防护空气污染的不良影响的水溶性番茄提取物的制作方法

本发明涉及水溶性番茄提取物(“wste”)用以防护空气污染对人体的心血管系统的不良影响的用途。

背景技术：

空气污染以多种形式存在。一种常见的污染类型被称为“颗粒空气污染”，其包括烟灰、气体以及微小颗粒形式的其它物质(被称为“可吸入颗粒物”)形式的污染。可吸入颗粒物被按尺寸分类，例如10或2.5微米以下的空气动力学直径(分别为pm10或pm2.5)，或者被分为纳米颗粒(小于100nm直径，或pm0.1)。这些颗粒常常来自汽车排放物，特别是柴油机燃料，或者来自柴油动力的机器。

已经示出颗粒物能够进入血流并诱发细胞毒性的以及发炎性的响应，并且在暴露于柴油机排放物与心血管疾病之间存在公认的联系。然而，这如何实现的真实机理仍然未被完全了解。请参见solomon等人2013j.thrombhaemost11:325-34；tabor等人2016particleandfibretoxicology13:6doi10.1186/s12989-016-0116-x；lucking等人2008europeanheartj29:3043-3051；以及hunter等人2014particleandfibretechnology11:62doi10.1186/s12989-014-0062.4。

空气污染是颗粒物(pm)和气体组分的混合物。大量研究示出暴露于pm空气污染对心血管健康具有不良影响(miller等人2012，pope等人2015)。血小板活性/反应活性与增加的心血管疾病——尤其是血栓形成——风险相关，并且还会促进动脉硬化症的发展。血小板活性/反应活性可以被空气污染而显著提高几倍。因此，已经示出pm通过提高的血小板活化促进动脉血栓形成和动脉粥样硬化。

不是所有的抗血小板聚集剂通过相同的路径发挥作用，抗聚集剂也不是对所有的聚集刺激均产生响应。例如，氯吡格雷(clopidrogel，一种用于动脉硬化症的心血管并发症的二级预防中的抗聚集药物)可以抑制腺苷5’-二磷酸盐(adp)-诱导的血小板聚集但不可以抑制骨胶原或凝血酶所诱导的血小板聚集。(请参见weber等人1999britishj.pharmacology126：415-420)。pm除了通过生理学机理(例如，氧自由基-诱导的聚集中所见的机理)刺激血小板聚集之外还可以通过物理学机理刺激血小板聚集。

已经描述不含番茄烯的水溶性番茄提取物；请参见，例如wo2010/049707；wo10/049709以及wo99/55350(这些专利申请的申请人均为provexisnaturalproducts,ltd)。它们可由dsmnutritionalproducts,瑞士以注册商标fruitflow和fruitflow2市售得到。它们已经被描述为具有抗血小板聚集能力，这被认为是由于在提取物中存在核苷和其它活性剂，例如腺苷、咖啡酸衍生物(咖啡单宁酸)以及类黄酮(例如芸香苷和槲皮素-3,4-苷)。

期望具有一种能够有助于改善颗粒空气污染的影响的安全的、有效的营养品(nutraceutical)、食品或食品增补剂、营养品或药物。

技术实现要素：

根据本发明，已发现水溶性番茄提取物可以保护心血管系统受到由于暴露于颗粒空气污染而带来的不良影响。因此，本发明涉及水溶性番茄提取物(wste)用于维持健康的心血管系统、和/或防止由于与空气污染颗粒物的相互作用所带来的血小板聚集的用途。

根据本发明的第一方面，提供了一种包含水溶性番茄提取物的组合物，其用于在暴露于颗粒空气污染或者处于暴露于颗粒空气污染的风险中的受试者中维持心血管健康、减少心血管健康问题发展的风险或者降低既有心血管健康问题恶化的可能性。

根据本发明的另一方面，提供了一种在暴露于颗粒空气污染或者处于暴露于颗粒空气污染的风险中的受试者中维持心血管健康、减少心血管健康问题发展的风险或者降低既有心血管健康问题恶化的可能性的方法，其包括：在暴露于空气污染颗粒物之前或者在暴露于空气污染颗粒物的同时，向人施用保护量的水溶性番茄提取物。

本发明的另一方面提供了wste用于制备用于在暴露于颗粒空气污染或者处于暴露于颗粒空气污染的风险中的受试者中维持心血管健康、减少心血管健康问题发展的风险或者降低既有心血管健康问题恶化的可能性的药物、营养品、食品增补剂或食品中的用途。

本发明的另一方面提供了包含药物、营养品、食品增补剂或食品的剂型，其含有有效量的用于防护颗粒空气污染的不良影响的wste。

发明人相信wste对于维持心血管健康有效，因为如下所述wste降低或者最小化暴露于颗粒空气污染的受试者中血小板聚集的风险。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种降低或者最小化暴露于颗粒空气污染的受试者中血小板聚集的风险的方法，其包括：在暴露于颗粒空气污染之前或者在暴露于颗粒空气污染期间，向所述受试者施用有效量的wste。

附图说明

图1示出了fruitflow对于颗粒物所诱发的聚集的量(最大聚集％)的效果。细节记载于实施例中。

图2示出了fruitflow对于颗粒物和adp(腺苷二磷酸盐)所诱发的聚集的量(最大聚集％)的效果。

具体实施方式

定义

如本申请说明书和权利要求书中所用的，适用以下定义：

水溶性番茄提取物(“wste”)：本发明中所用的wtse具有以下特性：

·其在室温(即25℃)下是水溶性的。在优选的实施方案中，所述提取物在较低温度(例如15℃、10℃或甚至低至4℃，尽管可能需要在更长的一段时间内更多地搅拌)下也是可溶性的。所述wste基本上不含番茄烯，或者仅包含可忽略量(少于0.5％干重，优选少于0.1％干重)的番茄烯。

·其基本上不含水不溶性颗粒物(即，少于0.1％干重、优选少于0.01％干重的颗粒物)。

·其可为液体形式的或干燥形式的。在一些形式中，例如在干提取物fruitflow2中，已除去了糖，并且所述提取物已经浓缩。

颗粒空气污染：这是包含被分类为纳米颗粒或者具有pm2.5或更小的颗粒尺寸的颗粒的空气污染。这些尺寸的颗粒可以是“天然源”例如火山喷发、沙尘暴、森林火灾、来自草原火灾的烟等的结果，或者是人类活动例如汽车排放、制造业排放或其它活动(包括抽烟)的结果。

心血管健康：该术语被定义为与不想要的血小板聚集有关的状况，例如：关节硬化(arthrosclerosis)、心肌梗死、中风、血栓形成、外周性动脉疾病或者脑血流量减少，并且还包括糖尿病(1型或2型)及其相关的心血管问题。

健康的人——为了本发明目的，健康的人尚未被诊断为具有任何心血管健康问题，而且也不知道具有任何心血管健康问题，所述心血管健康问题与不想要的血小板聚集、关节硬化、心肌梗死、中风、血栓形成、外周性动脉疾病、脑血流量减少或者糖尿病(1型或2型)有关。

优选的组合物

优选的wste包括基本上不含番茄烯、基本上热稳定且含水溶性化合物的番茄提取物，其中所述水溶性化合物具有防止血小板聚集的活性并且具有小于1000道尔顿的分子量。

优选地，wste包含选自以下的具有防止血小板聚集的活性的水溶性化合物中的一种、一些或每一种：

(a)糖基化的酚酸或者酚酯，或者其衍生物；

(b)糖基化的类黄酮；以及

(c)核苷。

优选本发明所用的wste为wo2010/049707中所记载的番茄提取物。优选地，wste根据wo2010/049707中所记载的方法制备。例如，在一些实施方案中，wste可根据wo2010/049707的附图2或4中所记载的方法制备。

在一种实施方案中，wste为糖浆形式的液体。

优选的提取物具有＜0.8au的褐变指数、4.0至4.3的ph以及1.15至1.20的密度，并且可通过以下步骤制备：

(a)制备均化番茄的起始混合物；

(b)将水溶性馏分与果实固体分离；

(c)过滤所述水溶性馏分以制备基本上不含番茄烯的提取物；以及

(d)使用蒸发仪在过滤渗透物中浓缩具有防止血小板聚集的活性的水溶性化合物。

在另一实施方案中，可以从提取物中除去糖。优选所述提取物包含<1％糖，且包含>95％的具有防止血小板聚集的活性的水溶性化合物，其中所述水溶性化合物包含在所述wste所衍生自的均化番茄的起始混合物中。所述提取物可以为浓缩的水溶液形式，或者优选为粉末形式。在最优选的实施方案中，所述提取物可通过以下步骤制备：

(a)制备均化番茄果实的起始混合物，其中所述起始混合物的ph不超过ph5.5，所述起始混合物的保持温度不超过35℃并且所述起始混合物经水稀释使得其包含少于33％的固体；

(b)将水溶性馏分通过不使所述馏分的温度升至60℃以上的步骤与果实固体分离；

(c)过滤所述水溶性馏分；

(d)从所述经过滤的水溶性馏分中除去游离糖；以及

(e)通过不使所述馏分的温度升至60℃以上的步骤浓缩具有防止血小板聚集的活性的水溶性化合物。

在步骤(e)之后，提取物可以为包含<1％糖且包含>95％的具有防止血小板聚集的活性的水溶性化合物的浓缩水溶液，其中所述水溶性化合物包含在起始混合物中。可将所述水溶液进一步脱水以形成粉末。

在一些实施方案中，所述wste可以在一种包含对人类健康有益的其它分子的组合物中提供。例如，所述组合物还可包含硝酸盐或者氮氧化物的前体。所述硝酸盐优选来自膳食硝酸盐的来源(例如，仅仅示例性地，来自瑞士甜菜、火箭菜(rocket)、菠菜、大黄、草莓或莴苣的水溶性提取物)。所述组合物还可包含叶酸或其代谢物(例如，5-甲氧基四氢叶酸或四氢叶酸)。优选的包含叶酸或其代谢物以及/或者硝酸盐的根据本发明使用的组合物记载于wo2014/102546中。

受益于wste治疗的受试者优选为人类受试者。发明人已发现健康的人和具有既往心血管病症的那些人如果处于暴露于颗粒空气污染的风险中可受益于服用wste。

用于健康的人中的用途

在一些实施方案中，人为健康的人。在其中人在暴露于空气污染之前摄取本发明的wste的优选实施方案中，所述摄取至少在所述暴露之前30分钟至1小时发生。在特别优选的实施方案中，所述摄取至少在所述暴露之前2小时或者至少在所述暴露之前3小时发生，以确保已摄取包含wste的食品或食品增补剂，或者确保wste活性成分已以其最佳水平进入循环系统。在其中空气污染以持续事件(即，空气污染持续一天以上)发生的区域，应在第一次事件之前服用wste，并且在空气污染事件期间至少每日服用wste。在其它实施方案中，在其中空气污染事件很可能发生的年度部分期间至少每日服用wste。

本发明的另一实施方案为一种暴露于颗粒空气污染的受试者中维持健康的血流量或者最小化血小板聚集的风险的方法，所述方法包括：在暴露于颗粒空气污染之前或在暴露于颗粒空气污染期间，向处于暴露风险中的人施用有效量的wste。

在本发明的另一方面中，处于风险中的人一般享受良好的心血管健康，即不具有与心血管健康有关的已知问题。

本发明的另一实施方案为wste用以在处于暴露于颗粒物型空气污染的风险的健康人中非治疗性地维持健康血流量的用途。非治疗的结果的实例包括：减少由于皮肤护理问题而显得年纪较大(特别是皱纹或者皮肤硬化)的风险，以及/或者维持一般的良好状态和由于良好的血液循环而带来的能量平衡。

本发明的wste的其它用途包括：

在空气污染的存在下维持健康的血小板功能；

在空气污染的存在下维持健康的血液循环和血流量；

在颗粒物空气污染的存在下降低不利的心血管病症例如动脉粥样硬化症、或血栓形成的风险；

降低当暴露于颗粒物时心血管疾病的严重性；以及

降低空气污染环境中心血管以及呼吸性疾病的风险。

已患有心血管疾病的人中的用途

还已令人惊奇地发现wste示出了在腺苷二磷酸盐(adp)和pm同时存在的情况下协同的抗血小板聚集效果。adp——一种储存在血小板中的天然血小板激动剂——在血小板活化时释放；并且其诱导血小板聚集的强烈引发。pm一般而言还强烈地诱导血小板聚集，并且还进一步促进由adp诱导的血小板聚集。adp加上pm的组合诱导了比由adp或pm单独诱导的各自血小板活化响应的总和更强烈的血小板活化响应。如实施例中更详细地所示的，我们发现wste抑制由空气污染中所存在的pm诱导的血小板活性，并且令人惊奇地其还抑制当由pm的存在所促进时的adp所诱导的血小板聚集。

因此，本发明的wste，如果需要，也可以用于具有心血管健康问题或糖尿病历史的人群中，所述人群因此具有其循环血液中所存在的adp，而且也处于暴露于颗粒空气污染的风险中。因此，本发明的另一实施方案为一种具有心血管健康问题历史并且暴露于颗粒空气污染或者处于暴露于颗粒空气污染的风险中的人中维持心血管健康的方法，所述方法包括：在暴露于颗粒空气污染之前或在暴露于颗粒空气污染期间，向所述人给用有效量的wste提取物。

本发明的另一方面为wste用以防止使用者受到空气污染——优选颗粒物空气污染——的有害心血管影响的用途。暴露于所述空气污染或者处于暴露于所述空气污染的风险中的人可以摄取wste，并从而防止其自身遭受与空气污染有关的心血管问题。

本发明的另一方面为一种降低与颗粒空气污染所诱导的心血管聚集有关的心血管健康问题的风险的方法，所述方法包括向处于暴露于颗粒空气污染的风险中的人施用wste。

本发明的另一方面为水溶性番茄提取物用于制备能够在暴露于颗粒空气污染或者处于暴露于颗粒空气污染的风险中的受试者中维持心血管健康、减少心血管健康问题发展的风险或者降低既有心血管健康问题恶化的可能性的药物或营养品的用途。

剂量和制剂

剂量：

番茄提取物：优选地，使用2(粉末形式)，尽管如果想要制剂为液体的话fruitflow1(液体形式)可能为优选的。wste的量应为25至300mg/天，优选75至200mg/天，更优选125至175mg/天。在一些实施方案中，受试者可消耗100或150mg/天。上述量可以一天一次单剂量服用，或者可以一天一次以上(即，每天2或3次)服用部分剂量从而消耗全剂量。根据本发明的优选剂型包含25至300mgwste，优选75至200mgwste，并且更优选125至175mgwste。

给药的时机：优选在暴露于空气污染事件之前，优选至少在暴露于空气污染事件之前2至3小时，消耗wste，从而使得wtse被合适地代谢并且在所述暴露之前在循环系统中可利用。在其它实施方案中，摄取至少在所述暴露之前30分钟至1小时发生。在其中空气污染以持续事件(即，空气污染持续一天以上)发生的区域中，应在第一事件之前服用wste，并且在空气污染事件期间至少每日服用wste。在其它实施方案中，在空气污染事件很可能发生的年度部分期间至少每日服用wste。

形式

在一种实施方案中，本发明的组合物可以为营养品形式。本文中所用的术语“营养的”表示在营养品和药物应用领域中均可用。因此，包含wste的营养组合物可用作食品和饮料的增补剂，而且可以用作用于肠内或肠胃外给药的药物制剂，所述药物制剂可以为固体制剂，例如胶囊或片剂，或者液体制剂，例如溶液或悬浮液。

本发明的wste营养组合物可进一步包含保护性亲水胶体(例如，树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁-壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填料、辅助化合物(co-compound)、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、味道掩蔽剂、增重剂、胶凝剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗微生物剂。

本发明的营养组合物可以为适合于向人体给用的包含常规载体材料的任何盖仑制剂(galenic)口服形式，例如固体形式，如食品、食品预混合物、强化食品(用的添加剂/增补剂)、片剂、丸剂、颗粒、糖衣药丸、胶囊剂和泡腾制剂(例如粉末和片剂)，或者液体形式，如溶液、乳液或悬浮液(例如饮料、膏体和油状悬浮液)。可以将膏体纳入硬的或软的壳胶囊，由此所述胶囊以例如衍生自动物的凝胶、植物蛋白质或木质素磺酸盐的基质为特征。

如果营养组合物为药物制剂，则所述组合物进一步包含药物可接受的赋形剂、稀释剂或助剂。可以使用标准技术用于其配制，如例如remington’spharmaceuticalsciences，第20版，williams&wilkins，pa,usa中所公开的。对于口服给用，优选使用包含合适的粘合剂(例如明胶或聚乙烯基吡咯烷酮)、合适的填料(例如乳糖或淀粉)、合适的润滑剂(例如硬脂酸镁)以及任选的其它添加剂的片剂和胶囊剂。

在一些实施方案中，可对组合物进行配制用于作为食品或饮品消耗。所述食品或饮品的实例为乳制品，包括例如人造黄油、面包涂抹物(spread)、酥油、芝士、酸奶或牛奶饮品。

可用wste强化的食品的其它实例包括面包、谷物棒、面包房物品(bakeryitem)如蛋糕和曲奇、以及薯条或薯片。

饮料涵盖非酒精饮品和酒精饮品以及待加入到饮用水和液体食品中的液体配制物。非酒精饮品为例如软饮品、运动饮品、果汁、柠檬水、茶和牛奶基饮品。液体食品为例如汤和乳制品。

可将含wste的营养组合物加入到软饮品、能量棒或糖果中。

给出了非限制性实施例以进一步示例本发明。

实施例

实施例1

试剂：柴油颗粒物(工业铲车(industrialforklift)，srm2975)来自美国国家标准和技术协会(nationalinstituteofstandardsandtechnology,gaithersburg,md,usa)。腺苷二磷酸盐(adp)、二甲亚砜(dmso)和二氧化钛(iv)(tio2)锐钛矿来自sigma(saint-louis，mo)。磷酸缓冲盐水(pbs)来自invitrogen(carlsbad，ca)。

柴油颗粒物和tio2的制备：将颗粒悬浮于dmso中并将其在超声波水浴中进行超声波处理5分钟以使得聚集最小化。在使用之前将它们以合适的浓度在pbs中稀释。

血小板聚集测量：将来自健康的人类志愿者的血液通过针头采集到柠檬酸钠管(sarstedt，nuembrecht，germany)中。富含血小板的血浆(prp)通过在37℃下离心150g柠檬酸盐血液15分钟而获得。将prp转移到塑料管中并在37℃下静置。将剩余的血液在37℃下以2000g离心15分钟以获得血小板贫瘠的血浆(ppp)。使用sysmex细胞计数器(norderstedt，germany)确定血小板计数，并将prp中的血小板数目用自体ppp调节至3×10⁸个血小板/ml。在刺激之前，将prp在37℃下用2(86μg/ml)或pbs培育10分钟。将prp悬浮液用adp(2.5μm)、柴油颗粒物(50μg/ml)或tio2(50μg/ml)在存在或不存在的情况下刺激，并且将血小板聚集用血小板聚集计(apact4004，labitec，ahrensburg，germany)在37℃、搅拌条件下监测10分钟。使用ppp以确定基线(100％聚集)。因为颗粒可能影响光透射，所以使用具有柴油颗粒物(50μg/ml)或tio2(50μg/ml)的ppp作为在相应柴油颗粒物或tio2的存在下的基线。将血小板聚集作为聚集曲线(auc)下面的面积以及作为最大聚集％(max％aggr.)定量。

结果

adp为储存在血小板中的天然血小板激动剂并在血小板活化时释放；其诱导了血小板聚集的强烈引发。柴油颗粒物(pm)也强烈诱导了血小板聚集。相比之下，未经污染的tio2颗粒并未以相当的浓度诱导显著聚集。此外，pm进一步促进了adp所诱导的血小板聚集。adp加上pm的组合诱导了比由adp或pm单独所诱导的各个血小板活化响应的总和更强烈的血小板活化响应。

令人感兴趣的是，也能够抑制由pm诱导的血小板聚集。因此，在的存在下，聚集曲线下面积(auc)从18606显著下降30％至13079，并且最大聚集％(max％aggr.)从37％显著下降28％至27％(表1和图1)。最后，adp和pm的组合所促进的血小板聚集被强烈抑制。聚集曲线下面积(auc)从55622显著下降36％至35511。在的存在下，最大聚集％(max％aggr.)从101％显著下降35％至66％(表1和图2)。

表1：对由空气污染颗粒物所诱导的血小板聚集的效果

所有值均为平均值±sd。adp，腺苷二磷酸盐。pm，颗粒物。ff，auc，聚集曲线下面积。max％aggr.，最大聚集％。

*p＜0.05与未接受ff的各自处理(例如，adp对adp+ff，pm对pm+ff，pm+adp对pm+adp+ff)存在显著差异。

结论

抑制由空气污染中所存在的pm所诱导的血小板活性。此外，还抑制当由pm的存在促进时adp诱导的血小板聚集。

因此，减少了促进动脉血栓形成、动脉粥样硬化和其它心血管疾病的pm所诱导的血小板活化。可特别用于由于紧张所导致的已经升高的血小板反应活性的情况下。而且，wtse可用于具有既有疾病例如糖尿病或心血管疾病的人中，因为在紧张病症和疾病下释放的天然血小板激动剂(例如adp)所提高的血小板反应活性被空气污染物(例如pm)进一步促进，并且可以被抑制，例如减少pm所诱导的心血管事件的风险。总之，能够降低pm对于心血管系统的有害影响。