一种卷枝毛霉在降解棉酚中的应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种及其应用的
技术领域：
，具体的涉及一种降解棉酚的卷枝毛霉应用的
技术领域：
。
背景技术：
：棉酚(gossypol)俗称棉毒素，占普通棉籽的0.7％-4.8％，是锦葵科棉属植物色素腺产生的多酚二萘衍生物，存在棉花的根、茎、叶和籽实的色素腺体中，尤其是籽实棉仁的球状腺体中含量较多。棉酚纯品为黄色结晶，能溶于低沸点石油醚和水，熔点181-185℃，分子量518.55。棉籽体内棉酚的存在形式有两种，即结合棉酚和游离棉酚。结合棉酚在机体消化系统中不被吸收，可很快随粪便排出体外，毒性很低。游离棉酚分子结构中的活性基团对动物毒性很大，游离棉酚含量在0.02％时无毒，0.02％-0.05％时轻微毒性，高于0.15％时具有强毒性。棉粕是我国仅次于大豆粕的第二大植物蛋白资源，棉籽饼粕在饲料中的用量只有40％左右，极大地限制了棉籽饼粕在饲料工业上的大规模应用。因此有必要寻求一种有效方式来利用棉籽粕，降低棉酚含量，这对解决我国蛋白资源严重短缺发挥巨大作用。棉酚脱毒方法主要有物理脱毒法、化学钝化法、溶剂浸出法和生物脱毒法等。近几年利用微生物发酵棉粕以降低其中游离棉酚含量的脱毒方法越来越受到重视，也是目前普遍认为的成本低、效果好、较安全的脱毒方法。但不同微生物菌种对棉酚的降解能力有较大的差异，筛选优良的微生物菌种是影响棉籽饼粕脱毒效果和营养价值的重要步骤。目前报道的用于棉籽饼粕脱毒的菌株种类较少，主要包括酵母菌、霉菌和细菌等。因此，筛选新的具有快速、高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌具有十分重要的意义。卷枝毛霉在土壤、粪便、禾草及空气等环境中存在。在高温、高湿度的条件下生长良好。卷枝毛霉的用途很广，可以产生果胶酶、木聚糖酶、漆酶、凝乳酶等，卷枝毛霉能够大量产生γ-亚麻酸(gla)，这也是其主要的商业价值；卷枝毛霉还是全球首次利用微生物商业化培养生产油脂的菌株。但利用卷枝毛霉降解棉酚未有相关文献报道。技术实现要素：针对现有技术中尚未记载有关卷枝毛霉(mucorcircinelloides)领域在降解棉酚方面应用的技术现状，且现有棉籽粕作为我国第二大植物蛋白资源，本发明旨在为棉籽粕生物脱毒技术提供具有降解率高且发酵性能稳定的菌株，提供的菌种卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw1在降解棉酚中的应用。本发明通过在棉秸秆中分离筛选出一株卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw1，该菌种通过分类及系统鉴定分析可知就是常见的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)，利用该菌种卷枝毛霉(mucorcircinelloides)能够降解棉酚，利用该菌株棉酚降解能力对棉籽饼粕进行脱毒，对于微生物菌种应用
技术领域：
具有广泛的应用价值。本发明提供一种利用卷枝毛霉(mucorcircinelloides)在降解棉酚的应用，具体步骤如下：(1)菌株培养：将卷枝毛霉(mucorcircinelloides)菌株接种于液体pda培养基中，在30℃、转速120rpm的摇床中培养3-5天至稳定期，菌体浓度在每升含有15g干菌体；(2)液体种子制备：取5ml步骤(1)获得的菌液，室温下8000rpm/min离心5分钟，弃上清，沉淀加5ml无菌水充分混匀，再次8000rpm/min离心5分钟，重复清洗沉淀物3次后，用500ul无菌水将沉淀悬浮，即获得液体种子；(3)棉酚降解试验：在试管中装入8ml液体分离培养基，在无菌条件下，接入500ul步骤(2)制备好的液体种子，放置于30℃摇床培养。发明中，所述摇床转速为120rpm。进一步，本发明提供的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw1从棉秸秆中进行菌株的培养、分离和筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株编号为csgw1的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)，经16srdna序列分析、系统发育分析和微生物学特性分析结果，csgw1菌株属于卷枝毛霉(mucorcircinelloides)，通过对该菌种基因测序，所得序列在ncbi网站进行比对分析，经比对分析发现，菌株csgw1的16srrna基因序列与mucorcircinelloides的同源性最高，为100.0％，为同一株菌。可见，本发明采用csgw1菌株属于常见的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)，公众可通过公知菌种保藏单位或其它公共渠道购买。进一步，本发明提供的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)在降解棉酚中的应用，并不仅限于采用提供的csgw1菌株，只要是卷枝毛霉(mucorcircinelloides)在降解棉酚中的应用都获得降解棉酚显著的技术效果，因此对卷枝毛霉菌的利用和通过其降解棉酚对棉籽饼粕进行脱毒的研究和利用具有重要价值。通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本
发明内容，可以达到以下有益效果：(1)本发明提供的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)在降解棉酚中的应用，采用的菌种卷枝毛霉(mucorcircinelloides)可在常见的pda培养基上生长，具有较高的降解棉酚的特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点。(2)本发明提供的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)在降解棉酚中的应用，利用分离出的菌种能够对棉籽饼粕进行脱毒，当培养温度为30℃，转速120rpm的摇床中培养3-5天后制得的种子培养液，棉酚降解率在67.5％，利用该菌株棉酚降解能力对棉籽饼粕进行脱毒，对于微生物菌种应用
技术领域：
具有广泛的应用价值。附图说明图1所示为棉酚标准曲线图。图2所示为棉酚检测液相色谱图。具体实施方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。本发明实施例中采用如下基础培养基：液体分离培养基：(nh4)2so42g，mgso4·7h2o0.2g，nah2po4·h2o0.5g，cacl2·2h2o0.1g，k2hpo40.5g，琼脂15g，醋酸棉酚2g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.0；pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加蒸馏水至1.0l。dna抽提试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。液相色谱仪：美国安捷伦1260hplc。实施例一：卷枝毛霉csgw1的分离、筛选及鉴定(一)分离、纯化：从棉秸秆样品中，取5g样品加入到50ml无菌水中混合，放置于摇床上，在25℃、转速100rpm/min振摇30分钟后，在无菌条件下用一层灭菌纱布过滤混合液，弃去滤渣，滤液在室温，4000rmp/min离心1分钟，弃去上清，沉淀用5ml无菌水悬浮后，继续用无菌水进行梯度稀释，然后进行梯度稀释，从10-6、10-7、10-8三个稀释度中各取200ul稀释液涂布于分离样板上，置于30℃培养箱培养5天。从平板中挑取单菌落，接种于新的分离平板中进行纯化，重复3-4次纯化卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw1。纯化后的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw1接种于培养基上，30℃培养箱恒温培养3-4天后，4℃保存备用。(二)分类、鉴定：1、卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw116srdna的序列测定与分析：(1)pcr模板dna的提取将卷枝毛霉(mucorcircinelloides)csgw1接种于pda液体培养基中，30℃培养72h，获得菌体细胞，采用新型植物基因组dna快速提取试剂盒进行基因组dna提取。(2)pcr扩增引物：its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。反应体系：组成体积/ul2xmix25its1(10μm)1its4(10μm)1dna模板2ddh2oto50pcr扩增条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃50s，35个循环；延伸72℃10min。(3)序列测定pcr扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列如seqidno:1所示。所得序列在ncbi网站进行比对分析，经比对分析发现，经比对分析发现，菌株csgw1的16srrna基因序列与mucorcircinelloides的同源性最高，为100.0％，菌株csgw1与mucorcircinelloides的亲缘关系最近，为同一株菌。可见，本发明采用csgw1菌株属于常见的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)，公众可通过公知菌种保藏单位或其它公共渠道购买。实施例二：卷枝毛霉(mucorcircinelloides)降解棉酚试验1、种子液制备(1)菌株培养：选用卷枝毛霉csgw1菌株接种于液体pda培养基中，在30℃、转速120rpm的摇床中培养3-5天至稳定期，菌体浓度在每升含有15g干菌体左右；(2)液体种子制备：取5ml培养好的菌液，室温下8000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用5ml无菌水充分悬浮，再次离心，重复离心3次后，用500ul无菌水将沉淀悬浮，此菌液即为液体种子。2、棉酚降解试验：在2×18cm试管中装入8ml液体分离培养基，无菌条件下接入步骤2制备好的液体种子500ul，放置于摇床中，在30℃、转速120rpm下培养7天；做5个重复培养试验。3、液相色谱法测定棉酚含量：(1)标准曲线制备：准确称取经纯度折算后的棉酚10.0mg，用丙酮溶解并定容至10ml，配制成质量浓度为1.0g/l的标准储备溶液，进一步采用无水乙醇稀释成质量浓度为10.0、20.0、40.0、60.0、100.0μg/l的标准工作溶液。(2)测定样品制备：将发酵液中的菌体在无菌条件下用接种环全部挑出后，量取1ml发酵液于50ml容量瓶中，加入丙酮至50ml，振摇20min。以4000r/min离心5min后，静置5min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，供液相色谱测定，此结果为发酵液中棉酚含量。将发酵液中的菌体在无菌条件下用接种环全部挑出后，用无菌水洗涤2-3次，在8000rpm下离心2分钟后，吸去上清，将菌体置于研钵中加入液氮研磨至粉末状，用前述相同的方法进行棉酚提取及测定，此结果为菌体中棉酚含量。(3)分析条件色谱柱：agilentc18色谱柱(100mm×2.1mm，3.5μm)，紫外检测器(vwd)，流动相：乙腈(a)-0.1％甲酸溶液(b)，流速为0.30ml/min，柱温为室温，进样体积为5μl。梯度洗脱程序：0～2min：50％a，2～4min：50％～90％a，4～6min：90％a，6～7min：90％～50％a，7～10min：50％a。4、测定结果(1)标准曲线的绘制分别准确移取对照品储备液，用无水乙醇稀释配制系列浓度的棉酚标准溶液，分别对这些标准溶液进行液相色谱分析，测定各组分的峰面积，以标准品峰面积对应的质量浓度进行线性回归分析，得到标准曲线回归方程为y＝57.33921*x+6.5613834、r2＝0.99961，标准曲线如附图1所示。(2)样品的测定取培养7天后的发酵液进行制备，分别对发酵液处理样品和菌体处理样品，在相同的色谱条件下测定，每个样品进样4次，所得结果见表。棉酚检测液相色谱图如附图2所示，棉酚保留时间为6.347min。经过统计分析后，发酵前样品中棉酚含量平均值为1992.45ug/g，培养7天后的发酵液中棉酚含量平均值为647.5ug/g，发酵液处理棉酚降解率在67.5％；菌体中棉酚含量低于1ug/g湿菌体。以上试验表明，本发明通过在棉秸秆中分离筛选出一株卷枝毛霉(mucorcircinelloides)具有显著的降解棉酚能力，利用分离出的菌种对棉籽饼粕进行脱毒，当培养温度为30℃，转速120rpm的摇床中培养3-5天后制得的种子培养液，棉酚降解率在67.5％左右，利用该菌株棉酚降解能力对棉籽饼粕进行脱毒，对于微生物菌种应用
技术领域：
具有广泛的应用价值。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。序列表<110>新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心）<120>一种卷枝毛霉在降解棉酚中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>566<212>dna<213>卷枝毛霉(mucorcircinelloides)<400>1aatcaataattttggcttgtccattattatctatttactgtgaaatgtattattacttga60cgcttgagggatgctccactgctataaggataggcggtggggatgctaaccgagtcataa120tcaagcttaggcttggtatcctattattatttaccaaaagaattcagaattaatattgta180acatagacctaaaaaatctataaaacaacttttaacaacggatctcttggttctcgcatc240gatgaagaacgtagcaaagtgcgataactaatgtgaattgcatattcagtgaatcatcga300gtctttgaacgcaacttgcgctcattggtattccaatgagcacgcctgtttcagtatcaa360aacaaaccctctatccaacattttgttgaataggaatactgagagtctcttgatctattc420tgatctcgaacctcttgaaatgtacaaaggcctgatcttgtttgaatgcctgaacttttt480tttaatataaagagaagctcttgcggtaaactgtgctggggcctcccaaataatactttt540tttaaatttgatctgaaatcaggcgg566当前第1页12