阴香提取物、提取方法及该提取物作为质子泵下调剂、酶抑制剂和粘膜保护剂的应用的制作方法
阴香提取物、提取方法及该提取物作为质子泵下调剂、酶抑制剂和粘膜保护剂的应用的制作方法
【专利摘要】涉及其提取方法及其生物活性的阴香（Cinnamomum?burmanii）提取物和/或馏分（DLBS2411）通过给予粘膜保护和下调H+/K+ATP酶而显示抗溃疡活性。用DLBS2411处理降低了HEK293和胃壁细胞中H+/K+ATP酶的mRNA水平。此外，DLBS2411抑制了H+/K+ATP酶的胃酶活性，其中pH影响该抑制机理。DLBS2411还具有通过随特定剂量增加而提高的还原能力所显示的作为抗氧化剂的特性。
【专利说明】阴香提取物、提取方法及该提取物作为质子泵下调剂、酶抑制剂和粘膜保护剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及阴香(Cinnamomum burmanii)植物的提取物,就本发明的目的而言该提取物指DLBS2411，本发明还包括提取方法以及所述提取物作为抗溃疡剂的生物活性，该生物活性包括下调质子泵H+/K+ATP酶、抑制酶和给予粘膜保护。用DLBS2411处理能够降低HVK+ATP酶在HEK293和胃壁细胞中mRNA的表达。此外，DLBS2411抑制了胃酶H+/K+ATP酶的活性，其中，该抑制受PH的影响。此外，DLBS2411还具有通过随特定浓度增加而提高的还原能力所显示的抗氧化剂活性。
【背景技术】
[0002]胃病是世界上高度流行的疾病，其包括消化不良、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃食管返流疾病(GERD)、喉咽反流(LPR)、佐林格-埃利森综合征，以及长期使用药物引起的疾病。通常，这是由促进胃酸过量产生的质子泵的提高的活性引起的，并导致胃痛。在胃酸分泌过程中在质子泵作用的酶已知为H+/K+ATP酶。这种酶结合于胃壁细胞中的顶膜(apicalmembrane)。抑制产生酸的胃壁细胞中的质子泵被认为是减少胃酸的有效方法，通过在mRNA表达水平和H+/K+ATP酶的酶活性的胃酸分泌物的减少所显示。H+/K+ATP酶基因不仅在胃壁细胞中还在肝和肠细胞中表达。
[0003]目前，市场上有几种可购的通过抑制质子泵而作用的药物，例如奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑和埃索美拉唑。然而，仍需要具有低副反应的抑制上述质子泵的新药研究成果，一个可能性来自天然物质，例如阴香。
[0004]在本发明中，DLBS2411阴香提取物的效果作为包括其在下调质子泵H+/K+ATP酶中的活性的抗溃疡药物和作为酶抑制剂而得到研究，该效果通过通过H+/K+ATP酶基因表达和该酶的活性降低所显示。在本发明之前，还没有任何研究阐述本发明所主张的DLBS2411阴香提取物。
【发明内容】
[0005]本发明提供的目的和/或方案将以优选的实施方式给出。所述的实施方式用于理解本发明的目的，而不限制其它实施方式在变化和/或组合和/改进中的可能性，这些可从本发明的实施践中得到。本发明教导的目的和/或方案将由本文的权利要求中详述的要素和组合实现。
[0006]为得到上述方案并与本发明的目的一致，如在实施方式中阐释并在本申请中大体说明的，本发明的第一方面涉及以用作抗溃疡药物的有效量或剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组。
[0007]本发明的第二方面涉及以在用作H+/K+ATP酶下调剂、酶抑制剂和粘膜保护剂的有效量或剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组。[0008]本发明的第三方面涉及用作但不限于抗溃疡的药物组合物，包含(I)以有效量或剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组，和(2)药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂。
[0009]本发明的第四方面涉及用作但不限于抗溃疡的药物组合物或制剂，包含(I)以有效剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组，和(2)药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂，由此将所述药物组合物或制剂以无菌或未灭菌的形式生产为固体、半固体或液体。
[0010]本发明的第五方面涉及用作但不限于抗溃疡的促进健康的食物和饮料产品，包含以有效剂量作为单独活性成分或在组合中的阴香的提取物，或者阴香的馏分或阴香的化合物组。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]并入且构成本申请说明书一部分的以下【专利附图】
【附图说明】了本发明的一个或多个实施方式。以下附图用于解释本发明教导的原理。
[0012]图1为显示通过实时定量PCR结果说明的DLBS2411对HEK293细胞中H+/K+ATP酶基因表达降低的影响的图。
[0013]图2为显示通过实时定量PCR结果说明的DLBS2411对胃壁细胞中H+/K+ATP酶基因表达降低的影响的图。
[0014]图3为显示DLBS2411对各pH下H+/K+ATP酶的酶活性降低的影响的图。
[0015]图4和5为显示用和 不用DLBS2411处理对H+/K+ATP酶的酶动力活性的影响的图。
[0016]图6为显示在乙醇和DLBS2411给药后Wistar大鼠的皮下瘀斑(ptechiae)数目的图。
[0017]图7为显示在吲哚美辛(indomethacin)和DLBS2411给药后Wistar大鼠的皮下瘀斑数目的图。
[0018]图8为显示DLBS2411对还原能力的影响的图。
[0019]图9为显示DLBS2411对事先用15%乙醇处理的Wistar大鼠的H+/K+ATP酶的酶活性降低的影响的图。
[0020]图10为显示DLBS2411对事先用30mg/kg吲哚美辛处理的Wistar大鼠的H+/K+ATP酶的酶活性降低的影响的图。
【具体实施方式】
[0021]通过给出实施例将详细论述本发明，但本发明的范围不限于所提供的实施例。
[0022]根据本发明教导的提取物和/或馏分是从阴香的树皮得到的。这种植物在印度尼西亚国内外的各个地区生长，优选在西苏门答腊岛的巴东生长的阴香。本文将说明DLBS2411的提取方法，并进行体外、体内和离体研究，使用实时定量PCR和酶活性检测分析DLBS2411作为进一步应用为抗溃疡药物和粘膜保护剂的H+/K+ATP酶质子泵下调剂和酶抑制剂的效力。
[0023]A.提取方法
[0024]提取方法开始于研磨阴香的原料，优选树皮，直到均匀。将均匀的材料放入含有50°C至100°C热水的提取器中。提取混合物I至2小时。接着，过滤混合物以去除微团(micella)，并使用旋转蒸发器(旋转蒸发仪)通过真空方法蒸发所得滤液以生产浓缩物。
[0025]用有机溶剂通过液液萃取分馏浓缩物，以分离不需要的有机成分，并收集水相。可用在该方法中的有机溶剂在与浓缩物具有特定的比例的绝对条件下包括但不限于氯仿、二氯甲烷、己烷、醋酸乙酯和丁醇。优选的比例为1:1至2:1。水相通过从有机相分离而收集。进行数次萃取，优选I至10次，以优化水相的收集。
[0026]进行真空蒸发以产生浓缩物，浓缩物用干燥器进一步干燥，最终获得干燥馏分。
[0027]然后，研磨或压碎干燥馏分，直到它变成精细的粉末，然后用具有合适的网眼数目的筛子过滤。该干燥馏分即为后面称为DLBS2411的物质。
[0028]实施例1:提取以获得浓缩物
[0029]根据本发明的详细说明，可通过在具有10倍于原料重量的70°C温度的热水中浸泡10克阴香树皮而进行小规模的提取过程。用蒸发仪蒸发所得微团，而产生IOml的浓缩物。
[0030]实施例2:分馏以获得干燥水的馏分
[0031]根据本发明的详细说明，可使用IOml的浓缩物而进行小规模的分馏过程。通过使用I倍于浓缩物体积的几种有机溶剂(例如正丁醇、正己烷、醋酸乙酯和氯仿)而进行液液萃取。进行3次液液萃取。收集水馏分，并用旋转蒸发仪蒸发。在该过程中获得的产量为80mg的量的干燥馏分。
[0032]B.DLBS2411作为H VKiATP酶某闵表汰的下调剂
[0033]H+/K+ATP酶基因为在质子泵过程中起作用的基因。该基因在HEK293和胃壁细胞中表达，而调节酸分泌。
[0034]首先，从Wistar大鼠分离肾HEK293和胃壁细胞。在MEM培养基中培养肾HEK293细胞，并在6孔板中添加有10%血清和1%抗生素青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养胃壁细胞。培养基在37°C、5%C02下培养24小时。然后将两种培养基都换为无血清的培养基，并在进行处理前培养18至24小时。以各种浓度:10 μ g/mL、25 μ g/mL和50 μ g/mL的DLBS2411处理孔板中含有的HEK293和胃壁细胞。接着，将已经用DLBS2411处理的无血清的培养基中的每种细胞培养24小时。
[0035]RNA分离和实时定量PCR
[0036]为了确定在DLBS2411给药后细胞中H+/K+ATP酶的mRNA表达的下降，进行实时定量PCR检测。从HEK293和胃壁细胞中分离总RNA。用分光光度计在260nm和280nm的波长定量RNA分离的产物，并在琼脂糖凝胶上通过电泳显现。然后RNA用于使用特异引物的实时定量PCR过程。在最优条件下用PCR仪器进行实时定量PCR，并使用具有如下DNA序列的对于H7K+ATP酶特异的引物:
[0037]正向:5，GCTGCA GCT CCA TCC TTA TC3，
[0038]反向:5，AGGCGG GTA GTC CTT CTC AT3，
[0039]由定量使用H+/K+ATP酶的引物的PCR检测结果，在DLBS2411给药后HEK293和胃壁细胞中显示H+/K+ATP酶的mRNA表达水平的降低(图1和图2)。该结果还揭示，由各剂量的提取物对降低H7K+ATP酶基因表达的能力所示，DLBS2411在HEK293细胞中比在胃壁细胞中效果更好。基因表达随着DLBS2411的剂量增加而下降。[0040]C.DLBS2411作为HVKiATP酶的酶活件的抑制剂
[0041]存在多个影响酶活性的因素，包括温度、pH和抑制剂。在本发明中，观察到DLBS2411作为抑制剂对H+/K+ATP酶的酶活性的影响，其中，检测根据从ATP水解中释放的无机磷酸盐的评定。使用Enzcheck Phosphate检测试剂盒(分子探针)根据从该试剂盒获得的手册进行检测。在从Wistar大鼠分离并加入30 μ g/mL的DLBS2411培养的胃壁细胞中进行酶检测，其中，检测过程中PH水平的变化如下:7.4、4和2。此外，在用和不用DLBS2411处理的条件下进行胃壁细胞中的H7K+ATP酶的酶动力检测。
[0042]由胃壁细胞中的H7K+ATP酶的酶活性结果得到，当DLBS2411的剂量提高时，DLBS2411具有降低酶活性的能力(图3)。活性的降低还受pH的影响。通过IC5tl值的减小看到这个状态，其中，pH为7.4时IC5tl是29.20 μ g/ml ;pH为4时是18.70μ g/ml, pH为2时IC5tl是9.20 μ g/ml 0数据显示DLBS2411在抑制胃中的质子泵活性方面，特别是在低的胃PH的条件中，能够有效地作用。H+/K+ATP酶的酶活性的降低符合事先已测试过的其基因表达的降低。该数据表明酶活性的抑制关系到用DLBS2411处理后基因转录的降低。
[0043]此外，由酶动力测试发现，未用DLBS2411处理的测试导致多达0.3075 μ mmol/ml的Km (米歇利斯常数)值和多达7.69 μ mmolPi/h的Vmax，而用DLBS2411处理时，Km值为
0.4002 μ mmol/ml, Vmax为6.67 μ mmolPi/h(图4和图5)。Km值用于测量酶一底物亲和力。这关系到E-S复合体的平衡解离常数。本领域中还已知小的Km值意味着E-S复合体处于最好的状态并且酶对底物的亲和力很高，反之亦然。图5中，显示了 DLBS2411具有通过竞争性抑制方式作为酶活性抑制剂的特性。该竞争性抑制剂结合于酶的活性位点，防止酶与底物结合。根据本发明的教导，由酶动力检测得到的结果反映了 DLBS2411作为竞争性抑制剂的特性，由此DLBS2411抑制HVK+ATP酶的酶活性。
[0044]P.DLBS2411的抑制溃疡活性体内检测
[0045]在本发明中， 使用Wistar大鼠通过体内试验研究DLBS2411在抑制溃疡中的活性。
[0046]在这个实验中使用的试验动物为Wistar大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus)Wistar系)，具有2月龄和200g至210g体重的雄性。将动物单独安置可随意获得食物和饮水。根据实验动物管理评估和认证委员会(AAALAC)认可的试验动物的使用和饲养指南，它们被饲养于具有12小时光照/黑暗周期的22-23°C的温度中。
[0047]试验动物分成两个主要的组:第一组试验动物通过用乙醇处理进行胃溃疡诱导；第二，试验动物通过用吲哚美辛处理进行胃溃疡诱导。动物经历了特征为溃疡开始的胃损伤。在这个研究中，通过皮下瘀斑的形成，观察到胃损伤的出现，标志为事先用乙醇和吲哚美辛诱导的大鼠胃中红色的斑点。
[0048]1.使用乙醇在Wistar大鼠中诱导胃溃瘍
[0049]乙醇诱导的溃疡已经广泛用于研究植物提取物作为粘膜保护剂的效力。乙醇诱导的胃损伤与氧化应激、酯质过氧化反应的增加和自由基的产生相关。在本发明中，通过DLBS2411在抑制胃损伤中的活性显示了它作为粘膜保护剂的潜力。
[0050]试验动物分成4组:(I)阴性对照组，(2)阳性对照组，(3)用20mg/kg bw的DLBS2411处理的组，(4)用40mg/kg bw处理的组。阴性对照组为其中试验动物只受到生理盐水处理的组。其它组提前受到80%乙醇的处理，然后用15%乙醇诱导一周。一周后，阳性对照组用生理盐水处理，而2个处理过的组用2个不同的剂量:20mg/kg bw和40mg/kg bw的DLBS2411诱导。在处理期最后，试验动物禁食过夜。通过断头对动物进行安乐死，然后观察动物的胃以检查溃疡的发展。
[0051]通过上述处理，发现在用生理盐水溶液对试验动物给予处理的阳性对照组中，溃疡以多达19.67±1.53个红色斑点的皮下瘀斑的状态在Wistar大鼠中发展(图6)。另一方面，在受到DLBS2411处理的试验动物中，发现胃损伤数目的减小，其中，接受20mg/kg bw的DLBS2411的试验动物具有2.33 ± 0.58个皮下瘀斑的斑点，接受40mg/kg bw的实验动物具有1.33±0.58个皮下瘀斑的斑点。这种情况显示由皮下瘀斑形成观察到的溃疡发展可用DLBS2411给药以剂量依赖的方式得到抑制。
[0052]2.在Wistar大鼠中使用吲哚美辛诱导胃溃瘍
[0053]吲哚美辛的诱导溃疡也已经广泛用于研究植物提取物作为粘膜保护剂的效力。吲哚美辛诱导的溃疡的机制包括前列腺素生物合成的抑制、胃粘膜血流动的减少和组织愈合的紊乱。在本发明中，通过DLBS2411在抑制胃损伤中的活性显示了它作为粘膜保护剂的潜力。
[0054]试验动物分成4组:(I)阴性对照组，(2)阳性对照组，(3)用20mg/kg bw的DLBS2411处理的组，(4)用40mg/kg bw处理的组。阴性对照组为其中试验动物只受到生理盐水处理的组。阳性对照组接受生理盐水和吲哚美辛，其中试验动物分别用20mg/kg bw和40mg/kg bw的DLBS2411受到处理一周的第一和第二处理组接着用30mg/kg bw的卩引哚美辛处理。在试验动物禁食过夜后进行吲哚美辛的诱导；然后进行手术。试验动物在中线剖腹手术切开前麻醉。识别幽门，然后用3/0尺寸的丝线缝合。然后，试验动物接受30mg/kg bw的吲哚美辛和水。在处理6小时后，通过断头对动物进行安乐死，然后观察动物的胃以检查溃疡的发展。
[0055]通过23±2.65个皮下瘀斑观察到接受30mg/kg bw的卩引哚美辛的试验动物中的溃疡(图7)。在用20mg/kg和40m g/kg的DLBS2411处理的组中皮下瘀斑的数目减小，其中该数目分别变成10.33 ± 1.53和5.33 ± 0.58个皮下瘀斑。这些数据显示DLBS2411具有通过Wistar大鼠的胃损伤数目减小所显示的溃疡抑制效果。这种情况显示了 DLBS2411作为粘膜保护剂的活性。DLBS2411对Wistar大鼠的诱导没有引起显著的副作用。此外，还发现它没有引起肾、心肝、脾、肠和肺的异常。这些数据还受到了显示大鼠正常活动的毒性研究的支持。此外，用显微镜观察还显示了大鼠内部器官的正常状态。
[0056]E.DLBS2411作为抗氧化剂的的活性
[0057]使用Oyaizu 方法(1986)进行还原能力检测。DLBS2411 (O μ g/mL 至 50 μ g/mL)与磷酸盐缓冲液和铁氰化钾混合。在50°C培养混合物20分钟，然后加入TCA溶液，并在3000rpm离心10分钟。收集上层，并与蒸馏水和氯化铁溶液混合。用分光光度计在700nm的波长测量吸光度。由该检测获得的吸光度值显示提取物的还原能力。抗坏血酸(维生素C)用作对照。
[0058]该结果显示了 DLBS2411具有还原能力，随着DLBS2411剂量增加而提高(图8)。溃疡主要由于导致胃溃疡的过度氧化过程而发生。由于具有高还原能力，预期该提取物能够减轻过度氧化过程。该还原能力显示DLBS2411具有作为抗氧化剂的潜在活性。
[0059]F.HVKiATP酶的酶活性的离体检测
[0060]在从来自两个不同的处理组的Wistar大鼠中分离的胃壁细胞中进行酶检测，一组事先用15%乙醇处理，另一组事先用30mg/kg吲哚美辛处理。两个处理过的组都给予20mg/kg bw 和 40mg/kg bw 的 DLBS2411。
[0061]酶活性检测基于从ATP水解中释放的无机磷酸盐的定量。使用EnzcheckPhosphate检测试剂盒(分子探针)根据从该试剂盒中获得的手册进行该检测。
[0062]由大鼠胃壁细胞中的H+/K+ATP酶的酶活性检测的结果，发现随着15%乙醇(图9)和吲哚美辛(图10)的加入提高了酶活性检测，由此表明引起溃疡的胃酸过多。然而，在用DLBS2411处理后，上述酶活性减小。这可能由于提取物中含有的化合物与H+/K+ATP酶的酶相互作用抑制酶的活性而发生。酶活性的减小表明DLBS2411能够抑制胃酸过多并减小溃疡的几率。
[0063]G.组合物、药物制剂和保健食品
[0064]本发明包括包含有效量或剂量的单独或在组合中作为活性成分的DLBS2411的组合物和药物制剂，其包括药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂。
[0065]如本发明教导，在制备药物组合物的过程中，活性成分DLBS2411可与赋形剂混合或溶于赋形剂中，或包含在以胶囊、小袋(sachet)、纸及其它包装材料的形态制造的载体中。
[0066]如果将药学可接受的赋形剂用作溶剂，该赋形剂可为固体、半固体或液体(口服或注射)的形态，作用为用于活性成分的载体或介质。因此，根据本发明的药物组合物可以药丸、胶囊、药片、粉末、小袋、溶液、糖浆、乳液、悬浮液、泡腾片、凝胶、油膏、乳膏和漱口药、按摩油、栓剂或注射剂的形态制造。除此之外，根据本发明的包含DLBS2411的药物组合物还可制造为补充剂、维生素，还有食物和饮料产品。
[0067]一些合适的赋形剂的实例为微晶纤维素、明胶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、磷酸钙、硅酸钙和其它。适合本发明教导的药剂还可包含润滑剂(例如:滑石、硬脂酸镁、矿物油)、湿润剂、防腐剂、甜味剂和调味剂。
[0068]根据本发明的组合物可使用制药工业中已经应用的方法，以患者接受这样的剂型后使活性成分直接释放、缓释或可控释放的药剂而制造。可将根据本发明的药片或药丸分层以延长提取物的半衰期，从而减小使用的频率。
[0069]以固态(例如药片)配制上述组合物的方法可通过混合DLBS2411的提取物和/或馏分的活性成分与赋形剂以从根据本发明的组合物形成含有均匀混合物的初始药剂而进行。初始药剂为包含均匀分散的DLBS2411的活性成分的混合物，因此该药剂可根据合适的剂量分配成例如胶囊、药片或药丸的形态。
[0070]可给予根据本发明的药片或药丸额外的保护层，以减小或掩盖来自组合物或活性物质DLBS2411的苦味。相似地，对于根据本发明的半固体和液体形态，如需要可给予额外的物质以减小来自组合物或活性物质DLBS2411的苦味或异味。
[0071]根据本发明的有效量或剂量的DLBS2411为可抑制质子泵的提取物的药剂。有效量取决于患者的生理状态(包括体重、年龄和其它因素；包括细胞的类型、大小和数目以及其它目标病理状态)。
[0072]H.工业应用
[0073]来自DLBS2411的提取物和/或药物组合物可在提取物、干粉提取物和/或药物组合物的生产中用于工业规模，通过下调H7K+ATP酶质子泵、抑制酶和给予粘膜保护而在其应用中作为抗溃疡药物用于可 为固体、半固体或液体的无菌或未灭菌的口服药剂。
【权利要求】
1.一种在药物制剂中以作为抗溃疡药物有效的量或剂量作为单独活性成分或在组合中包含阴香的提取物和/或阴香的馏分或源自阴香的化合物组。
2.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物和/或馏分具有作为H+/K+ATP酶质子泵的下调剂的活性。
3.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物和/或馏分具有作为H+/K+ATP酶的酶抑制剂的活性。
4.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物和/或馏分具有作为粘膜保护剂的活性。
5.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物通过包括以下步骤的方法而获得: (a)使用在50°C至100°C的温度的热水提取， (b)使用有机溶剂液液萃取以获得水懼分。
6.根据权利要求5的提取物和/或馏分，其中，所述方法进一步包括重复步骤(b)的步骤，以优化水馏分的收集。
7.根据权利要求5的提取物和/或馏分，其中，步骤(b)的所述有机溶剂选自由氯仿、二氯甲烷、己烷、醋酸乙酯和丁醇组成的组中。
8.一种药物组合物 ，包含作为单独活性成分或在组合中的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分，以及药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂。
9.一种药物组合物，包含作为单活性成分或在组合中的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分，以及药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂，其中，所述药物组合物在无菌或未灭菌的产物中以固体、半固体或液体形态制造。
10.一种用于促进健康效益的食物或饮料产品，包含作为单独活性成分或在组合中的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分。
【文档编号】A61K36/54GK103458907SQ201280012361
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月9日 优先权日:2011年3月9日
【发明者】波皮·菲尔萨尼·阿里芬, 德亚希·迪亚·德维·R·W, 韦罗妮卡·尤利安尼, 詹姆斯·M·西纳贝拉, 雷蒙·R·钱德拉维纳塔 申请人:地塞医药有限公司
【专利摘要】涉及其提取方法及其生物活性的阴香（Cinnamomum?burmanii）提取物和/或馏分（DLBS2411）通过给予粘膜保护和下调H+/K+ATP酶而显示抗溃疡活性。用DLBS2411处理降低了HEK293和胃壁细胞中H+/K+ATP酶的mRNA水平。此外，DLBS2411抑制了H+/K+ATP酶的胃酶活性，其中pH影响该抑制机理。DLBS2411还具有通过随特定剂量增加而提高的还原能力所显示的作为抗氧化剂的特性。
【专利说明】阴香提取物、提取方法及该提取物作为质子泵下调剂、酶抑制剂和粘膜保护剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及阴香(Cinnamomum burmanii)植物的提取物,就本发明的目的而言该提取物指DLBS2411，本发明还包括提取方法以及所述提取物作为抗溃疡剂的生物活性，该生物活性包括下调质子泵H+/K+ATP酶、抑制酶和给予粘膜保护。用DLBS2411处理能够降低HVK+ATP酶在HEK293和胃壁细胞中mRNA的表达。此外，DLBS2411抑制了胃酶H+/K+ATP酶的活性，其中，该抑制受PH的影响。此外，DLBS2411还具有通过随特定浓度增加而提高的还原能力所显示的抗氧化剂活性。
【背景技术】
[0002]胃病是世界上高度流行的疾病，其包括消化不良、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃食管返流疾病(GERD)、喉咽反流(LPR)、佐林格-埃利森综合征，以及长期使用药物引起的疾病。通常，这是由促进胃酸过量产生的质子泵的提高的活性引起的，并导致胃痛。在胃酸分泌过程中在质子泵作用的酶已知为H+/K+ATP酶。这种酶结合于胃壁细胞中的顶膜(apicalmembrane)。抑制产生酸的胃壁细胞中的质子泵被认为是减少胃酸的有效方法，通过在mRNA表达水平和H+/K+ATP酶的酶活性的胃酸分泌物的减少所显示。H+/K+ATP酶基因不仅在胃壁细胞中还在肝和肠细胞中表达。
[0003]目前，市场上有几种可购的通过抑制质子泵而作用的药物，例如奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑和埃索美拉唑。然而，仍需要具有低副反应的抑制上述质子泵的新药研究成果，一个可能性来自天然物质，例如阴香。
[0004]在本发明中，DLBS2411阴香提取物的效果作为包括其在下调质子泵H+/K+ATP酶中的活性的抗溃疡药物和作为酶抑制剂而得到研究，该效果通过通过H+/K+ATP酶基因表达和该酶的活性降低所显示。在本发明之前，还没有任何研究阐述本发明所主张的DLBS2411阴香提取物。
【发明内容】
[0005]本发明提供的目的和/或方案将以优选的实施方式给出。所述的实施方式用于理解本发明的目的，而不限制其它实施方式在变化和/或组合和/改进中的可能性，这些可从本发明的实施践中得到。本发明教导的目的和/或方案将由本文的权利要求中详述的要素和组合实现。
[0006]为得到上述方案并与本发明的目的一致，如在实施方式中阐释并在本申请中大体说明的，本发明的第一方面涉及以用作抗溃疡药物的有效量或剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组。
[0007]本发明的第二方面涉及以在用作H+/K+ATP酶下调剂、酶抑制剂和粘膜保护剂的有效量或剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组。[0008]本发明的第三方面涉及用作但不限于抗溃疡的药物组合物，包含(I)以有效量或剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组，和(2)药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂。
[0009]本发明的第四方面涉及用作但不限于抗溃疡的药物组合物或制剂，包含(I)以有效剂量作为单独活性成分或在组合中的樟属植物(优选阴香)的提取物，或者所述植物的馏分或所述植物的化合物组，和(2)药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂，由此将所述药物组合物或制剂以无菌或未灭菌的形式生产为固体、半固体或液体。
[0010]本发明的第五方面涉及用作但不限于抗溃疡的促进健康的食物和饮料产品，包含以有效剂量作为单独活性成分或在组合中的阴香的提取物，或者阴香的馏分或阴香的化合物组。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]并入且构成本申请说明书一部分的以下【专利附图】
【附图说明】了本发明的一个或多个实施方式。以下附图用于解释本发明教导的原理。
[0012]图1为显示通过实时定量PCR结果说明的DLBS2411对HEK293细胞中H+/K+ATP酶基因表达降低的影响的图。
[0013]图2为显示通过实时定量PCR结果说明的DLBS2411对胃壁细胞中H+/K+ATP酶基因表达降低的影响的图。
[0014]图3为显示DLBS2411对各pH下H+/K+ATP酶的酶活性降低的影响的图。
[0015]图4和5为显示用和 不用DLBS2411处理对H+/K+ATP酶的酶动力活性的影响的图。
[0016]图6为显示在乙醇和DLBS2411给药后Wistar大鼠的皮下瘀斑(ptechiae)数目的图。
[0017]图7为显示在吲哚美辛(indomethacin)和DLBS2411给药后Wistar大鼠的皮下瘀斑数目的图。
[0018]图8为显示DLBS2411对还原能力的影响的图。
[0019]图9为显示DLBS2411对事先用15%乙醇处理的Wistar大鼠的H+/K+ATP酶的酶活性降低的影响的图。
[0020]图10为显示DLBS2411对事先用30mg/kg吲哚美辛处理的Wistar大鼠的H+/K+ATP酶的酶活性降低的影响的图。
【具体实施方式】
[0021]通过给出实施例将详细论述本发明，但本发明的范围不限于所提供的实施例。
[0022]根据本发明教导的提取物和/或馏分是从阴香的树皮得到的。这种植物在印度尼西亚国内外的各个地区生长，优选在西苏门答腊岛的巴东生长的阴香。本文将说明DLBS2411的提取方法，并进行体外、体内和离体研究，使用实时定量PCR和酶活性检测分析DLBS2411作为进一步应用为抗溃疡药物和粘膜保护剂的H+/K+ATP酶质子泵下调剂和酶抑制剂的效力。
[0023]A.提取方法
[0024]提取方法开始于研磨阴香的原料，优选树皮，直到均匀。将均匀的材料放入含有50°C至100°C热水的提取器中。提取混合物I至2小时。接着，过滤混合物以去除微团(micella)，并使用旋转蒸发器(旋转蒸发仪)通过真空方法蒸发所得滤液以生产浓缩物。
[0025]用有机溶剂通过液液萃取分馏浓缩物，以分离不需要的有机成分，并收集水相。可用在该方法中的有机溶剂在与浓缩物具有特定的比例的绝对条件下包括但不限于氯仿、二氯甲烷、己烷、醋酸乙酯和丁醇。优选的比例为1:1至2:1。水相通过从有机相分离而收集。进行数次萃取，优选I至10次，以优化水相的收集。
[0026]进行真空蒸发以产生浓缩物，浓缩物用干燥器进一步干燥，最终获得干燥馏分。
[0027]然后，研磨或压碎干燥馏分，直到它变成精细的粉末，然后用具有合适的网眼数目的筛子过滤。该干燥馏分即为后面称为DLBS2411的物质。
[0028]实施例1:提取以获得浓缩物
[0029]根据本发明的详细说明，可通过在具有10倍于原料重量的70°C温度的热水中浸泡10克阴香树皮而进行小规模的提取过程。用蒸发仪蒸发所得微团，而产生IOml的浓缩物。
[0030]实施例2:分馏以获得干燥水的馏分
[0031]根据本发明的详细说明，可使用IOml的浓缩物而进行小规模的分馏过程。通过使用I倍于浓缩物体积的几种有机溶剂(例如正丁醇、正己烷、醋酸乙酯和氯仿)而进行液液萃取。进行3次液液萃取。收集水馏分，并用旋转蒸发仪蒸发。在该过程中获得的产量为80mg的量的干燥馏分。
[0032]B.DLBS2411作为H VKiATP酶某闵表汰的下调剂
[0033]H+/K+ATP酶基因为在质子泵过程中起作用的基因。该基因在HEK293和胃壁细胞中表达，而调节酸分泌。
[0034]首先，从Wistar大鼠分离肾HEK293和胃壁细胞。在MEM培养基中培养肾HEK293细胞，并在6孔板中添加有10%血清和1%抗生素青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养胃壁细胞。培养基在37°C、5%C02下培养24小时。然后将两种培养基都换为无血清的培养基，并在进行处理前培养18至24小时。以各种浓度:10 μ g/mL、25 μ g/mL和50 μ g/mL的DLBS2411处理孔板中含有的HEK293和胃壁细胞。接着，将已经用DLBS2411处理的无血清的培养基中的每种细胞培养24小时。
[0035]RNA分离和实时定量PCR
[0036]为了确定在DLBS2411给药后细胞中H+/K+ATP酶的mRNA表达的下降，进行实时定量PCR检测。从HEK293和胃壁细胞中分离总RNA。用分光光度计在260nm和280nm的波长定量RNA分离的产物，并在琼脂糖凝胶上通过电泳显现。然后RNA用于使用特异引物的实时定量PCR过程。在最优条件下用PCR仪器进行实时定量PCR，并使用具有如下DNA序列的对于H7K+ATP酶特异的引物:
[0037]正向:5，GCTGCA GCT CCA TCC TTA TC3，
[0038]反向:5，AGGCGG GTA GTC CTT CTC AT3，
[0039]由定量使用H+/K+ATP酶的引物的PCR检测结果，在DLBS2411给药后HEK293和胃壁细胞中显示H+/K+ATP酶的mRNA表达水平的降低(图1和图2)。该结果还揭示，由各剂量的提取物对降低H7K+ATP酶基因表达的能力所示，DLBS2411在HEK293细胞中比在胃壁细胞中效果更好。基因表达随着DLBS2411的剂量增加而下降。[0040]C.DLBS2411作为HVKiATP酶的酶活件的抑制剂
[0041]存在多个影响酶活性的因素，包括温度、pH和抑制剂。在本发明中，观察到DLBS2411作为抑制剂对H+/K+ATP酶的酶活性的影响，其中，检测根据从ATP水解中释放的无机磷酸盐的评定。使用Enzcheck Phosphate检测试剂盒(分子探针)根据从该试剂盒获得的手册进行检测。在从Wistar大鼠分离并加入30 μ g/mL的DLBS2411培养的胃壁细胞中进行酶检测，其中，检测过程中PH水平的变化如下:7.4、4和2。此外，在用和不用DLBS2411处理的条件下进行胃壁细胞中的H7K+ATP酶的酶动力检测。
[0042]由胃壁细胞中的H7K+ATP酶的酶活性结果得到，当DLBS2411的剂量提高时，DLBS2411具有降低酶活性的能力(图3)。活性的降低还受pH的影响。通过IC5tl值的减小看到这个状态，其中，pH为7.4时IC5tl是29.20 μ g/ml ;pH为4时是18.70μ g/ml, pH为2时IC5tl是9.20 μ g/ml 0数据显示DLBS2411在抑制胃中的质子泵活性方面，特别是在低的胃PH的条件中，能够有效地作用。H+/K+ATP酶的酶活性的降低符合事先已测试过的其基因表达的降低。该数据表明酶活性的抑制关系到用DLBS2411处理后基因转录的降低。
[0043]此外，由酶动力测试发现，未用DLBS2411处理的测试导致多达0.3075 μ mmol/ml的Km (米歇利斯常数)值和多达7.69 μ mmolPi/h的Vmax，而用DLBS2411处理时，Km值为
0.4002 μ mmol/ml, Vmax为6.67 μ mmolPi/h(图4和图5)。Km值用于测量酶一底物亲和力。这关系到E-S复合体的平衡解离常数。本领域中还已知小的Km值意味着E-S复合体处于最好的状态并且酶对底物的亲和力很高，反之亦然。图5中，显示了 DLBS2411具有通过竞争性抑制方式作为酶活性抑制剂的特性。该竞争性抑制剂结合于酶的活性位点，防止酶与底物结合。根据本发明的教导，由酶动力检测得到的结果反映了 DLBS2411作为竞争性抑制剂的特性，由此DLBS2411抑制HVK+ATP酶的酶活性。
[0044]P.DLBS2411的抑制溃疡活性体内检测
[0045]在本发明中， 使用Wistar大鼠通过体内试验研究DLBS2411在抑制溃疡中的活性。
[0046]在这个实验中使用的试验动物为Wistar大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus)Wistar系)，具有2月龄和200g至210g体重的雄性。将动物单独安置可随意获得食物和饮水。根据实验动物管理评估和认证委员会(AAALAC)认可的试验动物的使用和饲养指南，它们被饲养于具有12小时光照/黑暗周期的22-23°C的温度中。
[0047]试验动物分成两个主要的组:第一组试验动物通过用乙醇处理进行胃溃疡诱导；第二，试验动物通过用吲哚美辛处理进行胃溃疡诱导。动物经历了特征为溃疡开始的胃损伤。在这个研究中，通过皮下瘀斑的形成，观察到胃损伤的出现，标志为事先用乙醇和吲哚美辛诱导的大鼠胃中红色的斑点。
[0048]1.使用乙醇在Wistar大鼠中诱导胃溃瘍
[0049]乙醇诱导的溃疡已经广泛用于研究植物提取物作为粘膜保护剂的效力。乙醇诱导的胃损伤与氧化应激、酯质过氧化反应的增加和自由基的产生相关。在本发明中，通过DLBS2411在抑制胃损伤中的活性显示了它作为粘膜保护剂的潜力。
[0050]试验动物分成4组:(I)阴性对照组，(2)阳性对照组，(3)用20mg/kg bw的DLBS2411处理的组，(4)用40mg/kg bw处理的组。阴性对照组为其中试验动物只受到生理盐水处理的组。其它组提前受到80%乙醇的处理，然后用15%乙醇诱导一周。一周后，阳性对照组用生理盐水处理，而2个处理过的组用2个不同的剂量:20mg/kg bw和40mg/kg bw的DLBS2411诱导。在处理期最后，试验动物禁食过夜。通过断头对动物进行安乐死，然后观察动物的胃以检查溃疡的发展。
[0051]通过上述处理，发现在用生理盐水溶液对试验动物给予处理的阳性对照组中，溃疡以多达19.67±1.53个红色斑点的皮下瘀斑的状态在Wistar大鼠中发展(图6)。另一方面，在受到DLBS2411处理的试验动物中，发现胃损伤数目的减小，其中，接受20mg/kg bw的DLBS2411的试验动物具有2.33 ± 0.58个皮下瘀斑的斑点，接受40mg/kg bw的实验动物具有1.33±0.58个皮下瘀斑的斑点。这种情况显示由皮下瘀斑形成观察到的溃疡发展可用DLBS2411给药以剂量依赖的方式得到抑制。
[0052]2.在Wistar大鼠中使用吲哚美辛诱导胃溃瘍
[0053]吲哚美辛的诱导溃疡也已经广泛用于研究植物提取物作为粘膜保护剂的效力。吲哚美辛诱导的溃疡的机制包括前列腺素生物合成的抑制、胃粘膜血流动的减少和组织愈合的紊乱。在本发明中，通过DLBS2411在抑制胃损伤中的活性显示了它作为粘膜保护剂的潜力。
[0054]试验动物分成4组:(I)阴性对照组，(2)阳性对照组，(3)用20mg/kg bw的DLBS2411处理的组，(4)用40mg/kg bw处理的组。阴性对照组为其中试验动物只受到生理盐水处理的组。阳性对照组接受生理盐水和吲哚美辛，其中试验动物分别用20mg/kg bw和40mg/kg bw的DLBS2411受到处理一周的第一和第二处理组接着用30mg/kg bw的卩引哚美辛处理。在试验动物禁食过夜后进行吲哚美辛的诱导；然后进行手术。试验动物在中线剖腹手术切开前麻醉。识别幽门，然后用3/0尺寸的丝线缝合。然后，试验动物接受30mg/kg bw的吲哚美辛和水。在处理6小时后，通过断头对动物进行安乐死，然后观察动物的胃以检查溃疡的发展。
[0055]通过23±2.65个皮下瘀斑观察到接受30mg/kg bw的卩引哚美辛的试验动物中的溃疡(图7)。在用20mg/kg和40m g/kg的DLBS2411处理的组中皮下瘀斑的数目减小，其中该数目分别变成10.33 ± 1.53和5.33 ± 0.58个皮下瘀斑。这些数据显示DLBS2411具有通过Wistar大鼠的胃损伤数目减小所显示的溃疡抑制效果。这种情况显示了 DLBS2411作为粘膜保护剂的活性。DLBS2411对Wistar大鼠的诱导没有引起显著的副作用。此外，还发现它没有引起肾、心肝、脾、肠和肺的异常。这些数据还受到了显示大鼠正常活动的毒性研究的支持。此外，用显微镜观察还显示了大鼠内部器官的正常状态。
[0056]E.DLBS2411作为抗氧化剂的的活性
[0057]使用Oyaizu 方法(1986)进行还原能力检测。DLBS2411 (O μ g/mL 至 50 μ g/mL)与磷酸盐缓冲液和铁氰化钾混合。在50°C培养混合物20分钟，然后加入TCA溶液，并在3000rpm离心10分钟。收集上层，并与蒸馏水和氯化铁溶液混合。用分光光度计在700nm的波长测量吸光度。由该检测获得的吸光度值显示提取物的还原能力。抗坏血酸(维生素C)用作对照。
[0058]该结果显示了 DLBS2411具有还原能力，随着DLBS2411剂量增加而提高(图8)。溃疡主要由于导致胃溃疡的过度氧化过程而发生。由于具有高还原能力，预期该提取物能够减轻过度氧化过程。该还原能力显示DLBS2411具有作为抗氧化剂的潜在活性。
[0059]F.HVKiATP酶的酶活性的离体检测
[0060]在从来自两个不同的处理组的Wistar大鼠中分离的胃壁细胞中进行酶检测，一组事先用15%乙醇处理，另一组事先用30mg/kg吲哚美辛处理。两个处理过的组都给予20mg/kg bw 和 40mg/kg bw 的 DLBS2411。
[0061]酶活性检测基于从ATP水解中释放的无机磷酸盐的定量。使用EnzcheckPhosphate检测试剂盒(分子探针)根据从该试剂盒中获得的手册进行该检测。
[0062]由大鼠胃壁细胞中的H+/K+ATP酶的酶活性检测的结果，发现随着15%乙醇(图9)和吲哚美辛(图10)的加入提高了酶活性检测，由此表明引起溃疡的胃酸过多。然而，在用DLBS2411处理后，上述酶活性减小。这可能由于提取物中含有的化合物与H+/K+ATP酶的酶相互作用抑制酶的活性而发生。酶活性的减小表明DLBS2411能够抑制胃酸过多并减小溃疡的几率。
[0063]G.组合物、药物制剂和保健食品
[0064]本发明包括包含有效量或剂量的单独或在组合中作为活性成分的DLBS2411的组合物和药物制剂，其包括药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂。
[0065]如本发明教导，在制备药物组合物的过程中，活性成分DLBS2411可与赋形剂混合或溶于赋形剂中，或包含在以胶囊、小袋(sachet)、纸及其它包装材料的形态制造的载体中。
[0066]如果将药学可接受的赋形剂用作溶剂，该赋形剂可为固体、半固体或液体(口服或注射)的形态，作用为用于活性成分的载体或介质。因此，根据本发明的药物组合物可以药丸、胶囊、药片、粉末、小袋、溶液、糖浆、乳液、悬浮液、泡腾片、凝胶、油膏、乳膏和漱口药、按摩油、栓剂或注射剂的形态制造。除此之外，根据本发明的包含DLBS2411的药物组合物还可制造为补充剂、维生素，还有食物和饮料产品。
[0067]一些合适的赋形剂的实例为微晶纤维素、明胶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、磷酸钙、硅酸钙和其它。适合本发明教导的药剂还可包含润滑剂(例如:滑石、硬脂酸镁、矿物油)、湿润剂、防腐剂、甜味剂和调味剂。
[0068]根据本发明的组合物可使用制药工业中已经应用的方法，以患者接受这样的剂型后使活性成分直接释放、缓释或可控释放的药剂而制造。可将根据本发明的药片或药丸分层以延长提取物的半衰期，从而减小使用的频率。
[0069]以固态(例如药片)配制上述组合物的方法可通过混合DLBS2411的提取物和/或馏分的活性成分与赋形剂以从根据本发明的组合物形成含有均匀混合物的初始药剂而进行。初始药剂为包含均匀分散的DLBS2411的活性成分的混合物，因此该药剂可根据合适的剂量分配成例如胶囊、药片或药丸的形态。
[0070]可给予根据本发明的药片或药丸额外的保护层，以减小或掩盖来自组合物或活性物质DLBS2411的苦味。相似地，对于根据本发明的半固体和液体形态，如需要可给予额外的物质以减小来自组合物或活性物质DLBS2411的苦味或异味。
[0071]根据本发明的有效量或剂量的DLBS2411为可抑制质子泵的提取物的药剂。有效量取决于患者的生理状态(包括体重、年龄和其它因素；包括细胞的类型、大小和数目以及其它目标病理状态)。
[0072]H.工业应用
[0073]来自DLBS2411的提取物和/或药物组合物可在提取物、干粉提取物和/或药物组合物的生产中用于工业规模，通过下调H7K+ATP酶质子泵、抑制酶和给予粘膜保护而在其应用中作为抗溃疡药物用于可 为固体、半固体或液体的无菌或未灭菌的口服药剂。
【权利要求】
1.一种在药物制剂中以作为抗溃疡药物有效的量或剂量作为单独活性成分或在组合中包含阴香的提取物和/或阴香的馏分或源自阴香的化合物组。
2.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物和/或馏分具有作为H+/K+ATP酶质子泵的下调剂的活性。
3.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物和/或馏分具有作为H+/K+ATP酶的酶抑制剂的活性。
4.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物和/或馏分具有作为粘膜保护剂的活性。
5.根据权利要求1的提取物和/或馏分，其中，所述提取物通过包括以下步骤的方法而获得: (a)使用在50°C至100°C的温度的热水提取， (b)使用有机溶剂液液萃取以获得水懼分。
6.根据权利要求5的提取物和/或馏分，其中，所述方法进一步包括重复步骤(b)的步骤，以优化水馏分的收集。
7.根据权利要求5的提取物和/或馏分，其中，步骤(b)的所述有机溶剂选自由氯仿、二氯甲烷、己烷、醋酸乙酯和丁醇组成的组中。
8.一种药物组合物 ，包含作为单独活性成分或在组合中的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分，以及药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂。
9.一种药物组合物，包含作为单活性成分或在组合中的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分，以及药学可接受且生理学适合的载体、赋形剂或添加剂，其中，所述药物组合物在无菌或未灭菌的产物中以固体、半固体或液体形态制造。
10.一种用于促进健康效益的食物或饮料产品，包含作为单独活性成分或在组合中的根据权利要求1所述的提取物和/或馏分。
【文档编号】A61K36/54GK103458907SQ201280012361
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月9日 优先权日:2011年3月9日
【发明者】波皮·菲尔萨尼·阿里芬, 德亚希·迪亚·德维·R·W, 韦罗妮卡·尤利安尼, 詹姆斯·M·西纳贝拉, 雷蒙·R·钱德拉维纳塔 申请人:地塞医药有限公司
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