尼泊尔鸢尾异黄酮的提取方法、其衍生物和以该衍生物为活性成分的药物组合物的制作方法

专利名称：尼泊尔鸢尾异黄酮的提取方法、其衍生物和以该衍生物为活性成分的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的尼泊尔鸢尾异黄酮的提取方法，尼泊尔鸢尾异黄酮衍生物，以该衍生物为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗心、脑血管病、骨质疏松症中的应用。
背景技术：
葛花(Flos Puerariae)，又名葛条花，为豆科(Leguminosae)植物野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)的干燥花蕾。性凉，味甘，入归阳明经。《神农本草经》、《本草纲目》等记载其具有解酒醒脾之功效，主治伤酒发热烦渴、不思饮食、呕逆吐酸、吐血、肠风下血等症。
葛花在我国分布广泛，植物资源丰富，其中黄酮、皂苷等有效成分，有很强的药理活性。但国内对其化学成分、药理作用和临床应用的研究还不够深入，目前在我国主要有葛花解醒汤用于临床，葛花茶、葛花露等保健品上市。主要局限于解酒、保肝药等。
在公开号为CN1723988A的专利文献中，公开了葛花苷的药物组合物及其应用。其中有关于葛花苷(葛花中主要活性成分之一kakkalide，5，7-dihydroxy-6，4′-dimethoxyisoflavone-7-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside)抗心脑缺血性疾病的药理数据，数据表明，葛花苷对心脑血管缺血性疾病有一定疗效，但是其溶解性问题限制了其制剂的发展，为解决溶解性该专利使用了羟乙基-β-环糊精等存在争议的辅料，对于今后的临床用药留下了安全隐患。
为了克服葛花苷及其苷元(尼泊尔鸢尾异黄酮)水溶性差的不足，在公开号为CN 1594307A的专利文献中，公开了野葛花中尼泊尔鸢尾异黄酮的提取分离及其磺化物制备方法和药物用途。利用磺化反应制得水溶性较好，且具一定药用价值的尼泊尔鸢尾异黄酮-3`-磺酸钠。但是，在经过大量药理实验得出，尼泊尔鸢尾异黄酮-3`-磺酸钠对心、脑血管病的治疗效果并不理想。

发明内容
本发明的技术任务是，提供一种从葛花中提取尼泊尔鸢尾异黄酮的提取方法。
本发明的另一个技术任务，是根据上述现有技术的不足，提供一种具有良好的药用价值，高水溶性尼泊尔鸢尾异黄酮衍生物。
本发明进一步的技术任务是提供一种治疗心、脑血管病及骨质疏松症的药物组合物。
本发明另一技术任务是提供上述衍生物在制备治疗心、脑血管病及骨质疏松症的药物方面的用途。
从葛花中提取分离下述式(I)尼泊尔鸢尾异黄酮的方法 该提取方法包括以下步骤a、将干燥后的葛花用30％～95％乙醇加热回流提取，过滤并收集滤液；b、回收滤液中的乙醇至无醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置过夜；d、取上清液，过大孔树脂，用乙醇水溶液洗脱；e、回收洗脱液，放置析出结晶；f、晶体过滤、干燥后，用丙酮或醇水重结晶，固体物用10-50倍固体物量的乙醇或甲醇酸水溶液水解；g、冷却过滤水解产物，水洗至中性即得到所需产物。
优选的提取方法包括以下步骤a、将干燥后的葛花用80％-95％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-4小时，过滤并收集滤液；b、回收滤液中的乙醇至无醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置过夜；d、取上清液，过101大孔树脂，用40-70％乙醇洗脱；e、回收洗脱液，放置析出结晶；f、晶体过滤、干燥后，用丙酮重结晶，固体物用10-50倍固体物量的60％～80％乙醇或甲醇水溶液水解，在乙醇或甲醇水溶液中含有质量百分比为3％～6％的酸，酸可以是HCl或H2SO4；g、冷却过滤水解产物，水洗至中性即得到所需产物。
由下述通式(II)表示的尼泊尔鸢尾异黄酮的衍生物或其药用盐 其中式中的R1，R3各自独立地是H、-CH2CH2OH、C1-8烷基、C2-8链烯基、C2-8链炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同时为H；以及，NR4R5为
R4、R5各自独立地是H、C1-8烷基、C2-8链烯基、C2-8链炔基、-C6H5、-CH2C6H5；R4为H时，R5不可选用-CH3；R5为H时，R4不可选用-CH3。
本发明所说的尼泊尔鸢尾异黄酮衍生物的药用盐是指药学上可接受的盐，例如与盐酸、硫酸、磷酸、亚磷酸等无机酸形成的盐，或是与门冬氨酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、马来酸、富马酸、酒石酸等有机酸形成的盐，或非天然氨基酸盐等。
C1-8烷基是指具有1-8个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
C2-8链烯基是指具有2-8个碳原子的直链或支链的链烯基，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基、1-庚烯基、1-辛烯基等。
C2-8链炔基是指具有2-8个碳原子的直链或支链的链炔基，例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、1-庚炔基、1-辛炔基等。
优选为R1，R3各自独立地是H、-CH2CH2OH、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4链炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同时为H；以及，NR4R5为 及其衍生物。
R4、R5各自独立地是H、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4链炔基、-C6H5、-CH2C6H5。
最佳为R1，R3各自独立地是H、-CH2CH2OH、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同时为H；
以及，NR4R5为 R4、R5各自独立地是H、C1-2烷基。
本发明的最佳化合物为R1、R3为H，R2为-CH2NR4R5，R4、R5为-CH3，其结构如式(III)所示 R1、R3为H，R2为-CH2NR4R5，NR4R5为 其结构如式(IV)所示 R1、R3为-CH2CH2OH，R2为H，其结构如式(V)所示
本发明所述的通式(II)结构的化合物中，对于其具体取代集团，根据其取代位置的不同，均可由式(I)结构的尼泊尔鸢尾异黄酮为原料，根据对制备同类取代化合物的已知制备方法和原则，采用相应的方法制备得到。
例如，制备上述式(IV)所示的8-亚甲基-哌啶基-尼泊尔鸢尾异黄酮的方法为以式(I)结构的尼泊尔鸢尾异黄酮为原料，甲醛或多聚甲醛、哌啶与甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环中的一种或几种的混合物混合，加热至50-70℃反应，反应后冷却，过滤得到化合物(IV)。反应方程式为 制备上述式(III)所示的8-亚甲基-二甲氨基-尼泊尔鸢尾异黄酮对应的盐酸盐的方法为以式(I)结构的尼泊尔鸢尾异黄酮为原料，甲醛或多聚甲醛、二甲胺的盐酸盐与甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环中的一种或几种的混合物混合，控温50～70℃反应，反应后冷却，过滤得到化合物(III)，并且可以继续和HCl反应制备式(III)结构对应的盐酸盐化合物(VI)。反应方程式为 制备上述式(V)所示的5，7-二羟乙基-6，4′-二甲氧基尼泊尔鸢尾异黄酮的合成方法为以式(I)结构的尼泊尔鸢尾异黄酮为原料，氯乙醇或环氧乙烷与水混合，在碱性环境中控温50～90℃反应后冷却，过滤得到化合物(V)。反应方程式为
本发明的尼泊尔鸢尾异黄酮的衍生物或其药用盐可经口或不经过口给药，给药量因药物不同而各有不同，对成人来说，每天100mg-300mg比较合适。
经口服给药时，使该化合物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂等形式给药。制备上述制剂时，均可使用常规的制剂技术。
经大量药理试验及动物试验可得，本发明的尼泊尔鸢尾异黄酮的衍生物或其药用盐具有很好的水溶性，对改善和治疗心、脑血管病及骨质疏松症有明显效果。
实施方式下面的实施例、制剂实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
〔实施例1〕5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(尼泊尔鸢尾异黄酮)的提取分离。
a、将10kg干葛花粉碎，用90％乙醇水溶液加热回流提取2次，每次3小时，过滤并收集滤液；b、减压回收溶剂，至无醇味；c、加溶液6倍量水约30L，放置过夜；d、取上清液，过101大孔树脂，用60％乙醇水溶液洗脱；e、洗脱液回收，放置10小时析出结晶；f、晶体过滤、干燥后，用丙酮重结晶，固体物用固体物30倍量的70％乙醇水解，(乙醇中含5％的HCl)；
g、冷却过滤水解产物，水洗至中性即得到所需产物为淡黄色针状结晶。熔点(m.p.)189～190℃，提取率1％。UVλmax(MeOH)266，335nm；λmax(MeOH+AlCl3)275，315，375nm；λmax(MeOH+AlCl3+HCl)277，312，374nm；λmax(MeOH+NaOAc)271，335nm。IR(KBr)cm-13450(OH)，3067，2960，1658(C＝O)，1660，1624，1576，1515，1460，1371，1294，1231。紫外测定中加入NaOAc红移5nm，示有7-OH。AlCl3/HCl谱和AlCl3谱一致，示无邻二酚羟基结构。且较MeOH谱有变化，示有3-及/或5-OH。13CNMR(DMSO-d6，150MHz，δ，ppm)180.6(C-4)，159.3(C-4′)，157.7(C-7)，154.5(C-2)，153.4(C-5)，152.9(C-9)，131.6(C-6)，130.3(C-2′，C-6′)，123.1(C-3)，121.6(C-1′)，113.9(C-3′，C-5′)，105.0(C-10)，94.1(C-8)，60.1(6-OCH3)，55.3(4′-OCH3)。1HNMR(DMSO-d6，600MHz，δ，ppm)13.05(1H，s，5-OH)，7.90(1H，s，2-H)，7.45(2H，d，J＝8.8Hz，2′-H，6′-H)，7.05(2H，d，J＝8.8Hz，3′-H，5′-H)，6.60(1H，s，7-OH)，6.55(1H，s，8-H)，3.91(3H，s，6-OCH3)，3.78(3H，s，4′-OCH3)。光谱数据与尼泊尔鸢尾素文献报道一致。
表1.本发明实施例的尼泊尔鸢尾异黄酮的衍生物及其药用盐

注集团a为

集团b为

集团C为

〔实施例2〕8-亚甲基-二甲氨基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物1，结构式III)搅拌下将实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、甲醛1ml、二甲胺2ml溶解于乙醇，在70℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.3g化合物1。m.p.185～193℃。
〔实施例3〕用二甲胺的盐酸盐代替实施例2中的二甲胺，即可得到8-亚甲基-二甲氨基-尼泊尔鸢尾异黄酮盐酸盐(化合物2)。m.p.206～212℃。
〔实施例4〕用哌啶代替实施例2中的二甲胺，即可得到8-亚甲基-哌啶基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物3，结构式IV)。m.p.190～193℃。
〔实施例5〕化合物3与门冬氨酸在水中酸碱成盐反应，再经过减压干燥得到8-亚甲基-哌啶基-尼泊尔鸢尾异黄酮门冬氨酸盐(化合物4)。m.p.200～206℃。
〔实施例6〕5，7-二羟乙基尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物5，结构式V)将实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、环氧乙烷50ml，水中，碱性环境下，在70℃下控温反应8小时，冷却，过滤得到1.21g化合物5。m.p.172～176℃。
〔实施例7〕8-亚甲基-二乙胺基-尼泊尔鸢尾异黄酮盐酸盐(化合物6)用二乙胺盐酸盐代替实施例2中的二甲胺，即可得到8-亚甲基-二乙胺基-尼泊尔鸢尾异黄酮盐酸盐(化合物6)。m.p.216～219℃。
〔实施例8〕7-二甲胺基甲酰基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物7)搅拌下将实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、丙酮30ml、二甲胺基甲酰氯1ml，碳酸钾2g，在70℃下控温反应24小时，冷却，过滤，回收溶剂，得到1.4g淡黄固体，化合物7。
〔实施例9〕8-亚甲基-乙烯胺基-5，7-二羟乙基尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物8)用实施例6得到的化合物5与甲醛1ml、乙烯胺0.8ml溶解于乙醇，在70℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.1g化合物8。m.p.174～179℃。
〔实施例10〕8-亚甲基-苯胺基-5，7-二羟乙基尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物9)用实施例6得到的化合物5与甲醛1ml、苯胺1ml溶解于乙醇，在70℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.5g化合物9。m.p.184～189℃。
〔实施例11〕8-亚甲基-二乙胺基-5，7-二丙基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物10)实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、丙醇50ml、浓硫酸3ml，在80℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.1g化合物10。m.p.157～159℃。
〔实施例12〕8-亚甲基-二甲氨基-5-苄基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物11)实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、丙酮50ml、碳酸钾1.5g，氯苄2g在60℃下控温反应4小时，冷却，过滤蒸除溶剂得到1.9g化合物，甲醛1ml、二甲胺2ml溶解于甲醇，在70℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.9g化合物11。m.p.219～221℃。
〔实施例13〕8-亚甲基-二甲氨基-5，7-二苯基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物12)实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、丙酮50ml、碳酸钾5g，氯代苯2g在60℃下控温反应4小时，冷却，过滤蒸除溶剂得到1.8g化合物，甲醛1ml、二甲胺2ml溶解于甲醇，在70℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.9g化合物12。m.p.211～214℃。
〔实施例14〕8-亚甲基-己烯基-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物13)搅拌下将实施例1得到的5，7-二羟基-6，4′-二甲氧基异黄酮(1g)、甲醛1ml、己烯胺1.9ml溶解于乙醇，在70℃下控温反应4小时，冷却，过滤得到1.6g化合物13。m.p.201～203℃。
〔实施例15〕8-亚甲基-哌嗪-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物14)用哌嗪代替实施例2中的二甲胺，即可得到8-亚甲基-哌嗪-尼泊尔鸢尾异黄酮(化合物14)。m.p.192～194℃。
通过下面的试验说明本发明的化合物在改善和治疗心、脑血管病及骨质疏松症的有明显效果。
〔试验实施例1〕静脉滴注给药对麻醉犬急性心肌缺血的影响试验样品将表1中的化合物6溶于蒸馏水中，浓度为80.0mg/kg(试验组)。
对照样品葛根素注射液，100mg/kg(阳性对照组)；尼泊尔鸢尾异黄酮-3’-磺酸钠(简称磺酸钠对照)溶于蒸馏水中，浓度为80.0mg/kg。
生理盐水(心肌缺血模型组)。
动物杂种犬20只，体重12.0～16.5kg，雌雄兼有，购自济南郊区。实验前驯养1周，择其正常、健康、雌性无孕者供试验用。
仪器BioPAC多导生理信号采集分析系统，美国BioPAC公司。KNOEPRO型全自动生化分析仪，芬兰康艺仪器公司。XD-2型心外膜电极，北京中医研究院西苑医院。Q811型求积仪，浙江新安江科学仪器厂。
方法正常健康犬20只，体重12.0～16.5kg，雌雄兼有，随机分为4组，即试验组80.0mg/kg，磺酸钠对照组80.0mg/kg，阳性对照药葛根素注射液组100mg/kg及心肌缺血模型组。动物经2.5％戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉麻醉，分离气管并插管，备接电动呼吸器行人工呼吸。分离股静脉备用(供取血用)。犬右侧卧位，于左侧第四肋间隙开胸，做心包床，分离冠状动脉左前降支近1/2处，引线备结扎用。将心外膜电极缝于心外膜上，经波段开关与BioPAC多导生理信号采集分析系统相连记录心外膜电图。术后缓慢恒速静脉滴注生理盐水，以补充体液。结扎冠状动脉后30min记录心外膜电图，计算30个导联ST段移位的总值(∑-ST)及ST段移位超过2mv的导联数(N-ST)作为药前值。静脉滴注给药，滴速40滴/min。给药体积为10.0ml/kg，心肌缺血模型组给予等体积的生理盐水。分别记录给药开始后15min、30min、60min、90min、120min、180min及240min的心外膜电图，计算∑-ST、N-ST及其变化率。同时分别于给药前和给药后2h、4h由犬股静脉取血检测CK-MB、CK、AST、LDH。给药后4h，经左心耳根部向左房注入碳素墨水1.0ml/kg，20-30秒内注完，迅速取下心脏，去除脂肪、心房及右室肌，于-20℃下冰冻30-40min，称重。在冠状动脉结扎点下平行冠状沟将左心室切成等厚的5片，分别称重，用求积仪测量每片心肌两面碳素墨水染色区(非缺血区)及未染色区(缺血区)面积，计算缺血区占左心室肌重量的百分率。然后将5片心肌置于37℃N-BT染液中，振摇染色15min取出，如上测出梗塞区(浅红色)及非梗塞区(暗红色)面积，计算梗塞区占左心室肌重量的百分率，并计算出梗塞区占缺血区心肌重量的百分率。实验结果分别与心肌缺血模型组比较，进行统计学分析处理。
结果
(1)试验组对麻醉犬急性心肌缺血程度(∑-ST)的影响试验组给药后240min可以明显减轻麻醉犬急性心肌缺血程度(∑-ST)，与心肌缺血模型组比较均有明显差异(P＜0.05)。葛根素注射液给药后240min明显减轻麻醉犬急性心肌缺血程度(P＜0.05)。磺酸钠对照组无明显差异。结果详见表2。
(2)试验组对麻醉犬急性心肌缺血范围(N-ST)的影响试验组给药后240min明显缩小麻醉犬急性心肌缺血范围(N-ST)，与心肌缺血模型组比较有明显差异(P＜0.05)。葛根素注射液给药后240min明显缩小麻醉犬急性心肌缺血范围(P＜0.05)，180min有降低趋势。磺酸钠对照组无明显差异。结果详见表3。
(3)试验组对麻醉犬急性心肌缺血心肌梗塞面积的影响用N-BT染色显示的心肌梗塞面积与心外膜电图所测定的结果大致一致。试验组大剂量组具有明显减轻心肌缺血的损伤性作用，使麻醉犬急性心肌梗塞面积明显缩小，与心肌缺血模型组比较均有明显差异(P＜0.05)。葛根素注射液与试验组作用相当。磺酸钠对照组无明显差异。结果详见表4。
(4)试验组对麻醉犬急性心肌缺血心肌酶谱的影响试验组和葛根素注射液分别于给药后4h明显降低血清CK-MB，与心肌缺血模型组比较均有明显差异(P＜0.05)，但对CK、AST、LDH无明显影响。磺酸钠对照组无明显差异。结果详见表5、表6、表7、表8。
表2.试验组对犬急性心肌缺血程度(∑-ST)的影响(n＝5，X±SD)


注与缺血模型组比较*P＜0.05表中变化率为每只动物药后不同时间点变化率之和的均值。(下同)
表3.试验组对犬急性心肌缺血范围(N-ST)的影响(n＝5，X±SD)


注与缺血模型组比较*P＜0.05
表4.试验组对犬急性心肌缺血面积及梗塞面积的影响(n＝5，X±SD)

注与缺血模型组比较*P＜0.05
表5.试验组对犬急性心肌缺血心肌酶谱CK-MB(u/L)的影响(n＝5，X±SD)

注与缺血模型组比较*P＜0.05表6.试验组对犬急性心肌缺血心肌酶谱CK(u/L)的影响(n＝5，X±SD)

注与缺血模型组比较P＞0.05
表7.试验组对犬急性心肌缺血心肌酶谱AST(u/L)的影响(n＝5，X±SD)

注与缺血模型组比较P＞0.05表8.试验组对犬急性心肌缺血心肌酶谱LDH(u/L)的影响(n＝5，X±SD)

注与缺血模型组比较P＞0.05
〔试验实施例2〕对大鼠脑损伤的保护作用试验样品将表1中的化合物5溶于蒸馏水中，浓度为100mg/kg(大剂量组)、50mg/kg(中剂量组)及25mg/kg(小剂量组)。
对照样品盐酸川芎嗪注射液，7.2mg/kg(阳性对照组)；生理盐水(假手术组、脑缺血模型组)。
动物Wistar大鼠，体重160-180g，由山东鲁抗医药集团有限公司提供，许可证号鲁动质字200001001。
试验方法(1)试验组对大鼠急性脑缺血的保护作用Wistar大鼠90只，雌雄兼用，体重160-180g。随机分为6组，分别为假手术组、脑缺血模型组、试验组大剂量组100mg/kg、中剂量组50mg/kg、小剂量组25mg/kg、阳性对照药盐酸川芎嗪注射液组7.2mg/kg。每组15只。尾静脉注射给药。给药体积为1.0ml/200g。给药时间为阻断脑血流前20min。假手术组和脑缺血模型组均给予等体积的生理盐水。大鼠经25％乌拉坦(1g/kg)腹腔麻醉，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，双重结扎(假手术组仅穿双线但不结扎)，造成急性实验性不完全性脑缺血。结扎后3h快速断头取脑，装入称量瓶称脑湿重，计算脑指数，然后置于110℃烤箱中烘至恒重，称脑干重，计算脑含水量。其中各组均有5只大鼠实验完毕，迅速取出脑组织，经10％福尔马林固定，常规切片，染色，以检测脑组织形态学变化。
(2)试验组对大鼠脑组织毛细血管通透性的影响Wistar大鼠60只，体重160-180g，雌雄各半。随机分为6组，即假手术组、脑缺血模型组、试验组大剂量组100mg/kg、中剂量组50mg/kg、小剂量组25mg/kg、阳性对照药盐酸川芎嗪注射液组7.2mg/kg。尾静脉注射给药。给药体积为1.0ml/200g。给药时间为阻断脑血流前20min。假手术组和脑缺血模型组给予等体积的生理盐水。动物用25％乌拉坦(1g/kg)腹腔麻醉。颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，穿线备用。缺血模型组及各药物实验组则在结扎两侧颈总动脉前5min由尾静脉注射伊文思蓝50mg/kg。假手术组与模型组和各实验组注射伊文思蓝的时间、剂量相同，但不结扎两侧颈总动脉。结扎3h后，断头取脑称重，并分别浸泡于甲酰胺溶液(4ml/脑)中，在45℃恒温箱中温育72h，待脑组织中伊文思蓝色素全部浸出，取含伊文思蓝色素液用722型光栅分光光度计620nm处进行比色，测定OD值。
结果(1)对脑指数和脑含水量的影响结果表明，脑缺血模型组的脑指数和脑含水量明显高于假手术组，经统计学处理有显著性差异(P＜0.05)，说明脑缺血模型是成功的。试验组大、中两个剂量组均明显降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑指数升高和脑含水量增加，表明试验组可明显减轻大鼠急性不完全性脑缺血所引起的脑水肿。结果详见表9。
表9.试验组对急性不完全性脑缺血大鼠脑指数、脑含水量的影响(X±s，n＝10)

注与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与脑缺血模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01(2)脑组织病理形态学检查结果假手术组大脑皮层、小脑、海马等组织结构正常，无充血、水肿及脑软化灶等改变。神经细胞、胶质细胞未见变性、坏死等形态学改变。
脑缺血模型组脑组织充血、水肿，小血管扩张。部分神经元轻度肿胀，海马区部分神经细胞明显肿大，部分坏死。
试验组大剂量组脑组织轻度充血、小血管轻度扩张。部分神经元轻度肿胀，海马区部分神经细胞肿大，少量坏死。缺血改变明显轻于模型组。
试验组中剂量组脑组织轻度充血、小血管轻度扩张。部分神经元轻度肿胀，海马区部分神经细胞肿大，少量坏死。缺血改变轻于模型组。
试验组小剂量组脑组织轻度充血、小血管轻度扩张。部分神经元轻度肿胀，海马区部分神经细胞肿大，少量坏死。缺血改变轻于模型组。
盐酸川芎嗪注射液组脑组织轻度充血、小血管轻度扩张。部分神经元轻度肿胀，海马区部分神经细胞肿大，少量坏死。缺血改变轻于模型组。
(3)对脑缺血模型大鼠脑毛细血管通透性的影响结果表明，脑缺血模型组脑毛细血管通透性明显高于假手术组。表现为单位脑组织伊文思蓝含量显著升高；盐酸川芎嗪注射液组和试验组大、中剂量组伊文思蓝含量均明显减少，使单位组织伊文思蓝含量恢复至正常或接近正常，与模型组比较有显著性差异。结果见表10。
表10.试验组对大鼠脑组织毛细血管通透性的影响(X±s，n＝10)

注与假手术组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01结果表明，脑缺血模型组脑毛细血管通透性明显高于假手术组。试验组大剂量组、中剂量组可以明显降低脑缺血引起的毛细血管通透性。
本实验例表明，结扎大鼠双侧颈总动脉形成急性不完全性脑缺血时，脑指数、脑含水量和毛细血管通透性均明显增加，而试验组通过减少脑指数、减轻毛细血管通透性、缓解脑水肿，血脑屏障通透性改变，大脑局部血流量增加。可以改善脑微循环血液灌流，改善脑组织的缺血状态，减轻脑组织的缺血性损伤，从而对大鼠缺血性脑损伤有很好的保护作用，有望成为治疗缺血性脑血管病的良药。
〔试验实施例3〕试验组的抗骨质疏松作用试验样品将表1中的化合物4溶于蒸馏水中，浓度为100mg/kg(大剂量组)、50mg/kg(中剂量组)及25mg/kg(小剂量组)。
对照样品尼尔雌醇，150mg/kg(阳性对照组)；生理盐水(假手术组、模型组)。
动物Wistar大鼠，山东大学实验动物中心提供，许可证号鲁动质字200001001。
方法对切除卵巢大鼠骨质疏松模型的治疗作用取雌性大鼠60只，体重230-270g，除假手术组只开腹分离双测卵巢而不作切除外，其余各组大鼠在无菌条件下，腹腔注射1％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，切除双测卵巢建立大鼠骨质疏松模型，术后腹腔注射0.5ml庆大霉素预防感染。术后2周开始给药，将大鼠随机分为5组，分别为假手术组、模型组、受试物大(100mg/kg)、中(50mg/kg)、小(25mg/kg)剂量组及阳性对照尼尔雌醇组，每组10只，给药体积1ml/200g，每天给药1次，连续60天，假手术组及模型对照组给予等体积的蒸馏水。在给药50天取静脉血测血清钙、磷、碱性磷酸酶及雌激素，给药60天，将大鼠处死，解剖大鼠子宫肉眼观察子宫发育情况并进行病理组织学检查，取双测股骨，一侧作骨钙含量测定，一侧作病理组织学检查。
结果(1)对血清钙、磷及碱性磷酸酶的影响，结果见表11。
表11.对血清钙、磷及碱性磷酸酶的影响(n＝10.X±SD)

由表11可见，试验组大、中剂量组大鼠血清钙、磷、血清碱性磷酸酶与模型组比较有升高趋势，但无显著差别。
(2)对血清雌激素、骨钙的影响，结果见表12。
表12.对血清雌激素、骨钙的影响(n＝10，X±SD)

由表12可见，受试物大、中剂量组骨钙含量与模型组比较有升高趋势，受试物大剂量使血清雌激素水平有明显升高趋势，但无统计学意义。
(3)子宫病理组织学检查结果去势模型组子宫内膜上皮轻度萎缩，分泌不活跃；大部分腺体呈轻至中度萎缩，部分腺体反应性扩张但腺细胞无分泌功能，腔内无分泌物；间质细胞反应性增生，固有层内血管明显减少，肌层及外膜变薄。
假手术组子宫内膜上皮及腺体正常，上皮细胞及腺细胞分泌活跃；无间质反应性增生，固有层有炎细胞浸润，血管正常，无明显扩张充血，肌层及外膜正常。
阳对组子宫内膜上皮正常，腺体欠发达，腺细胞分泌不活跃；固有层有炎细胞浸润，与去势组比较，间质疏松，无间质细胞增生，有少量血管；肌层层次正常，但血管欠发达，外膜正常。
试验组小剂量组子宫内膜上皮轻度萎缩，分泌不活跃；间质细胞轻度反应性增生，固有层腺体发达，腺细胞分泌活跃，血管较去势模型组及阳对组丰富；肌层及外膜正常。
试验组中剂量组子宫内膜上皮趋于正常，分泌活跃；间质正常，固有层腺体发达，腺细胞分泌活跃，血管更加丰富；肌层及外膜正常。
试验组大剂量组子宫内膜上皮正常，分泌活跃；间质正常，固有层腺体发达，腺细胞分泌活跃，与小、中剂量组比较无明显差异；血管更加丰富、充盈；肌层及外膜正常。
(4)股骨病理组织学检查结果假手术组骨小梁排列密集，互相连接呈网状结构，骨小梁厚度大，其间距小，骨细胞正常。
去势模型组去除卵巢后骨小梁变细，部分断裂，骨吸收陷凹增多，髓腔扩大，皮质骨变薄。与假手术组比较，同样倍数下骨小梁的连接中断点多，骨小梁明显减少，髓腔间距增大，正常骨细胞减少，骨细胞空陷凹增多。
阳对组与去势组比较骨小梁规则，数目明显增多，厚度增加，断裂少，髓腔间隙变小。同样倍数下正常骨细胞接近假手术组。
试验组小剂量组与去势组比较，骨小梁数目轻度增多，厚度轻度增加，骨细胞空陷凹减少，但正常骨细胞仍较少。
试验组中剂量组骨小梁数目较试验组小剂量组增多，厚度增加，髓腔间隙变小，正常骨细胞增多，但仍低于阳对组。
试验组大剂量组骨小梁数目明显增多，厚度增加，断裂少，髓腔间隙变小，同样倍数下正常骨细胞数目接近阳对组，骨组织学改变程度稍重于假手术组。
结论在本试验所用剂量范围内，试验组能够促进骨钙沉积，减轻切除卵巢大鼠骨皮质变薄程度，增加骨小梁数量，减少破骨细胞数量；说明试验组对骨质疏松症具有明显的预防和治疗作用，且这种作用呈现一定剂量依赖性。
下面的实施例说明包含由本发明提供的化合物的药用制剂。
〔制剂实施例1〕片剂按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成份化合物1 60mg、乳糖 80mg、硬脂酸镁 3mg、聚乙烯吡咯烷酮7mg。
〔制剂实施例2〕胶囊按照本领域已知的方法制备胶囊，每个胶囊中含有下述成份化合物2 60mg、乳糖 85mg、玉米淀粉 20mg硬脂酸镁 1mg 聚乙烯吡咯烷酮 4mg。
〔制剂实施例3〕注射液按照本领域已知的方法制备注射液，每个注射液中含有下述成份化合物5 100mg、注射用水 10ml。
采用常规法注射剂的制备工艺制成，每瓶10ml，含化合物5(100mg)。用法葡萄糖注射液稀释，肌肉注射，一日二次，每次1-2支；静脉点滴，一日一次，每次2-3支。
〔制剂实施例4〕冻干制剂、无菌粉末按照本领域已知的方法制备冻干制剂、无菌粉末。每个冻干制剂、无菌粉末中含有下述成份化合物7 100mg、甘露醇 120mg。
采用常规法冻干制剂、无菌粉末的制备工艺制成，每瓶含化合物7(100mg)。用法葡萄糖注射液稀释，肌肉注射，一日二次，每次1-2瓶；静脉点滴，一日一次，每次2-3瓶。
权利要求
1.从葛花中提取分离下述式(I)尼泊尔鸢尾异黄酮的方法 该提取方法包括以下步骤a、将干燥后的葛花用30％～95％乙醇加热回流提取，过滤并收集滤液；b、回收滤液中的乙醇至无醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置过夜；d、取上清液，过大孔树脂，用乙醇水溶液洗脱；e、回收洗脱液，放置析出结晶；f、晶体过滤、干燥后，用丙酮或醇水重结晶，固体物用10-50倍固体物量的乙醇或甲醇的酸水溶液水解；g、冷却过滤水解产物，水洗至中性即得到所需产物。
2.根据权利要求1所述的提取方法，该方法包括以下步骤a、将干燥后的葛花用80％-95％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-4小时，过滤并收集滤液；b、回收滤液中的乙醇至无醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置过夜；d、取上清液，过101大孔树脂，用40-70％乙醇洗脱；e、回收洗脱液，放置析出结晶；f、晶体过滤、干燥后，用丙酮重结晶，固体物用10-50倍固体物量的60％～80％乙醇或甲醇水溶液水解，在乙醇或甲醇水溶液中含有质量百分比为3％～6％的酸，酸可以是HCl或H2SO4；g、冷却过滤水解产物，水洗至中性即得到所需产物。
3.由下述通式(II)表示的尼泊尔鸢尾异黄酮的衍生物或其药用盐 其中R1，R3各自独立地是H、-CH2CH2OH、C1-8烷基、C2-8链烯基、C2-8链炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同时为H；以及，NR4R5为 及各结构衍生物；R4、R5各自独立地是H、C1-8烷基、C2-8链烯基、C2-8链炔基、-C6H5、-CH2C6H5；R4为H时，R5不可选用-CH3；R5为H时，R4不可选用-CH3。
4.根据权利要求3所述化合物，其中，R1，R3各自独立地是H、-CH2CH2OH、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4链炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同时为H；以及，NR4R5为 R4、R5各自独立地是H、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4链炔基、-C6H5、-CH2C6H5。
5.根据权利要求3所述化合物，其中，R1，R3各自独立地是H、-CH2CH2OH、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同时为H；以及，NR4R5为 R4、R5各自独立地是H、C1-2烷基。
6.根据权利要求3所述化合物，其中，R1、R3为H，R2为-CH2NR4R5，R4、R5为-CH3，其结构如式(III)所示。
7.根据权利要求3所述化合物，其中，R1、R3为H，R2为-CH2NR4R5，NR4R5为 其结构如式(IV)所示。
8.根据权利要求3所述化合物，其中，R1、R3为-CH2CH2OH，R2为H，其结构如式(V)所示。
9.用于改善或治疗心、脑血管病，骨质疏松症的药物组合物，其中含有权利要求3的尼泊尔鸢尾异黄酮衍生物或其药用盐作为有效成分，并含有药学上可以接受的载体。
10.权利要求3-8中任意一项的化合物在制备改善或治疗心、脑血管病，骨质疏松症的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种从葛花中提取分离尼泊尔鸢尾异黄酮的方法，新颖的通式(II)的尼泊尔鸢尾异黄酮衍生物或其药用盐。本发明还涉及该衍生物的制备方法，以该衍生物为活性成份的药物组合物，以及该衍生物和其药用组合物在制备改善或治疗心、脑血管疾病和抗骨质疏松的药物中的应用。
文档编号A61P9/00GK1911924SQ20061006840
公开日2007年2月14日 申请日期2006年8月18日 优先权日2006年8月18日
发明者仲英, 王福文, 刘鲁, 解砚英, 王菊, 牟艳玲, 左春旭, 胡志力, 王元书, 周玲 申请人:山东省医学科学院药物研究所