新细菌的制作方法

本发明涉及不受普通噬菌体攻击的新颖乳杆菌属(lactobacillus)菌株，其在制造基于发酵乳的产品中的用途，以及含有所述菌株的新颖基于乳的产品。在相关方面，本发明涉及改善乳酸杆菌例如副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)的细胞计数稳定性的方法。
背景技术：
发酵乳产品，例如发酵乳饮品、乳酸菌饮料、酸奶、培养乳和奶酪等，经常通常通过提供乳基质，特别是基于动物乳，例如牛乳、山羊乳、羊乳等的乳基质作为培养基，并用乳酸菌使培养基发酵来产生。在生产发酵乳产品的过程中，噬菌体可能攻击细菌，导致乳酸菌活细胞数减少。特别是作为具有生理效果例如肠功能控制效果和免疫增强效果的保健食品而消费的发酵乳产品依赖于大量活细菌。包含副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)或干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)的益生菌的发酵乳产品的生产，经常在乳品厂中受到噬菌体攻击的挑战，导致产品的活细菌含量降低。例如，副干酪乳杆菌lc-01(chcc2115)菌株在不同的乳品厂中被噬菌体反复攻击。然而，难以用相同物种的另一菌株替换易受噬菌体攻击的菌株，因为替代菌株很少具有类似的功能，例如酸化活性、风味特征和/或相同的益生菌特征。已经建议获得噬菌体抗性菌株，并且教导了获得抗噬菌体干酪乳杆菌菌株的方法：jp1341782c3公开了通过从菌株yit-9018(ferm-pno.4751)中除去原噬菌体而获得的干酪乳杆菌yit-9029(ferm-pno.5852)菌株。日本专利19861005712b4公开了通过诱变处理从具有原噬菌体fsw的干酪乳杆菌(例如干酪乳杆菌yit-9018)中分离温度敏感性突变体，并通过热诱导方法从菌株中除去原噬菌体fsw来获得抗溶菌作用的细菌菌株。但是，这些方法似乎只对含有原噬菌体的菌株有效。同时，最近对活细菌的健康相关有益效果以及延长的保质期的关注导致对具有延长的活力例如改善的细胞计数稳定性的乳酸菌的更高要求。技术实现要素：因此，本发明的目的是提供获得副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌菌株的噬菌体抗性突变体，以及副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌菌株的细胞计数稳定性增强的突变体的方法。本发明人已经发现，与噬菌体挑战和筛选组合的诱变产生了可以代替发酵乳饮料中的母株的噬菌体抗性菌株。令人惊讶的是，本发明人发现突变菌株与母株相比具有改善的性质，因为与用母株生产的发酵乳相比，发现用本发明菌株发酵的乳具有明显更低的沉淀程度。这减少了向发酵乳制品中添加稳定剂和/或增稠剂的需要。此外，在密切相关的方面，本发明人开发了改善乳杆菌细胞计数稳定性的方法，并且发现了表现出改善的细胞计数稳定性的新菌株。更具体而言，本发明人发现，通过修改编码糖基转移酶(通过截短)和涉及o-抗原和磷壁酸(rfbx)输出的膜蛋白的基因，可以获得细胞计数稳定性改善的突变体。更具体而言，细胞计数稳定性改善的突变体具有一个核苷酸c缺失(chcc2115参考基因的位置202)，导致截短的糖基转移酶基因，并且在与干酪乳杆菌bl23的eps7m具有同源性的基因中具有突变，也见于chcc19844。eps7m的基因产物是细胞壁多糖基因簇的一部分。基因比较还显示了与“涉及o-抗原和磷壁酸(rfbx)输出的膜蛋白”的同源性。eps7m同源物位于糖基转移酶下游三个基因处。两个突变都在同一区域。基于与涉及cps产生的基因的同源性，显然所鉴定的突变是噬菌体抗性表型的原因。细胞计数被稳定的菌株chcc19845具有双突变，除了修饰的膜蛋白外，它还具有截短的糖基转移酶，并且两种突变都位于相同的细胞壁多糖操纵子中。令人惊讶地发现，这个基因簇中的双突变事件导致非凡的噬菌体抗性以及增强的细胞计数稳定性。定义在本文中，术语“抗噬菌体”是指乳酸菌菌株能够在每毫升含有1000个噬菌体的乳中繁殖(在最佳生长温度下)，即该细菌在以10e5cfu/ml的浓度接种48小时后能够达到超过10e8的细胞密度。cfu是“细胞形成单位”。术语“细胞计数稳定性”应理解为每克产物的菌落形成单位(cfu)的量的量度。随着时间的推移，乳杆菌cfu/g越高，测试菌株的细胞计数越稳定。可以使用倾注培养法测量细胞计数稳定性。术语“基本上无活性的”应针对本发明的目的来理解，其中所述目的是(基本上)使编码噬菌体受体蛋白的基因例如eps7m基因失活。目的是制备这样的菌株，在所述菌株中，噬菌体受体蛋白与在相应的亲本菌株或野生型菌株中相比显著更差地作用。如下文所解释的，对技术人员而言，制备这样的菌株是常规工作。例如，通过在噬菌体受体基因中引入终止密码子或移码插入，可以产生例如不表达噬菌体受体蛋白或表达部分长度的无活性噬菌体受体蛋白的非功能性基因。或者，可以在启动子或基因中进行突变，这可以产生例如具有一些活性，但是对于所有本文相关实际目的而言基本上是无活性的噬菌体受体蛋白突变变体。测量噬菌体受体蛋白无活性的方法简单地是分析细菌对合适代表性组的不同噬菌体的的增强的抗性。如下文所解释的，这是技术人员的常规工作，并且如果如本文所述的细菌对所述组的噬菌体具有显著增强的抗性，则在本文中应理解，所述噬菌体受体蛋白是基本上无活性的。噬菌体受体蛋白的失活通常不会负面影响lab的活力、生长速率或酸产生。参见本文的工作实施例，其中对两种不同菌株证明了这一点。涉及噬菌体抗性的其他基因可以根据上述方法(基本上)失活。表述“噬菌体受体蛋白关于噬菌体感染是功能上无活性的”是指这样的噬菌体受体蛋白，其不同于噬菌体受体蛋白序列seqidno.2，并且其特征在于携带编码所述功能上无活性的噬菌体受体蛋白的噬菌体受体基因的细菌对至少一种噬菌体，特别是对噬菌体chpc1256具有提高的抗性。术语“对噬菌体的提高的抗性”表示，当在空斑测定中，例如下文所述的测定“通过琼脂覆盖法测定噬菌体抗性”中测试时，细菌菌株对至少一种噬菌体具有提高的噬菌体抗性，表示为在给定的菌株上用所述至少一种噬菌体可获得的pfu/ml(空斑形成单位/ml)的差异，相比于在亲本菌株上用相同噬菌体可获得的pfu/ml。具有对噬菌体提高的抗性的菌株显示至少50倍，例如至少100倍，例如500倍，优选至少1000倍，更优选至少10000倍或更多倍的pfu/ml降低。使噬菌体受体蛋白基本上失活的方法如上所述，制备如本文所述的菌株是本领域技术人员的常规工作，其中噬菌体受体蛋白是基本上无活性的。通常来说，合适的常规方法可以通过同源重组将合适的dna片段引入或替换到噬菌体受体基因组基因序列中(例如通过使用公众可获得的pghost载体)。如果引入的片段例如包含无义(终止)密码子，那么该基因将会失活，并且lab将会是具有无活性噬菌体受体蛋白的lab。另一种合适的修饰可以是移码突变、缺失、突变或插入。或者，可以将合适的修饰引入相关区域，例如启动子区域。如上所述，对噬菌体受体基因的合适修饰可以是许多事物，例如终止密码子、引起例如移码的插入、缺失、启动子突变、突变等。选择适当策略以例如引入对噬菌体受体基因的合适修饰以便不表达活性噬菌体受体蛋白是技术人员的常规工作。或者，可以随机诱变(例如通过uv辐射或化学诱变)并选择其中噬菌体受体蛋白基本上无活性的突变。还可以选择相关的自发突变，其中噬菌体受体蛋白是基本上无活性的。在优选的实施方案中，噬菌体受体蛋白是无活性的。测定蛋白质失活的方法如上所述，测量噬菌体受体蛋白质无活性的方法是简单地分析细菌对噬菌体的增加的抗性。通常，这可以通过使用标准空斑测定来进行。空斑测定法将目标菌株的噬菌体抗性评估为，给定的噬菌体在目标菌株上可获得的pfu/ml(空斑形成单位/ml)的差异，相比于相同噬菌体在亲本菌株上可获得的pfu/ml。因此，本文所述的乳酸菌可以表征为，其具有对噬菌体的提高的抗性和/或提高的细胞计数稳定性。优选，本文所述的乳酸菌对根据本发明保藏的噬菌体具有提高的抗性。测量蛋白无活性的另一种方法是分析相应的基因序列，看它是否包含引起例如基因失活的合适的修饰。如上文所解释，合适的修饰可以是许多事物，例如终止密码子、引起例如移码的插入、缺失、突变等。(例如通过对基因测序)鉴定基因是否包含这种合适的修饰，对于技术人员是常规的。因此，在优选的实施方案中，本文所述的乳酸菌包含在基因中合适修饰，其中所述修饰导致表达基本上无活性的蛋白。更优选地，所述修饰导致不表达活性蛋白。测量蛋白质的无活性的另一种方法是分析细菌膜上是否存在活性蛋白。这可以通过如本文工作实施例中描述的标准分离方法进行。因此，在优选的实施方案中，如本文所述的乳酸菌在膜上不包含可测量的量的活性蛋白。如本文所用，术语“乳酸菌”表示发酵糖来产生酸的革兰氏阳性微量需氧或厌氧性细菌，所述酸包括乳酸作为主要产生的酸，乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌存在于“乳杆菌目(lactobacillales)”中，其包括本发明两个令人关注的种：副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌。种的实例是：乳球菌属(lactococcusspp.)、链球菌属(streptococcusspp.)、乳杆菌属(lactobacillusspp.)、明串珠菌属(leuconostocspp.)、假明串珠菌属(pseudoleuconostocspp.)、片球菌属(pediococcusspp.)、短杆菌属(brevibacteriumspp.)、肠球菌属(enterococcusspp.)和丙酸杆菌属(propionibacteriumspp.)。通常将包括乳杆菌属之种的乳酸菌作为用于批量起子繁殖的冷冻或冻干培养物或作为所谓的“直投式”(directvatset,dvs)培养物供应给乳制品工业，用于直接接种到发酵容器或桶中用于产生乳产品，例如发酵乳产品。这种培养物通常被称为“起子培养物”或“起子”。在本发明的上下文中，术语“乳基质”可以是可以根据本发明的方法进行发酵的任何未加工的和/或加工的乳材料。因此，有用的乳基质包括但不限于任何乳或包含蛋白质的乳状产品的溶液/悬浮液，例如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉(reconstituedmilkpowder)、炼乳、乳粉(driedmilk)、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或奶油(cream)。显然，乳基质可以来自任何哺乳动物，例如可以是基本上纯的哺乳动物乳，或复原乳粉。优选，乳基质中至少部分蛋白质是天然存在于乳中的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白。然而，部分蛋白质可以是不天然存在于乳中的蛋白质。在发酵之前，可以根据本领域已知的方法将乳底物均质化并巴氏灭菌。术语“乳”应理解为通过对任何哺乳动物例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶获得的乳状分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。该术语乳还包括源于植物的乳，例如豆乳。任选地，将乳酸化，例如，通过加入酸(例如柠檬酸、乙酸或乳酸)，或例如与水混合。乳可以是未加工的或加工的，例如通过过滤、灭菌、巴氏灭菌、均质化等加工，或者它可以是复原乳粉(reconstituteddriedmilk)。根据本发明的“牛乳”的重要实例是巴氏灭菌牛乳。应当理解，在接种细菌之前、期间和/或之后，可以对乳进行酸化、混合或加工。术语“发酵乳饮品”是通过用乳酸菌例如副干酪乳杆菌物种的细菌发酵乳基质而获得的可饮用产品。所述产品可以从杯子或瓶子或通过吸管饮用。例如在发酵后，可以使所述产品均质化。如本文所用，“均质化”是指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在发酵之前进行均质化，则可以进行均质化以将乳脂分解成更小的尺寸，使得它不再与乳分离。这可以通过在高压下迫使牛乳通过小孔来实现。在本发明的方法中的“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。优选地，本发明方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。用于生产发酵乳制品的发酵方法是公知的，并且本领域技术人员将知道如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧、微生物的量和性质以及加工时间。显然，选择发酵条件以支持实现本发明，即获得发酵乳制品。在本发明的上下文中，术语“包装”(合适量的)发酵乳于合适的包装中涉及发酵乳的最终包装，以获得可以被例如一个人或一群人摄取的产品。因此，合适的包装可以是瓶子或类似物，并且合适的量可以是例如10ml至5000ml，但目前优选包装中的量为50ml至1000ml。在本发明的上下文中，术语“突变体”应理解为，通过例如诱变、辐射和/或化学处理和/或选择、适应、筛选等衍生自另一菌株(母株)的菌株。所述术语还包括具有提高或改变的噬菌体抗性的突变体，例如，噬菌体强化的突变体(phagehardenedmutant)，或显示出提高的细胞计数稳定性的突变体。优选突变体是功能等同的突变体，例如，具有与母菌株基本上相同或提高的性质(例如就产率、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体稳健性而言)的突变体。这种突变体是本发明的一部分。特别是，术语“突变体”是指通过使本发明的菌株经受任何常规使用的诱变处理而获得的菌株或指自发发生的突变体，所述常规使用的诱变处理包括用化学诱变剂如甲基磺酸乙酯(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg)的处理、紫外光处理。突变体可能已经经过几次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，然后是筛选/选择步骤)，但目前优选进行不超过1000、不超过100、不超过20、不超过10次或不超过5次处理。在目前优选的突变体中，与母株相比，细菌基因组中小于5％或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸已改变(例如通过取代、插入、缺失或其组合)。在本发明的上下文中，术语“变体”应理解为在功能上等同于本发明菌株的菌株，例如，具有基本相同或提高的性质(例如就粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度、沉淀、益生菌活性和/或噬菌体稳健性而言等)。可以使用适当的筛选技术鉴定的这样的变体是本发明的一部分。在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“a/an(一)”和和“所述(the)”以及类似的指示应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(cotaining)”应解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。不应将说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。在其他方面，本发明可以概括为以下项目：项目1.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，所述菌株对作为dsm32286保藏的噬菌体chpc1256或所述噬菌体的突变体或变体的感染具有抗性。项目2.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其中所述菌株在发酵乳基质中在5摄氏度下储存40天后，保持至少75％的活力(cfu/g)，例如80％、85％、90％或95％的活力。项目3.根据项目2的菌株，其中所述菌株以约109cfu/kg乳的比率接种，并任选地作为单一酸化剂。项目4.根据项目1-3中任一项的菌株，其中所述菌株在基因eps7m中具有突变，所述突变导致所编码蛋白质的结构的变化和/或所述菌株在编码糖基转移酶的基因lcabl_02330中具有突变(例如导致截短)，所述突变导致具有糖基转移酶活性的酶部分或完全失活。项目5.物种副干酪乳杆菌的菌株，所述菌株对噬菌体chpc1256(dsm32286)或该噬菌体的突变体或变体的感染具有抗性。项目6.前一项目的菌株，其已通过将物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的非噬菌体抗性菌株暴露于噬菌体并选择噬菌体抗性突变菌株而获得。项目7.任一前述项目的菌株，其已通过以下方式获得：-使物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的非噬菌体抗性菌株经历诱变；-将物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的突变的菌株暴露于噬菌体；-选择噬菌体抗性突变菌株。项目8.前述项目4-7的菌株，其中所述噬菌体是chcp1256或该噬菌体的突变体或变体。项目9.任一前述项目4-8的菌株，其中所述物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的非噬菌体抗性菌株选自包括以下的组：lc-01(dsm19465)、干酪乳杆菌dg(cncmi-1572)、lpc-37(atccsd5275)、chcc14676(dsm25612)、干酪乳杆菌431(crl431)、atcc55544、副干酪乳杆菌f19、lmg-17806、副干酪乳杆菌副干酪亚种(lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)lp-33、cctccm204012以及cncmi-1518，或这些任一的突变体或变体。项目10.任一前述项目6-9的菌株，其中所述物种副干酪乳杆菌的噬菌体敏感性菌株是lc-01(dsm19465)或其突变体。项目11.通过包括以下步骤的方法可获得的菌株：-使副干酪乳杆菌菌株lc-01(dsm19465)经历诱变；-将突变的菌株暴露于噬菌体chpc1256(dsm32286)；-选择对噬菌体chpc1256具有抗性的菌株。项目12.作为dsm32276保藏的菌株副干酪乳杆菌chcc19845，以及该菌株的突变体或变体。项目13.作为dsm32276保藏的菌株副干酪乳杆菌chcc19845及其具有相同(或基本上相同)或提高的功能性的突变体，所述功能性例如关于噬菌体抗性或沉淀或细胞计数稳定性。项目14.菌株副干酪乳杆菌chcc19845。项目15.菌株副干酪乳杆菌chcc19843，以及该菌株的突变体或变体。项目16.菌株副干酪乳杆菌chcc19844，以及该菌株的突变体或变体项目17.菌株副干酪乳杆菌chcc2115(dsm19465)，以及该菌株的突变体或变体。项目18.噬菌体chpc1256(dsm32286)，以及该噬菌体的突变体或变体。项目19.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，所述菌株在基因eps7m中具有突变，所述突变导致所编码蛋白质的结构的变化。项目20.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其中由基因eps7m编码的蛋白质对于噬菌体感染是基本上无活性的。项目21.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其中对于用作为dsm32286保藏的噬菌体chpc1256或这种噬菌体的突变体或变体的感染，由基因eps7m编码的蛋白质是基本上无活性的。项目22.根据前一项目的菌株，其中所述蛋白质由包含选自由以下组成的组的dna序列的基因表达：(a)seqidno1所示的dna序列；和(b)编码与seqidno2所示多肽序列至少70％相同的多肽的dna序列。项目23.前一项目的菌株，其中所述基本上无活性的蛋白质对于噬菌体感染例如用噬菌体chcp1256的噬菌体感染是功能上无活性的。项目24.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，所述菌株在编码糖基转移酶的基因lcabl_02330中具有突变(例如导致截短)，所述突变导致所述酶部分或完全失活。项目25.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其中由基因lcabl_02330(编码糖基转移酶)编码的蛋白质是基本上无活性的，例如酶促无活性的。项目26.根据前一项目的菌株，其中所述蛋白质由包含选自由以下组成的组的dna序列的基因表达：(a)seqidno3所示的dna序列；和(b)编码与seqidno4所示多肽序列至少70％相同的多肽的dna序列。项目27.前一项目的菌株，其中所述基本上无活性的蛋白质对于噬菌体感染，例如用噬菌体chcp1256的噬菌体感染是功能上无活性的。项目28.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，所述菌株在编码糖基转移酶的基因lcabl_02330中具有突变，并且在基因eps7m中具有突变。项目29.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其中由基因lcabl_02330(编码糖基转移酶)编码的蛋白质和由基因eps7m编码的蛋白质都是基本上无活性的。项目30.前一项目的菌株，其中所述基本上无活性的蛋白质对于噬菌体感染，例如用噬菌体chcp1256的噬菌体感染是功能上无活性的。项目31.任一前述项目的菌株，其中所述蛋白质是无活性的，因为已经将合适的修饰(突变)引入基因中，优选选自由以下组成的组的合适的修饰：终止密码子、例如引起移码的插入、缺失和突变。项目32.任一前述项目的菌株，其中所述菌株属于物种副干酪乳杆菌。项33.前述项目的菌株，其是作为dsm32276保藏的菌株副干酪乳杆菌chcc19845，或其突变体。项目34.任一前述项目的菌株，其中所述菌株的细菌具有对噬菌体的提高的抗性，例如，优选地显示至少50倍，例如至少100倍，例如500倍，优选至少1000倍，更优选至少10000倍或更多倍的空斑形成单位(pfu)/ml的降低。项目35.一种制备物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-使所述菌株(母菌株)的培养物经历诱变；-将突变的菌株暴露于攻击所述母菌株的噬菌体；-选择噬菌体抗性突变体。项目36.一种制备物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株的细胞计数稳定化的突变体的方法，所述方法包括：-使所述菌株(母菌株)的培养物经历诱变；-将突变的菌株暴露于攻击所述母菌株的噬菌体；-选择细胞计数稳定化的突变体。项目37.一种制备物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株的突变体的方法，所述突变体具有比所述母菌株更低的沉淀速率，所述方法包括以下步骤：-使所述菌株(母菌株)的培养物经历诱变；-将突变的菌株暴露于攻击所述母菌株的噬菌体-选择噬菌体抗性突变体。项目38.根据任一前述项目的方法，其中所述母菌株选自由以下各项组成的组：chcc2115(dsm19465)、lc-01(dsm19465)、干酪乳杆菌dg(cncmi-1572)、lpc-37(atccsd5275)、chcc14676(dsm25612)、干酪乳杆菌431(crl431)、atcc55544、副干酪乳杆菌f19、lmg-17806、副干酪乳杆菌副干酪亚种lp-33、cctccm204012以及cncmi-1518，或任何这些的突变体或变体。项目39.根据任一前述项目的方法，其中所述噬菌体选自由chpc1265，以及该噬菌体的突变体或变体组成的组。项目40.一种用于提供副干酪乳杆菌菌株lc-01(dsm19465)的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-使菌株lc-01的培养物进行诱变；-将突变的菌株暴露于攻击lc-01菌株的噬菌体；和-选择噬菌体抗性突变体。项目41.一种用于提供副干酪乳杆菌菌株lc-01(dsm19465)的突变体的方法，所述突变体具有比lc-01更低的沉淀速率，所述方法包括：-使菌株lc-01的培养物经历诱变；-将突变的菌株暴露于攻击lc-01菌株的噬菌体；和-选择噬菌体抗性突变体，和-选择更低沉淀速率的突变体。项目42.一种用于提供物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-使所述菌株(母菌株)的培养物经历诱变；-将突变的菌株暴露于噬菌体chpc1256；-选择噬菌体抗性突变体。项目43.一种用于提供副干酪乳杆菌菌株lc-01(dsm19465)的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-使菌株lc-01的培养物经历诱变；-将突变的菌株暴露于噬菌体chpc1256；-选择噬菌体抗性突变体。项目44.一种用于提供物种副干酪乳杆菌(和/或干酪乳杆菌)的菌株的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-在基因eps7m中引入突变(例如通过基因工程)，所述突变导致蛋白质或cps结构中的变化。项目45.一种用于提供物种副干酪乳杆菌(和/或干酪乳杆菌)的菌株的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-在编码糖基转移酶的基因lcabl_02330中引入突变(例如通过基因工程)，所述突变导致cps结构中的变化。项目46.任一前述项目的方法，其中所述菌株是物种副干酪乳杆菌。项目47.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其可通过任一前述项目的方法获得。项目48.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，其通过任一前述项目的方法获得。项目49.任一前述项目的菌株用于发酵乳基质的用途。项目50.任一项目的菌株作为添加剂例如益生菌添加剂的用途。项目51.细菌培养物，例如起子培养物，其含有至少10e8cfu/g任一前述项目的菌株。项目52.前述项目的细菌培养物，其进一步含有作为稳定剂例如冷冻保护剂起作用的添加剂。项目53.任一前述项目的细菌培养物，其为冷冻或干燥形式，例如冷冻干燥或喷雾干燥形式。项目54.含有任一前述项目的菌株的食品，例如乳制品或奶酪。项目55.含有任一前述项目的菌株的食品，其为奶酪。项目56.含有任一前述项目的菌株的食品，其是发酵乳产品，例如饮用酸奶。项目57.任一前述项目的食品，其含有超过10e8个菌落形成单位的乳酸菌。项目58.任一前述项目的食品，其包装于例如在体积在50ml至1000ml范围的容器中。实施例实施例1：通过诱变制备噬菌体抗性突变体通过用噬菌体chpc1256挑战lc-01的培养物，从副干酪乳杆菌lc-01(chcc2115)分离称为chcc19843、chcc19844和chcc19845的三种噬菌体抗性突变体。在具有10mmcacl2的mrs肉汤培养基中用噬菌体chpc1256以1、0.1或0.01的moi(multiplicityofinfection,感染复数)感染chcc2115，并孵育2-5天，直至在试管中发生生长。将培养物在mrs平板上划线接种，纯化菌落，并通过空斑测定用噬菌体chpc1256重新测试噬菌体抗性。实施例2：测试噬菌体抗体突变体在具有10mmcacl2的mrs平板上以空斑测定测试推定的噬菌体抗性突变体。chcc19843和chcc19844对chpc1256具有抗性，而chcc19845对迄今为止测试的能够攻击母菌株lc-01的所有噬菌体具有抗性。表1.用攻击chcc2115的噬菌体进行的空斑测定的结果。噬菌体滴度以空斑形成单位/ml表示。chpc1054chpc1135chpc1167chpc1259chpc1256chcc21153xe082xe095xe082xe109xe09chcc198434xe071xe081xe082xe09阴性chcc198449xe083xe082xe082xe09阴性chcc19845阴性阴性阴性阴性阴性选择突变菌株chcc19845作为最有希望的菌株，因为令人惊讶地发现该菌株极抗噬菌体攻击。实施例3：对有前景的噬菌体抗性突变体chcc19844和chcc19845进行测序和基因组分析。对突变体chcc19844和chcc19845进行全基因组测序，并将基因组序列与chcc2115的基因组序列进行比较。使用rast程序(使用subsystemtechnology的rastannotation，第2版)进行基因注释。用clc程序(clcbioqiagen)进行突变分析。chcc19844:突变体的基因组分析显示了与来自干酪乳杆菌bl23的eps7m具有同源性的基因中的突变(基因座标签“lcabl_rs01180”，旧基因座标签“lcabl_02360”，bl23的ncbi参考序列：nc_010999.1)。eps7m的基因产物是细胞壁多糖基因簇的一部分。基因比较还显示与“涉及o-抗原和磷壁酸(rfbx)输出的膜蛋白”的同源性。突变是101位的c到t核苷酸互换，导致从氨基酸脯氨酸转变为亮氨酸。基于与涉及cps产生的基因的同源性，显然所鉴定的突变是噬菌体抗性表型的原因。chcc19845:突变体的基因组分析显示了编码糖基转移酶的基因lcabl_02330中的突变。所述基因具有一个核苷酸c(chcc2115的参考基因的202位)的缺失，因此导致截短的糖基转移酶基因。此外，还在与干酪乳杆菌bl23的eps7m具有同源性的基因中存在突变，如也见于chcc19844。所述突变是124位的t至c核苷酸互换，导致氨基酸苯丙氨酸转变为亮氨酸。基于此，eps7m突变在chcc19844和chcc19845中是不同的。eps7m的基因产物是细胞壁多糖基因簇的一部分。基因比较还显示了与“涉及o-抗原和磷壁酸(rfbx)输出的膜蛋白”的同源性。eps7m同源物位于糖基转移酶下游三个基因处。两种突变都位于与chcc19844中所发现的突变相同的区域。基于与涉及cps产生的基因的同源性，显然所鉴定的突变是噬菌体抗性表型的原因。由此可见，chcc2115细胞壁的荚膜多糖(cps)充当所测试的所有副干酪乳杆菌噬菌体的噬菌体受体，并且cps相关基因的失活或修饰导致噬菌体抗性，在chcc19845的情况下抗性极强，因为迄今为止测试的所有噬菌体都受到限制。除了修饰的膜蛋白之外，chcc19845还具有双突变，它还具有截短的糖基转移酶，并且两个突变都位于相同的细胞壁多糖操纵子中。令人惊讶地发现，这个基因簇中的双突变事件导致非凡的噬菌体抗性。实施例4：制造含有噬菌体抗性突变体的乳产品-评估沉淀分别用菌株chcc19843、chcc19844和chcc19845作为单一酸化剂产生发酵的稀释的乳饮品。将添加了4％葡萄糖(90℃，60分钟)的复原脱脂乳(14％)用作为单一酸化剂的菌株接种，并发酵约72小时。之后，将一份发酵过的基质用3份巴氏灭菌糖浆(16％蔗糖)稀释，均质化并冷却至5℃。对于沉淀实验，将指定量的新鲜产物装入turbiscan玻璃管中，并在5℃下储存29天，直至在turbiscan中测量。令人惊讶地发现，与母菌株lc-01相比，在由chcc19845制备的发酵乳产品中观察到显著更低程度的沉淀。这减少了向发酵乳产品中添加稳定剂和/或增稠剂(例如多糖、淀粉、果胶等)的需要。本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人所知的实施本发明的最佳方式。在阅读前述说明后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员来说变得明显。发明人预期熟练的技术人员适当地采用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括迄今为止适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素的所有可能变型的任何组合。实施例5：制造含有噬菌体抗性突变体的乳产品-评估保质期期间的细胞计数通过各自以0.0025％(＝0.25×106cfu/g乳)、0.005％(＝0.5×106cfu/g乳)和0.01％(＝1×106cfu/g乳)的比率接种的菌株chcc19845及其相应的野生型来生产发酵的稀释的乳饮品。将添加了4％葡萄糖(90℃，60分钟)的复原脱脂乳(14％)用作为单一酸化剂的chcc19845或其相应的野生型接种，并发酵约72小时。之后，将一份已发酵的基质用3份巴氏灭菌糖浆(16％蔗糖)稀释，均质化并冷却至5℃。将产物在5℃下储存40天。在第1天、第21天和第40天，使用倾注培养法在mrs-琼脂ph6.5difco上测定细胞计数。将平板在37℃下厌氧培养3天。之后，计数菌落形成单位。观察到，与由野生型制成的产品相比，由chcc19845制成的发酵乳产品在保质期内的细胞计数在40天内是稳定的。如图3所示，衍生chcc19845的lc-01显示细胞计数随时间下降的明显趋势，而chcc19845突变体显示随时间每克更恒定的细胞计数。附图说明图1：高度澄清区的turbiscan测量结果，单位为mm。澄清区的高度表示沉淀程度。澄清区越小，看到的沉淀越少。图2：turbiscan试管中的复样。已经可以在管中看出用参考lc-01(chcc2115)生产的产品比用chcc19845生产的产品具有更大的澄清区。这表明用chcc19845的产品的沉淀程度更低。图3：与由野生型制成的产品相比，由chcc19845制成的发酵乳产品在保质期期间的细胞计数在40天内是稳定的。衍生chcc19845的lc-01(右侧的柱)显示出细胞计数随时间下降的明显趋势，而chcc19845突变体显示出随着时间每克更高的细胞计数稳定性。保藏和专家方案副干酪乳杆菌副干酪亚种(lactobacillusparacaseissp.paracasei)chcc19845菌株于2016年3月17日保藏于莱布尼茨研究所dsmz-德国微生物保藏中心(leibnizinstitutedsmz–germancollectionofmicroorganismsandcellcultures),德国布伦瑞克因霍芬街7bd-38124(inhoffenstr.7b,d-38124braunschweig)，给予的保藏号为dsm32276。噬菌体chpc1256也于2016年3月17日保藏于dsmz，给予的保藏号为dsm32286。母菌株lc-01(chcc2115)于2007年6月27日保藏于dsmz，给予的保藏号为dsm19465。根据国际上承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保藏。申请人要求保藏的微生物样品应当仅供申请人批准的专家使用。序列表seqidno.1:基因座chcc2115_eps7m1461bpdnaseqidno.2:基因座chcc2115_eps7m_p487aaseqidno.3:基因座chcc2115_糖基转移酶885bpdnaseqidno.4:基因座chcc2115_糖基转移酶_p295aa参考文献本专利文件引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。序列表<110>科.汉森有限公司<120>噬菌体增强的乳酸菌<130>p5902pc00<160>4<170>bissap1.3.6<210>1<211>1461<212>dna<213>乳杆菌属（lactobacillus）<400>1atgcaagttttggagatttttatgaaagtaatcaagaactttttttggaatgcgggttat60caggtcttcgtcctgattgtgccgctggtaactgtaccttatattaatcgagtactagga120ccgacaggcgttgggataaatgcgttcactaactcaattgtccaatactttattctcttt180ggtagtctgggtattaacctttatgggaatcggggcacagcttatcgaagagatgatcga240aaagcgctgaccacctatttttgggaagtcaccatacttcgatttgtgacgattggtata300gctgtgcttgcgtatctcatgtttatatttgccgtcgatgagtatcgtgttttttatctt360gctcaaggcgttatgcttttgggaacagcgtttgatatttcgtggtttttccaaggatta420gaaaactttcgggtaacggtggttcgtaatgtgttggtgcggatcgcttccctcattctg480attttcctgttagtgcataaagcagatgatactgctttgtatattctgatcatgtctggc540tcacagatgttggggaatctaacattctggccctcattacgcgcaaatctgacacatttt600ccgaaactgtcaagcctgaacatctggcagcatattaaaccggcgttccttctattgatt660ccgcaactggcgattcaaatttatgttcaactgaataaaacgatgcttggaattttacag720ggtgttacggcatctggtttttacgaaagttcggacaaaatcattaaaatgttattggct780cttgtgacagcaaccggcaccgtcttattgccgcatgtggcccattattttgcccaaggt840gatcacgatgccgtcaaacgctcattagaaacatcgatgcacgtgattttggttattgct900tttcctttagcctttgggattgcggcggtttccacaacgtttacttattatttttttagc960acaaagtttatgcccgtggcacccttgatggcagctgaagcgattgtcgtcattccgatt1020tcgattgcgagtgccattggtgtgcaatatttgctgccaactaaccaagttaagtcatat1080actgtctcagttattttgggatccatcgttaatattgtagtgaatgtgcctcttattctg1140tggttaggaacaatgggcgctgtgattggcactatcctttctgaatcagtcgtgacgatt1200tatcaggtctatgctattaaaaatcagcttgatctcagaggcttgtttagtgaatcatgg1260aagtattgcctcagcgcggtcgtgatgtttggtgttgtaaaaggtcttgagattgcctgg1320tccaccagcttgatcggcctagttgttgaagttttgattggtatggtggtgtactttgtg1380gtgctgttggggttacgaccgcacattatcattgggtatgttcgcccatatgtcgatcag1440atgcgtcggcgtcttcgttaa1461<210>2<211>486<212>prt<213>乳杆菌属（lactobacillus）<400>2metglnvalleugluilephemetlysvalilelysasnphephetrp151015asnalaglytyrglnvalphevalleuilevalproleuvalthrval202530protyrileasnargvalleuglyprothrglyvalglyileasnala354045phethrasnserilevalglntyrpheileleupheglyserleugly505560ileasnleutyrglyasnargglythralatyrargargaspasparg65707580lysalaleuthrthrtyrphetrpgluvalthrileleuargpheval859095thrileglyilealavalleualatyrleumetpheilephealaval100105110aspglutyrargvalphetyrleualaglnglyvalmetleuleugly115120125thralapheaspilesertrpphepheglnglyleugluasnphearg130135140valthrvalvalargasnvalleuvalargilealaserleuileleu145150155160ilepheleuleuvalhislysalaaspaspthralaleutyrileleu165170175ilemetserglyserglnmetleuglyasnleuthrphetrpproser180185190leuargalaasnleuthrhispheprolysleuserserleuasnile195200205trpglnhisilelysproalapheleuleuleuileproglnleuala210215220ileglniletyrvalglnleuasnlysthrmetleuglyileleugln225230235240glyvalthralaserglyphetyrgluserserasplysileilelys245250255metleuleualaleuvalthralathrglythrvalleuleuprohis260265270valalahistyrphealaglnglyasphisaspalavallysargser275280285leugluthrsermethisvalileleuvalilealapheproleuala290295300pheglyilealaalavalserthrthrphethrtyrtyrphepheser305310315320thrlysphemetprovalalaproleumetalaalaglualaileval325330335valileproileserilealaseralaileglyvalglntyrleuleu340345350prothrasnglnvallyssertyrthrvalservalileleuglyser355360365ilevalasnilevalvalasnvalproleuileleutrpleuglythr370375380metglyalavalileglythrileleusergluservalvalthrile385390395400tyrglnvaltyralailelysasnglnleuaspleuargglyleuphe405410415serglusertrplystyrcysleuseralavalvalmetpheglyval420425430vallysglyleugluilealatrpserthrserleuileglyleuval435440445valgluvalleuileglymetvalvaltyrphevalvalleuleugly450455460leuargprohisileileileglytyrvalargprotyrvalaspgln465470475480metargargargleuarg485<210>3<211>885<212>dna<213>乳杆菌属（lactobacillus）<400>3atggtcaaagtttcaatcattattcctgcttacaatgctgctaccactctaaagcgcgct60gttcagtctgtccgtaaacaaaccttgaacgattttgaaatattaatcgtcaataatgga120tcgacggatcagacagcagcagttatgtcacaccttgtccaagctgaccctcggatacac180attctgcaaagtatgaaagggcgcagccgcgctcgtaatcaaggactgacaaaggctcaa240ggtacttttatccagtttctggacgcggatgacgaacttgctgtcaataagctggaagtg300ggcagcagttatttgacgaatcatccaaacagtagcgcatacatcacggcggctaaatat360caaaatgataagcgtggcgatgagagcattcgccagattccgctaacatccgcagcacct420ttattaaaggcaaattatttgccaatgagtgcaccgcttgtgaggaaaagtgcgctcata480aagccctttagagaagatcttgaatataatgaggactggttattttgggctgaaaacctg540tacaaaaaagagatagctgttagctcgacagttggcacaacgatccatattacgtctgct600aatactatgactcagtttgatcgaatgcaaatgtacgagtgttatgtgcggggaatttta660aaagaagaattttcggcacgcggtcctcgctactgggcgcgggatatgcgctatgcactc720aattatctacttagcgcgtcggatgcaacgagcgaggacctgaagctatctaagacaatg780gcttggccaatccggtttagccgtctattattagctgtgccaccgttgcgagcggttatt840acaaaaaaacgtaatgccgtgaaagcgcgtagtcaatatggataa885<210>4<211>294<212>prt<213>乳杆菌属（lactobacillus）<400>4metvallysvalserileileileproalatyrasnalaalathrthr151015leulysargalavalglnservalarglysglnthrleuasnaspphe202530gluileleuilevalasnasnglyserthraspglnthralaalaval354045metserhisleuvalglnalaaspproargilehisileleuglnser505560metlysglyargserargalaargasnglnglyleuthrlysalagln65707580glythrpheileglnpheleuaspalaaspaspgluleualavalasn859095lysleugluvalglysersertyrleuthrasnhisproasnserser100105110alatyrilethralaalalystyrglnasnasplysargglyaspglu115120125serileargglnileproleuthrseralaalaproleuleulysala130135140asntyrleuprometseralaproleuvalarglysseralaleuile145150155160lysprophearggluaspleuglutyrasngluasptrpleuphetrp165170175alagluasnleutyrlyslysgluilealavalserserthrvalgly180185190thrthrilehisilethrseralaasnthrmetthrglnpheasparg195200205metglnmettyrglucystyrvalargglyileleulysglugluphe210215220seralaargglyproargtyrtrpalaargaspmetargtyralaleu225230235240asntyrleuleuseralaseraspalathrsergluaspleulysleu245250255serlysthrmetalatrpproileargpheserargleuleuleuala260265270valproproleuargalavalilethrlyslysargasnalavallys275280285alaargserglntyrgly290pct/ro/134表当前第1页12