本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种调节肠道、预防便秘的益生菌组合物及其制备方法。
背景技术：
市场上通便类保健食品的种类较多，剂型主要包括胶囊类、茶饮类、粉剂、口服液，所用的原料主要为番泻叶、大黄、火麻仁、枳实等具有致泻作用的物料，这些物料对人体都有副作用，且只能一时地解决便秘问题，无法根治，没有通过调理的原则去研发产品。其中以中药为主要成份的占了很大比例，保健效果不一，且有的制造成本较高，有个生产工艺较复杂。
益生菌是一类以通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物，是人体肠道重要的生理细菌，具有改善肠道菌群结构、促进肠道中有益菌的增殖、抑制有害菌的生长、消除致癌因子、提高机体免疫力、降低胆固醇、减缓乳糖不耐症等重要生理功效。而目前，存在的药物或者相关益生菌的产品在治疗预防便秘、治疗腹泻以及调节肠道方面作用不明显，亟待进一步改进。
技术实现要素：
本发明实施例的目的在于提供一种调节肠道、预防便秘的益生菌组合物及其制备方法，用以解决现有产品治疗腹泻、便秘效果差，产品制备工艺复杂的缺陷。
为实现上述目的，本发明实施例提供一种调节肠道、预防便秘的益生菌组合物，其以植物乳杆菌菌粉体以及植物乳杆菌代谢物粉体为活性成分。
优选的，所述植物乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：cctccno：m2018042。
优选的，所述组合物还包括菌粉载体，所述菌粉载体包括微晶纤维素、药用玉米淀粉、菊粉、硬脂酸镁；
其中，所述组合物的原料以质量份数计：植物乳杆菌菌粉体9-11份、植物乳杆菌代谢物粉体4-6份、微晶纤维素18-22份、药用玉米淀粉80-120份、菊粉8-12份、硬脂酸镁8-12份。
优选的，所述组合物包括以下质量份数的原料：植物乳杆菌菌粉体9.5-10.5份、植物乳杆菌代谢物粉体4.5-5.5份、微晶纤维素19-21份、药用玉米淀粉90-110份、菊粉9-11份、硬脂酸镁9-11份。
本发明实施例提供一种制备上述所述的组合物的方法，将所述植物乳杆菌通过扩大菌种培养、一级种子培养、种子罐培养以及发酵培养获得植物乳杆菌发酵菌液；
将所述植物乳杆菌发酵菌液离心分别收集植物乳杆菌菌泥及离心后的发酵液，并将所述植物乳杆菌菌泥和离心后的发酵液分别冷冻干燥粉碎和浓缩干燥粉碎，获得植物乳杆菌菌粉体以及植物乳杆菌代谢物粉体；
将所述植物乳杆菌菌粉体以及植物乳杆菌代谢物粉体与菌粉载体混合，得到所述组合物。
优选的，所述植物乳杆菌菌粉体的制备方法具体为：
将所述植物乳杆菌菌泥、无菌水、脱脂奶粉、低聚果糖、甘油、麦芽糊精以及低聚异麦芽糖混合得到植物乳杆菌悬菌液，将所述悬菌液冷冻干燥粉碎获得植物乳杆菌菌粉体。
优选的，所述悬菌液冷冻干燥在-35℃--30℃的条件下预冻2-5小时，-50℃--40℃真空冷冻干燥，粉碎成100目的植物乳杆菌菌粉。
优选的，所述植物乳杆菌代谢物粉体的制备方法具体为：
优选的，所述离心发酵液先经过低温浓缩至水分含量最多为20％的发酵液浓缩膏，将所述发酵液浓缩膏与药用玉米淀粉以5：1-4：1混合，得到混合物，然后在温度55℃-60℃，干燥时间40-50小时，粉碎得到含水量至多为3％的植物乳杆菌代谢物粉体。
本发明上述方法制备的组合物，在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：
1)调节肠道菌群；
2)预防便秘；
3)治疗腹泻。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例提供一种调节肠道、预防便秘的益生菌组合物，其中含有的植物乳杆菌菌粉体可以有效改善中老年人便秘腹/泻及带来的众多疾病，改善肠道的菌群环境。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例提供一种调节肠道、预防便秘的益生菌组合物，其主要改善中老年人便秘腹/泻及带来的众多疾病，改善肠道的菌群环境。
本发明实施例首先获得了一株新的菌株，该菌株分离自新鲜的苦瓜表皮中，经初筛、复筛而来，经16sdna鉴定为植物乳杆菌，其菌种的序列如seqidno.1所示。并对其进行了专利程序生物保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2018042。
实施例1
一、植物乳杆菌菌粉体扩大菌种培养
本发明实施例的菌种采用植物乳杆菌，生产中所使用的设备：菌种培养箱、超净工作台、恒温培养箱、各种试管、三角瓶、种子罐、发酵罐、真空冷冻干燥机、三维搅拌机、低温粉碎机、真空包装机。
菌种培养，对-80℃保存菌种的扩大培养，扩大菌种培养基的配制：葡萄糖20克、蛋白胨12克、牛肉浸粉6克、乙酸钠2克、吐温801ml、尿素0.5克、自来水1000毫升、ph值自然。
将以上配方中的葡萄糖等原料加入到配方中的1000毫升水中，搅拌30min使之溶化，然后分装于18*180的试管中，每只试管装10毫升，胶塞牛皮纸封口，放医用消毒器中0.1-0.12兆帕灭菌25min，扩大菌种培养基灭菌完毕。
在无菌条件下，在超净工作台中打开-80℃保存的盛有植物乳杆菌的冷冻管，室温融化后，然后再取以上灭好菌的试管培养基1支，将溶化好的-80℃的保存菌液，取1毫升加入试管中，用胶塞、牛皮纸封好管口，用手轻摇匀，放入恒温培养箱中37℃静置培养13小时即可，获得扩大菌种培养菌液。
二、植物乳杆菌菌粉体一级种子培养
一级种子培养基配方：葡萄糖26克、蛋白胨5克、牛肉浸粉4克、玉米浆3克、乙酸钠2克、吐温801ml、自来水1000毫升、ph值自然。
将上述原料加入到配方中的自来水中，开动搅拌机，搅拌20min，使全部溶化，此称为一级种子培养液。将搅拌溶化好的一级种子培养液按用量加入到三角瓶中，然后用6层纱布外加一层牛皮纸扎好瓶口，放入医用消毒器中灭菌，灭菌前首先打开消毒器上的排气阀门等有少量蒸汽排出时关闭，当消毒器上的压力达到0.05兆帕时，打开消毒器上的排气阀门排气6-8min，然后关闭排气阀门，继续加温，当消毒器中的蒸汽压力达到0.1-0.12兆帕时开始计时，灭菌时间为25min，完毕后离开热源，让其自然降温，当消毒器上的压力表归零时，打开消毒器，取出灭好菌的培养基放入超净工作台中自然降温，当温度降至37℃时，将以上培养好的扩大菌种液移接到三角瓶灭好菌的培养液中，接种量分别是1％，即一级种子培养液100毫升，接入扩大菌种培养菌液为1毫升，完毕后用原有纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养13小时即可，获得一级种子培养菌液。
三、植物乳杆菌菌粉体种子罐培养
对发酵设备、管道及无菌过滤系统的灭菌，首先，打开各进出管道及无菌空气管道的阀门，通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，让蒸汽与管道阀门联通并有少量蒸汽排出，通气40min，让管道内的蒸汽压力保持0.12-0.14兆帕，保持40min，然后关闭各进出管道阀门，备用。
种子罐及发酵罐的空罐灭菌，关闭各个阀门，打开罐底部的排污阀及罐夹层的排污阀，打开直接蒸汽阀门向罐内通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，当罐内达到121℃时开始计时，灭菌时间为40min，然后关闭罐底部排污阀及夹层排污阀，罐中温度自然降至37℃备用。
种子罐培养基的配方，以培养基各组分的重量百分比计算，包括葡萄糖10％、蛋白胨1％、尿素0.5％、磷酸氢二钾0.2％、玉米浆2％、乙酸钠0.2％、吐温800.4％、聚葡萄糖2％、聚醚消泡剂0.1％、自来水83.6％、ph值自然。
首先，将自来水投入到已空罐灭菌的种子罐中，开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料，然后在不停的搅拌中通入蒸汽加温，首先，利用罐夹层蒸汽加热到95℃时，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时保持30min即可达到灭菌的效果，然后关闭蒸汽，开始通过罐夹层的自来水冷却降温，当罐内温度达到37℃时，备用，此称为种子罐培养基。然后，将以上培养好的一级菌种培养菌液，在无菌条件下接种到种子罐中，接种量分别是罐内培养基的1％，即100kg种子罐培养基分别接入一级菌种液1kg即可。然后，盖好罐上的接种帽，开始搅拌培养，培养条件：温度37℃，ph值自然，搅拌转速80转/min，罐压0.05兆帕，培养时间18小时即可达到要求，如果罐压降低，可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的放气阀调整，获得种子罐培养菌种。
四、植物乳杆菌菌粉体发酵培养
发酵培养基各组分的重量百分比：葡萄糖10％，蛋白胨2％、聚葡萄糖3％、低聚异麦芽糖12％、乙酸钠2％、吐温800.1％、马铃薯淀粉5％、共轭亚油酸0.5％、无水氯化钙0.3％、硫酸镁0.5％，玉米浆4％，聚醚消泡剂0.1％，自来水60.5％，共100kg。
首先，将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的发酵罐中去，开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中所使用的原料，然后通入蒸汽加热。首先，利用夹层蒸汽加热到95℃，然后再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时开始计时，保持30min即可达到灭菌效果，然后通过夹层的自来水冷却降温，当罐中的温度降到37℃时开始接入菌种，接种前，首先提高种子罐的罐压力达到0.1兆帕，发酵罐的罐压保持0.05兆帕，然后，打开接种管道阀门，将种子罐培养好的种子通过压差的方式输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门。
接种量是每100kg发酵罐中的培养基接入种子罐培养的菌种3kg，培养条件为发酵温度37℃，搅拌转速120转/min，发酵时间16小时即可，罐压保持0.05兆帕，ph值自然，如果罐压降低可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的排气阀调整，此为发酵液。
五、植物乳杆菌的冷冻干燥
发酵完毕后将发酵液抽入到贮罐中，为了保证发酵液中菌体的完整性，选择离心转速非常重要。开动管式离心机，调整转速12000转/min，以每min进料15kg的进料速度进行离心，离心完毕后收集湿菌泥，将离心收集的湿菌泥进行冷冻干燥，离心后的发酵液可进行低温真空浓缩加入载体，真空干燥后复配成品用。
1、悬菌液的制备，取湿菌泥1000克，加入无菌蒸馏水3000毫升，脱脂奶粉300克，低聚果糖200克，98％的甘油100ml，麦芽糊精50克，低聚异麦芽糖300克。首先，取配方中的水1500毫升加热至50℃-55℃，在搅拌下加入麦芽糊精，溶化后再加入配方中余下的水，然后再加入配方中其它的原料。充分搅拌30min(25℃-35℃的条件下搅拌)。获得悬菌液，然后将该悬菌液放入30℃的恒温室或箱中恒温30min进行预冻。
冷冻干燥前的预冻，将恒温30min的悬菌液分装于冻干盘中，然后放入冷冻干燥机的预冻室内在零下30℃-35℃的条件下预冻3小时，冻结后进行抽真空干燥。真空干燥条件为：将预冻好的料盘放入真空干燥室开始抽真空干燥，干燥条件为：真空度为2-5帕，温度-45℃，干燥室温度28℃，干燥时间45小时。冻干完毕后收集冻干料用无菌粉碎机粉碎成细度为100目的菌粉密封包装备用，获得植物乳杆菌菌粉体。
2、离心发酵液的低温浓缩：浓缩条件，真空度0.06兆帕，温度55℃-65℃，浓缩至膏状，固形物含量80％，水分含量20％为止，然后加入药用玉米淀粉为载体，混匀后进行真空干燥。取浓缩膏1000克，加入药用玉米淀粉200克混匀放真空干燥箱中干燥，干燥条件为：真空度0.06兆帕，温度55℃-60℃，干燥时间45小时，水分含量3％为合格，然后将其粉碎至100目的粉，密封包装备用，获得植物乳杆菌代谢物粉体。
本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体5克、植物乳杆菌代谢物粉体3克、微晶纤维素10克、药用玉米淀粉20克，菊粉5克、硬脂酸镁5克，其中，微晶纤维素、药用玉米淀粉，菊粉、硬脂酸镁为菌粉载体。
将以上各物料放入固体搅拌混合机中混合均匀，然后在无菌条件下分装入胶囊中，装瓶或压片即为成品。
实施例2
本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体9克、植物乳杆菌代谢物粉体6克、微晶纤维素22克、药用玉米淀粉120克，菊粉12克、硬脂酸镁12克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例3
本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体9克、植物乳杆菌代谢物粉体4克、微晶纤维素22克、药用玉米淀粉120克，菊粉8克、硬脂酸镁8克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例4
本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物成品的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体11克、植物乳杆菌代谢物粉体6克、微晶纤维素18克、药用玉米淀粉80克，菊粉8克、硬脂酸镁8克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例5
本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物的复配：取100目的植物乳杆菌菌粉体11克、植物乳杆菌代谢物粉体6克、微晶纤维素18克、药用玉米淀粉80克，菊粉12克、硬脂酸镁12克。
其中，植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体均为实施例1中方法中制备的植物乳杆菌菌粉体和植物乳杆菌代谢物粉体。
实施例6植物乳杆菌菌粉体对活性炭诱导小鼠便秘的预防作用
选取体重约23g的雌性c57b6/n小鼠60只，平均分为3组，分别是正常组、便秘对照组、植物乳杆菌菌粉体处理组。适应饲养1周后，正常组和便秘对照组小鼠正常自由摄入饮食和饮水2周；在这2周中除了正常自由摄入饮食和饮水外，植物乳杆菌菌粉体处理组小鼠每日每只分别喂饲0.2g植物乳杆菌菌粉体(每克含活植物乳杆菌50亿/cfu)。2周后除正常组小鼠外，其他2组小鼠每日灌胃2ml的活性炭水(温度为4℃，按质量比将10％的活性炭加入含10％阿拉伯树胶的水溶液中制成悬液)，同时植物乳杆菌菌粉体处理组喂饲植物乳杆菌菌粉体，持续3天。实验过程中每日上午定时测定所有小鼠的体重、膳食摄入量、饮水量、粪便重量和粪便湿度。第1-17天的小鼠的重量情况如下：
表1
试验结果：体重变化是小鼠发生便秘的重要指标，由表1所示，前2周中各组小鼠的体重都呈现出正常的增长状态，各组之间没有明显差异；活性炭诱导便秘后，没有经过活性炭处理的正常组小鼠体重继续增长，其余各组小鼠体重均出现下降，其中便秘对照组小鼠的体重下降最多，植物乳杆菌菌粉体处理组小鼠的体重最接近正常组，说明植物乳杆菌菌粉体能够抑制便秘造成的小鼠体重下降。
实施例7
表2为实施例1至实施例5中的调节肠道、预防便秘的益生菌组合物改善便秘、腹泻的临床应用效果
表2本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物对改善老年人便秘、腹泻应用效果
表2
由表2可知，老年男性组300人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的82人感觉便秘、腹泻有所缓解；服用15天，有143人感觉便秘、腹泻明显改善；服用30天，有232人感觉排便通畅，身体轻松；服用60天，有288人感觉便秘、腹泻完全改善，排便正常，有规律性，其中有122人的结肠炎得到改善；在此试验期间，有12人服用植物乳杆菌后便秘、腹泻未得到改善。
老年女性组300人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的77人感觉便秘、腹泻有所缓解；服用15天，有135人感觉便秘、腹泻明显改善；服用30天，有229人感觉排便通畅，身体轻松；服用60天，有291人感觉便秘、腹泻完全改善，排便正常，有规律性，其中有109人的结肠炎得到改善；在此试验期间，有9人服用植物乳杆菌后便秘、腹泻未得到改善。
表3本发明实施例调节肠道、预防便秘的益生菌组合物对减少幽门螺旋杆菌的应用效果
表3
上述表3可知，男性组中，200人在服用3天开始统计效果，有110人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有172人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有183人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有192人经检测幽门螺杆菌减少78％，共有8人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
女性组中，200人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的102人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有169人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有182人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有191人经检测幽门螺杆菌减少76％以上，共有9人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
青少年男性组中，150人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的62人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有116人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有136人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有144人经检测幽门螺杆菌减少80％以上，共有6人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
青少年女性组中，150人在服用3天开始统计效果，服用3天有不同年龄的68人经检测幽门螺杆菌减少20％。服用9天，有108人经检测幽门螺杆菌减少40％。服用15天有136人清除幽门螺杆菌极其明显，服用20天有146人经检测幽门螺杆菌减少75％以上，共有4人在服用植物乳杆菌未能清除幽门螺杆菌。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>山东环亿生物科技有限公司
<120>一种调节肠道、预防便秘的益生菌组合物及其制备方法
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