时间的光源光照后，能激发其光动力效应，从而灭活单增李斯特菌。

实施例1.亚甲基蓝浓度实验

(一)以实验菌株前处理

将单增李斯特菌种接种到营养琼脂培养基，挑取单菌落，活化后于胰蛋白胨大豆肉汤培养基中摇床培养，37℃震荡培养至对数生长期，离心收集菌体(4000r/min，10min)，弃上清，悬浮菌体于pbs；配制牛奶菌悬液，使得牛奶菌悬液浓度为10⁸cfu/ml左右。

(二)光敏剂浓度处理

用pbs将亚甲基蓝进行稀释，配制成不同浓度的亚甲基蓝溶液，再将亚甲基蓝溶液加入到96孔板中200μl牛奶菌悬液中，使亚甲基蓝的终浓度分别为0.005、0.05、0.2、0.5、1、2、5和10μg/ml。37℃避光孵育30min，放在距离溴钨灯光源20cm处(测得光强度为160mw)照射10min后进行菌落平板计数(l+s+)。同时设置不光照和\或不加光敏剂组作为对照(l-s-；l+s-；l-s+)。

(三)图1显示了各浓度亚甲基蓝对牛奶中单增李斯特菌的光动力灭活作用，可看到随着光敏剂浓度的增加，光动力灭菌技术对单增李斯特菌的杀灭作用逐渐增强。从图中可以看出，当光敏剂浓度低至0.05μg/ml的情况下，光照10min即可使约受感染牛奶中70％的单增李斯特菌失活；而当mb浓度达到5μg/ml时，则可使牛奶中的单增李斯特菌菌落总数降低7个数量级。而不管是光照对照组还是光敏剂对照组，则未显示出明显的杀灭作用，显示了亚甲基蓝在光照情况下对牛奶中的单增李斯特菌有较好的杀灭作用。

实施例2.光照时间实验

(一)以实验菌株前处理

将单增李斯特菌种接种到营养琼脂培养基，挑取单菌落，活化后于胰蛋白胨大豆肉汤培养基中摇床培养，37℃震荡培养至对数生长期，离心收集菌体(4000r/min，10min)，弃上清，悬浮菌体于pbs；配制牛奶菌悬液，使得牛奶菌悬液浓度为10⁸cfu/ml左右。

(二)光照时间处理

在96孔板中含200μl牛奶菌悬液，并加入亚甲基蓝，使其终浓度为2μg/ml，37℃避光孵育30min后在160mw的照射强度下作用1、5、10、15、20和30min后进行平板计数(l+s+)。同时设置不光照和\或不加mb组作为对照(l-s-；l+s-；l-s+)

(三)图2显示了不同光照时间的亚甲基蓝对牛奶中单增李斯特菌的光动力灭活效果，显示了光敏剂浓度在2μg/ml时，光照时间的长短对单增李斯特菌细菌灭活作用的影响。结果表明，mb在一定浓度下，使用不同照射时间(≥15min)均能使牛奶中的单增李斯特菌菌落总数降低6个数量级，即杀灭99％的单增李斯特菌，而光照对照组则失活率几乎为0。所以可以认为，在一定光敏剂浓度下，牛奶中的单增李斯特菌的失活率随光照时间的增大而显著增加。

实施例3.牛奶中单增李斯特菌光动力杀菌前后效果测定方法

将不同处理方式所得的菌悬液均以1∶10梯度稀释后取100μl涂板于细菌计数培养基平皿中，于37℃生化培养箱中恒温培养，24h后取出进行菌落计数。为了使图标更清晰，实验结果以logcfu/ml表示，绘制条形图。实验重复3次，取平均值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。