1.本发明属于医药和功能健康品领域，具体涉及一种具有抑制炎症发生和预防或治疗结直肠癌的微生态制剂。
背景技术：
：：2.结直肠癌（colorectalcancer,crc）是全世界范围内与癌症相关死亡的第二大主要原因，尤其是在50岁以下的个体中其患病率正逐步攀升[1,2]。作为肠道上皮的异质性疾病，其特征在于突变的累积和免疫反应的失调[3]。虽然尚未揪出crc的真正致病元凶，但已有大量证据指出炎症性肠病（inflammatoryboweldisease,ibd）相关的炎症是其危险因素之一[4]。有研究报道，ibd患者表现出高2-8倍的crc致癌风险，抗炎药物可以有效地改善crc的发生率[5,6]，但其副作用可能危及生命，不宜长期使用[7]。因此，开发一种更有效和更安全的天然药物作为替代方法来预防结肠癌并探究其作用机制至关重要。合生元主要由益生元和益生菌组成，为一种针对肠道微生物群的饮食干预方法。益生菌是一种活的微生物，当给予足够数量时对健康有益，典型的益生菌有双歧杆菌、乳酸杆菌和链球菌属等[8，9]。益生元为一种不可消化的食物成分，通过选择性地刺激结肠中一种或有限数量的益生菌种类的生长和/或活性，从而对宿主产生有益影响[10]，包括但不限于菊粉、fos和gos[11]。长期以来，哺乳动物结肠与多样化的微生物生态系统共同进化，在一定程度上通过在宿主中形成强大的免疫系统，促进宿主和微生物群落的互利共赢[12]。已有研究发现，罗伊氏乳杆菌可通过激活wnt/β-catenin信号通路，以维持肠道干细胞的数量，并促进肠道上皮的增殖，从而促进肠道上皮损伤后的修复，并增强肠道上皮屏障功能抑制致病菌感染[13]。植物乳杆菌ncu116的胞外多糖eps116可改善dss诱导结肠炎小鼠模型的疾病活动指数（diseaseactivityindex,dai）及减少免疫细胞浸润、促进小鼠结肠隐窝的再生以及肠干细胞（intestinalstemcells,isc）增殖分化来修复肠道屏障，还可改变dss小鼠的菌群结构，使肠道再生和聚糖代谢相关的微生物丰度增加，且通过调节isc的增殖和分化，改变肠道微生物群来促进肠道稳态[14]。也有研究发现，合生制剂组（鼠李糖乳杆菌gg或gg-pb12联合可溶性玉米纤维scf）可增加nk细胞活性，增加颤螺菌属丰度，改善老年人肠道菌群和免疫系统[15]。利用小鼠动物模型研究副干酪乳杆菌01在治疗结肠炎方面的作用，发现该益生菌达到108cfu/ml可以缓解小鼠结肠炎的症状[16]。此外，服用短双歧杆菌bif195可减轻长期低剂量阿司匹林引起的小肠损伤[17]，且可以使厚壁菌门/拟杆菌门的比例恢复，放线菌门增加[18]。还有研究表明乳杆菌+双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，分别可降低65%、69%、45%、56%的严重坏死性小肠结肠炎风险[19]，乳双歧杆菌cect8145、长双歧杆菌cect7347和干酪乳杆菌cect9104的三联组合，有效帮助年轻的特应性皮炎患者[20]。此外，有研究表明嗜热链球菌也是一种预防小鼠crc的新菌株，灌胃一定剂量的嗜热链球菌可显著减少小鼠的肿瘤形成[21]。而补充低聚果糖可以显著增加肠道菌群中的双歧杆菌属[22]，乳酸菌及低聚果糖对头孢克肟导致的小鼠肠道菌群紊乱的恢复作用且比比单独使用乳酸菌或低聚果糖效果好；单独使用低聚果糖能提高akk菌等有益菌的数量，并增强免疫功能[23]。因此在本研究中，我们试图研究上述益生元成分等与这些特定功能的益生菌组合（嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）所制成的合生元微生态干预制剂在aom/dss（azoxymethane/dextransulfatesodiumsalt,dss）诱导的cac小鼠模型中的影响。我们分别从结肠屏障功能、炎症水平、菌群结构、代谢调节以及可能参与的信号通路来评估其对cac发展的调控作用，以了解其可能的作用机制。[0003]参考文献[1]keumn,giovannuccie.globalburdenofcolorectalcancer:emergingtrends,riskfactorsandpreventionstrategies.natrevgastroenterolhepatol.2019;16(12):713-732.doi:10.1038/s41575-019-0189-8[2]gbd2017colorectalcancercollaborators.theglobal,regional,andnationalburdenofcolorectalcanceranditsattributableriskfactorsin195countriesandterritories,1990-2017:asystematicanalysisfortheglobalburdenofdiseasestudy2017[publishedcorrectionappearsinlancetgastroenterolhepatol.2020mar;5(3):e2].lancetgastroenterolhepatol.2019;4(12):913-933.doi:10.1016/s2468-1253(19)30345-0[3]janneya,powrief,manneh.host-microbiotamaladaptationincolorectalcancer.nature.2020;585(7826):509-517.doi:10.1038/s41586-020-2729-3[4]jesst,rungoec,peyrin-birouletl.riskofcolorectalcancerinpatientswithulcerativecolitis:ameta-analysisofpopulation-basedcohortstudies.clingastroenterolhepatol.2012;10(6):639-645.doi:10.1016/j.cgh.2012.01.010[5]vanstaatp,cardt,loganrf,leufkenshg.5-aminosalicylateuseandcolorectalcancerriskininflammatoryboweldisease:alargeepidemiologicalstudy.gut.2005;54(11):1573-1578.doi:10.1136/gut.2005.070896[6]vendramini-costadb,carvalhoje.molecularlinkmechanismsbetweeninflammationandcancer.currpharmdes.2012;18(26):3831-3852.doi:10.2174/138161212802083707[7]wangd,duboisrn.theroleofanti-inflammatorydrugsincolorectalcancer.annurevmed.2013;64:131-144.doi:10.1146/annurev-med-112211-154330[8]hillc,guarnerf,reidg,etal.expertconsensusdocument.theinternationalscientificassociationforprobioticsandprebioticsconsensusstatementonthescopeandappropriateuseofthetermprobiotic.natrevgastroenterolhepatol.2014;11(8):506-514.doi:10.1038/nrgastro.2014.66[9]devresem,schrezenmeirj.probiotics,prebiotics,andsynbiotics.advbiochemengbiotechnol.2008;111:1-66.doi:10.1007/10_2008_mcmasterprobiotic,prebiotic,andsynbioticworkgroup.probioticsreducemortalityandmorbidityinpreterm,low-birth-weightinfants:asystematicreviewandnetworkmeta-analysisofrandomizedtrials.gastroenterology.2020;159(2):467-480.doi:10.1053/j.gastro.2020.05.096[20]navarro-lópezv,ramírez-boscáꢀa,ramón-vidald,etal.effectoforaladministrationofamixtureofprobioticstrainsonscoradindexanduseoftopicalsteroidsinyoungpatientswithmoderateatopicdermatitis:arandomizedclinicaltrial.jamadermatol.2018;154(1):37-43.doi:10.1001/jamadermatol.2017.3647[21]bomhofmr,parnellja,ramayhr,etal.histologicalimprovementofnon-alcoholicsteatohepatitiswithaprebiotic:apilotclinicaltrial.eurjnutr.2019;58(4):1735-1745.doi:10.1007/s00394-018-1721-2[22]shiy,zhaiq,lid,etal.restorationofcefixime-inducedgutmicrobiotachangesbylactobacilluscocktailsandfructooligosaccharidesinamousemodel.microbiolres.2017;200:14-24.doi:10.1016/j.micres.2017.04.001[23]parangb,barrettcw,williamscs.aom/dssmodelofcolitis-associatedcancer.methodsmolbiol.2016;1422:297-307.doi:10.1007/978-1-4939-3603-8_26。技术实现要素：[0004]本发明通过合理选择微粉功能成分和功能益生菌，进行组配，得到的微生态制剂具有抑制炎症发生的效果，进行可以用于预防或治疗结直肠癌。[0005]本发明的结果显示，与aom/dss模型组相比，合生元干预治疗后对小鼠的体重和结肠长度具有保护作用，且可减少肿瘤细胞数量，减小肿瘤体积，提示合生元干预治疗可使受损的结肠细胞恢复，组织病理学也支持这种恢复效果。本发明检测并比较了来自结肠组织的各种促炎（il-1β、tnf-α、il-17、cox-2、il-12和il-23）和抗炎细胞因子（il-4和il-10）的表达，发现aom/dss小鼠促炎细胞因子显著增加，抗炎细胞因子显著减少，然而，给予合生元干预可明显逆转使这这一趋势。提示合生元干预制剂在cac小鼠模型中具有抗炎作用。本发明用aom/dss治疗正常小鼠会引起上皮细胞的炎症，释放促炎细胞因子，如tnf-α、il-17和il-1β。这些细胞因子可引起肠紧密连接蛋白occludin和zo-1的减少，从而导致结肠屏障丢失。而给予合生元干预后显示其mrna和蛋白水平显著增加，提示合生元可通过恢复肠道紧密连接来克服肠屏障功能障碍，从而抑制aom/dss诱导的cac(图3中a、b)。[0006]本发明发现合生元干预显著增加了结肠lactobacillus、bifidobacterium、akk菌等有益菌相对丰度，并降低了致病菌如escherichia/shigella，bacteroides_fragilis的相对丰度。这一结果表明，在cac发展过程当中给予合生元干预，或可以调节肠道菌群结构。本研究中模型组小鼠粪便中scfas的含量显著减少，可能与肠道内产短链脂肪酸菌的相对丰度下降有关，而给予合生元干预可明显增加产丁酸菌的水平，从而促进scfas的生成，在一定程度上抑制炎症反应的发生、肠道屏障的破坏以及cac的形成。数据表明，与正常组小鼠相比，在cac模型组小鼠粪便中色氨酸、5-ht明显堆积，色氨酸代谢产物iaa、ipa和ia水平显著下降而失调的微生物色氨酸代谢可以通过合生元干预显著恢复，这可能归因于它对肠道微生物的调节作用，且已有研究表明色氨酸代谢产物可以调节肠道微生物组成，从而改善肠道屏障功能，激活免疫系统。[0007]在本发明发现在合生元干预之后，各代谢物水平可逐渐恢复至正常水平，这一结果表明本实验中使用的特制的合生元试剂可通过改变菌群肠道菌群组成而调节胆汁酸代谢，从而抑制结肠炎症和肿瘤的发生。本发明发现合生元干预可显著下调相关蛋白水平，抑制wnt/β-catenin信号通路的激活来抑制细胞癌变和增殖从而抑制结直肠癌的发生和发展；合生元干预治疗可明显上调bcl-2的表达，下调bax、ki67的表达。进一步证实，在cac形成过程当中补充合生元可通过的促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，从而抑制结直肠癌的发生和发展。[0008]基于此，本发明提供的技术方案如下：本发明提供一种微生态制剂，其主要由下述功能组分构成：由fos、gos、菊粉、苹果粉、蓝莓粉、功能益生菌，其中所述功能益生菌由嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合而成，优选地所述功能益生菌是由嗜酸乳杆菌tyca06、鼠李糖乳杆菌f-1、青春双歧杆菌bh-20、长双歧杆菌βв536、动物双歧杆菌bb12、罗伊氏乳杆菌gl-104、保加利亚乳杆菌11842和嗜热链球菌grx02混合而成，优选地是以包埋菌粉形式存在。[0009]优选地，fos、gos、菊粉、蓝莓粉与苹果粉等质量比混构成微粉混合物，各菌种的包埋菌粉按等质量比混合成包进而菌粉混合物，前者与后者的比例为1-2：1-4，优选为2:1。[0010]本发明提供所述的微生态制剂，其特征在于，制备方法如下：（1）冻干粉制备：菊粉、蓝莓粉与苹果粉为新鲜水果分别捣碎压汁，经过过滤，然后分别冷冻干燥制备干粉；按照质量比等比例称取fos、gos、菊粉、蓝莓粉与苹果粉，均匀混合为微粉混合物；（2）包埋的菌粉的制备，将各菌种先分别进行发酵培养，然后离心浓缩，采用蛋白多肽与海藻酸钙凝胶对菌株进行固定进行包埋，然后进行冷冻干燥和粉碎，即为包埋的菌粉，将各种包埋的菌粉按照等比例均匀混合得包埋菌粉混合物；（3）将第（1）步和第（2）步中的混合物按照比例的质量比称量并均匀混合即得。[0011]具体地，各步骤均在无菌条件下操作，并且最后采用无菌包装。[0012]本发明还提供所述的微生态制剂在预防、辅助治疗炎症、结直肠癌的中应用。[0013]进一步提供所述的微生态制剂在制备缓解、预防顽固性便秘、放疗/化疗引起的便秘，或者增强肠道免疫力，或者改善抗生素引起的菌群失调症的制品中的应用。[0014]同时，本发明还提供所述微生态制剂制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）冻干粉制备：菊粉、蓝莓粉与苹果粉为新鲜水果分别捣碎压汁，经过过滤，然后分别冷冻干燥制备干粉；按照比例称取fos、gos、菊粉、蓝莓粉与苹果粉，均匀混合为微粉混合物；（2）包埋的菌粉的制备，将各菌种先分别进行发酵培养，然后离心浓缩，采用蛋白多肽与海藻酸钙凝胶对菌株进行固定进行包埋，然后进行冷冻干燥和粉碎，即为包埋的菌粉，将各种包埋的菌粉按照比例均匀混合得包埋菌粉混合物；（3）将第（1）步和第（2）步中的混合物按照比例的质量比称量并均匀混合即得。附图说明[0015]图1aom/dss小鼠肿瘤的发生发展以及合生元干预后结直肠癌(cac)病理模型的恢复。[0016]其中，（a）建立aom/dss诱导的cac模型和合生元干预处理的实验方法。模型组小鼠首先腹腔注射aom(10mg/kg)，然后让其自由饮用一周2.5%的dss饮用水，之后换成灭菌水自由饮用2周以恢复；以此为一个周期，重复3次。干预组小鼠每天灌胃合生元干预制剂。(b)各组小鼠平均体重变化百分比；对照组小鼠(control)、aom-dss诱导的cac小鼠（aom/dss）和合生元干预组（aom/dss_synbiotics）。(c)测量和比较造模结束后各组结肠长度和（d）结肠长度统计分析图。（e）各组小鼠结肠肿瘤数目和大小分布统计图；(f)结肠h&e染色示意图(标尺，50μm)。；数据均以mean±sem表示;*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,（n=5-10),student’st-test.））。[0017]图2.合生元可抑制aom/dss诱导的肿瘤小鼠的肠屏障破坏和结肠炎症。[0018]其中，(a)用qrt-pcr检测各组结肠组织中zo-1、occludin的mrna水平，用gapdh作为内参基因；（b）用westernblotting检测各组tj蛋白zo-1、occludin的表达情况,并进行统计学分析,用β-actin作为内参蛋白；(c)用qrt-pcr检测各组结肠组织中细胞因子的mrna水平并进行统计学分析，用gapdh作为内参基因；（d）用westernblotting检测益生元组、合生元组tnf-α、il-1β、il-23的表达情况,并进行统计学分析；数据均以mean±sem表示;*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,（n=5-10）,student’st-test.）。[0019]图3.16srdna测序分析aom/dss诱导的小鼠结肠炎相关肿瘤在合生元干预后肠道微生物变化。[0020]其中，（a）各组样本otu数目统计。(b)微生物α多样性，分别为simpson指数、chao1指数、shannon指数、；（c）β多样性分析，基于braycurtis距离矩阵算法的pcoa分析评估组间样本群落分布差异显著性。（d）各组在门（l2）水平上做统计分析，比较各组间差异物种相对丰度。（e）各组firmicutes、bacteroidetes的相对丰度以及firmicutes与bacteroidetes的比率。（h）属水平上关键差异物种的比较。（i）种水平上差异物种akk的统计分析图。数据均以mean±sem表示;*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,（n=5-10）,student’st-test.）。[0021]图4.用非靶向代谢组学方法筛选关键差异代谢物。[0022]其中，(a)用opls-da法对各组间肠代谢物的相似性分析以及(b)根据比较合生元干预组与模型组间差异代谢物的统计热图；(c)根据cac模型组与合生元干预组间显著性top-20差异代谢物所绘制的代谢通路富集气泡图。（d比较不同组间肠道scfa（乙酸、丙酸丁酸、戊酸）含量的统计图。（e）肠内容物色氨酸水平（l-tryptophan、asparaginyl-tryptophan、5-hydroxy-l-tryptophan）以及色氨酸代谢产物水平（ipa、iaa和ia）的统计分析图；(f)各组胆汁酸水平统计图。数据均以mean±sem表示;*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,（n=5-10）,student’st-test.)。[0023]图5.合生元干预或可抑制wnt/β-catenin信号通路。[0024]其中，(a)kegg富集top20气泡图。结肠肿瘤组织转录组测序，利用kegg数据库对差异蛋白编码基因进行pathway分析。(b)il-23与wnt/β-catenin信号通路进行了相关性分析示意图。(c)wb验证wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白分子的表达情况(d)并进行统计分析。(e)ihc染色检测ki67表达情况。数据均以mean±sem表示;*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,（n=5-10）,student’st-test.)。具体实施方式[0025]下述实施例中所有数据均用均值±标准差表示。所有数据均使用graphpadprism软件进行分析。菌群分析中两组之间的差异通过秩和检验进行统计分析，其他两组之间的差异通过t检验进行统计分析。p《0.05为两组之间有统计学差异。[0026]实施例1、合生元微生态制剂的制备实施例中使用的合生元微生态制剂主要由下述功能组分构成：低聚果糖（fructooligosaccharide，fos）+低聚半乳糖（galactooligosaccharides，gos）+菊粉+苹果粉+蓝莓粉）2g/kgb.w.+功能益生菌（109cfu/kgb.w.），所述功能益生菌由嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合而成，具体是嗜酸乳杆菌tyca06、鼠李糖乳杆菌f-1、青春双歧杆菌bh-20、长双歧杆菌βв536、动物双歧杆菌bb12、罗伊氏乳杆菌gl-104、保加利亚乳杆菌11842和嗜热链球菌grx02按照一定比例混合而成。其具体制备方法以及各组分的用量需要提供说明。[0027]制备方法如下：（1）冻干粉制备：菊粉、蓝莓粉与苹果粉为新鲜水果分别捣碎压汁，经过过滤，然后分别冷冻干燥制备干粉。具体操作如下：分别挑选新鲜无腐烂的菊芋、蓝莓与苹果，按照鲜水果和水质量比为1:4添加饮用水，质量百分比加入0.04％的食品级柠檬酸，调配均匀用，胶体磨重复磨2次榨汁，然后添加0.4％食品级果胶酶，在42-46℃条件下、酶解2h，酶解后，80℃水浴中15min；添加食品级羧甲基纤维素钠和环糊精－40℃条件预冻3h，真空度8-10pa、升华加热温度35℃）；（2）微生物培养：将各菌种先分别进行发酵培养。具体操作如下：将-80℃低温保存的液体菌种于37℃快速化冻，然后按照体积比3-5%的接种量接种于tpy液体培养基中，37度厌氧培养36h；取以上培养菌液，继续以上述条件活化2次，将活化好的菌液接种到厌氧发酵罐中，37℃分批连续发酵50-72小时，中间适当流加3×tpy液体培养基补充养分，发酵终止后按照常规方法测定活菌数。tpy液体培养基（酪蛋白胨10.0g，酵母浸出粉2.5g，葡萄糖5.0g,，吐温801.0ml，l-半胱氨酸0.5g。混合盐溶液5.0ml，蒸馏水995ml；混合盐溶液：磷酸二氢钾20.0g，水和氯化镁5.0g，水和硫酸锌2.5g，氯化钙1.5g，氯化铁0.5g，加蒸馏水到100ml，调整ph值为7.2,0.1mpa灭菌20min。然后在4℃4000g离心30min浓缩菌种，采用蛋白多肽与海藻酸钙凝胶对菌株进行固定进行包埋：将质量浓度为20g/l的海藻酸钠与20g/l的蛋白多肽溶液中（质量比为1:2），置于121℃下灭菌20min，自然冷却，存于4℃。将约1-2×107cfu/ml的菌悬液和混合溶液按比例（3∶20）混合，4℃轻轻搅拌均匀，混合溶液用注射器挤入0.1mol/l的氯化钙溶液中，静止30min后，4℃2000g离心10min，无菌水洗涤3次，4℃2000g离心10min获得包埋菌株），然后进行冷冻干燥和粉碎，即为包埋的菌粉(－40℃预冻3h，升华干燥阶段的温度为－30℃，然后采用低温粉碎机在0℃粉碎成为50-200μm的益生菌粉)，将配方上各种包埋的菌粉按照等比例均匀混合。[0028]（3）按照质量比等比例称取fos、gos，及上述制备的菊粉、蓝莓粉与苹果粉，均匀混合。其中，fos和gos原料，例如可以采用韶山常佰通生物有限公司产品。[0029]（4）将第（2）步和第（3）步中的混合物按照1:2的质量比称量并均匀混合，然后无菌包装即合生元微生态制剂。上述所有步骤要求在无菌环境中进行。[0030]实施例2、合生元微生态制剂效用验证1、aom/dss诱导的cac动物模型体重为18.0~20.0g的健康雄性6周龄的spf级的c57bl/6j小鼠，购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有的试验均在当地伦理委员会的批准下，并且根据湖南师范大学医学院动物实验中心的实验室动物护理和使用指南进行，小鼠的饲养条件为：温度20~25℃，湿度40~70%，12h日夜节律，自由饮水饮食。[0031]经过7天的适应期后，小鼠被随机分配到3组(n=10/组)，包括空白对照组（control）、cac模型组（aom/dss）、合生元干预组（aom/dss_synbiotic，采用实施例1制备的合生元微生态制剂）。在aom/dss造模前两周至造模结束采样前，空白对照及模型组小鼠每天灌胃给予灭菌水，合生元干预组分别每天灌胃给予合生元。[0032]空白对照组小鼠：每天自由饮用灭菌水；cac模型组小鼠：aom/dss和aom/dss_synbiotic组第1周开始分别腹腔注射一次10mg/kgaom(sigma-oldrich)，一周后将两组的饮用水换成用灭菌水配制的2.5%的dss(sigma-oldrich)溶液，使其自由饮用1周，随后2周又换成灭菌水以恢复。虽然在第1周仅给药aom一次，但在整个试验期间（第2、5、8周）重复dss饮用3次(图1中a)。在研究期间，我们每天测量一次体重。在第10周对小鼠实施安乐死，并切除其结肠。测量结肠长度后，纵向切开，收集肠内容物，用作代谢组学分析，再用pbs洗涤，统计肿瘤数目。之后，切取盲囊下2cm留作菌群和转录组测序标本，远端1cm结肠留作石蜡切片标本，肠用10%中和蛋白福尔马林(sigma-aldrich)固定。剩余肠段储存在液氮中，供以后提取和实时pcr、和westernblot分析。所有的试验均在当地伦理委员会的批准下，并且根据湖南师范大学医学院动物实验中心的实验室动物护理和使用指南进行。[0033]3、组织病理学分析使用标准程序将固定的结肠片段包埋在石蜡中，半自动石蜡切片机进行切片，厚度为3μm，用于h&e染色和免疫组化。使用olympusckx41显微镜（东京，日本）观察和图像采集。每组5只小鼠，每只小鼠随机选取20倍物镜下3个视野分析。[0034]4、细胞因子水平的检测蛋白质免疫印迹（wb）向小鼠结肠中按比例加入组织裂解液（200μl组织裂解液/10mg组织），在冰上用组织匀浆仪充分研磨后，静置30min，充分裂解组织，再4℃5000g离心5min，收集上清。然后用使用bca试剂盒测定样品蛋白浓度以调节合适上样量，再按比例加蛋白上样缓冲液后煮沸10min，使用适当浓度的sds-page电泳分离蛋白，上层浓缩胶电泳条件80v0.5h，下层分离胶电泳条件120v1h，以充分电泳分离蛋白样品；用湿转的方式将分离的蛋白样品转移至pvdf膜；再用5%脱脂奶粉在室温摇床上封闭1.5h，再用1xtbst洗膜3遍，5min/遍；将pvdf膜浸入用抗体稀释液稀释后的相应蛋白抗体中，4℃孵育过夜，再用1xtbst洗膜3遍，10min/遍；然后将pvdf膜浸入用1xtbst稀释好的二抗中，室温摇床上孵育1h，再用1xtbst洗膜3遍，10min/遍；将ecl化学发光液均匀滴加至pvdf膜上，用tannon全自动化学发光成像分析系统扫描pvdf膜，显现出特异性蛋白条带；最后使用软件imagej分析蛋白条带灰度值进行定量5、总rna提取和实时荧光定量pcr按照试剂商的说明使用trizol试剂(北京鼎国昌盛生物)进行总rna的提取。然后使用synergyhtx酶标仪(美国伯腾公司)对rna进行定量，再使用逆转录试剂盒(艾科瑞生物)进行cdna合成。实时荧光定量pcr使用protaqhspremixprobeqpcrkit试剂盒(艾科瑞生物)，(bio-rad)cfx96™定量pcr仪进行qpcr。引物序列见表s2。实时荧光定量pcr数据采用2−δδct法进行分析，用gapdh将数据归一化。[0035]6、微生物群落分析小鼠结肠黏膜组织微生物提取，用上海欧易生物医学科技有限公司dna抽提试剂盒，对样本的基因组dna进行提取，使用带barcode的特异引物进行pcr扩增建立16s扩增子文库。使用trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂，去杂后的双端序列利用flash软件进行。测序数据进行预处理生成优质序列之后，采用vsearch软件，根据序列的相似性，将序列归为多个otu。使用qiime软件挑选出各个otu的代表序列，并将所有代表序列与数据库greengenes进行比对，分别统计门、纲、目、科、属、种水平上物种组成，并使用rdpclassifier软件注释，同时还对样品进行alpha多样性、beta多样性。[0036]7、有参转录组分析提取样品总rna并使用dnase消化dna后，用带有oligo（dt）的磁珠富集真核生物mrna；加入打断试剂将mrna打断成短片段，以打断后的mrna为模板,用六碱基随机引物合成一链cdna，然后配制二链合成反应体系合成二链cdna，并使用试剂盒纯化双链cdna；纯化的双链cdna再进行末端修复、加a尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行pcr扩增；构建好的文库用agilent2100bioanalyzer质检合格后，使用illuminahiseqtm2500或illuminahiseqxten其他测序仪进行测序，产生125bp或150bp的的双端数据。高通量测序中产生的原始数据（rawreads）为fastq格式序列。为了得到可用于后续分析的高质量reads，对rawreads进行进一步的质量过滤。首先使用trimmomatic软件进行质控并去除接头，在此基础上过滤掉低质量碱基以及n碱基，最终得到高质量的cleanreads。将cleanreads使用hisat2比对到物种的参考基因组，软件参数为默认参数，通过基因组比对率来评估样本的情况。cleanreads与参考基因组比对的结果，以二进制binary文件即bam文件进行储存。基因fpkm表达量值使用cufflinks软件定量。在计算基因的表达量差异时，通过htseqcount软件获取落到各个样本中基因的reads数目，使用deseq(2012)rpackage的estimatesizefactors函数对数据进行标准化，并使用nbinomtest函数计算差异比较的pvalue和foldchange值。挑选出p值小于0.05，差异倍数大于2的差异基因，并进行差异基因的go和kegg富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。同时对差异基因进行进行非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。[0037]8、lc/ms非靶向代谢组分析由上海欧易生物医学科技有限公司使用dionexu3000uhplc超高效液相串联qeplus高分辨质谱仪组成的液质联用系统对小鼠肠道内容物进行代谢组分析，原始数据经代谢组学处理软件progenesisqiv2.3软件(nonlineardynamics,newcastle,uk)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，再对提取到的数据，删除组内缺失值均（0值）》50%的离子峰，并将0值以最小值的一半替换，并根据化合物定性结果打分（score）对定性得到的化合物进行筛选，筛选标准为40分（满分60分），40分以下视为定性结果不准确并删除。最后将正负离子数据合并成一个数据矩阵表，该矩阵包含了原始数据提取到的所有可以用于分析的信息，后续分析均以此为基础，包括多元统计分析，单变量统计分析，差异代谢物筛选，相关性分析和代谢通路富集分析。[0038]实验结果1、改善病理指标用aom/dss诱导的cac模型，观察合生元对结直肠癌发生的预防作用（图1中a）。在dss诱导之后，小鼠的体重有明显下降，而停止饮用dss溶液，又可逐渐恢复，给与合生元干预则可以缓解小鼠体重的丢失（图1b）。此外，与正常对照组相比，模型组小鼠结肠明显缩短，有明显的肿瘤发生，而合生元干预可以恢复结肠长度，并减少肿瘤数目，减小肿瘤体积,且直径大于2mm的肿瘤占比明显减少（图1中c-f）。另外，我们对结肠病理切片进行了he染色，以观察小鼠的结肠炎症和黏膜损伤情况。正常对照组小鼠结肠有完整的结肠上皮、肠腺、间质和粘膜下层，而aom/dss组小鼠则显示出表面上皮侵蚀、隐窝破坏、粘膜肌层破坏、粘膜下水肿和炎症细胞浸润,结肠黏膜可见低级别或高级别上皮内瘤变，癌细胞大量增殖，细胞核增大和深染，核质比增加。相比合生元干预治疗后，肠粘膜隐窝结构相对保持良好，且其组织学特征得到明显的改善或恢复(图1中g)。[0039]2、恢复结肠黏膜屏障已知紧密连接在维持细胞间的完整性方面起着至关重要的作用，它们的丢失可以加速各种胃肠道疾病(如ibd、肠易激综合征甚至结直肠癌)的病理发生与发展。因此，我们检测了紧密连接蛋白zo-1、occludin的mrna和蛋白水平。与正常对照组相比，aom/dss对照组的mrna表达明显受到抑制。然而，给予合生元干预后，紧密连接蛋白mrna表达以及相应的蛋白表达水平均得到明显恢复(图2a，图2b）。这一结果表明，在aom/dss诱导的cac预防性补充合生元制剂可通过恢复紧密连接蛋白的表达来保护肠道上皮屏障。[0040]3、减轻炎症反应炎症分子参与了结肠炎相关结肠癌发生的各种过程。为了阐明aom/dss诱导的cac小鼠的炎症反应，我们测定了结肠组织中mrna和蛋白水平的各种促炎和抗炎细胞因子。与control组小鼠相比，aom/dss诱导后小鼠结肠组织中多种促炎因子（il-1β、il-12b、il-17a、tnf-α、il-23、cox-2）的mrna表达显著增加，但给予合生元试剂干预后mrna表达逐渐降低，与此结果相反，cac模型组小鼠抗炎细胞因子如il-4和il-10的mrna表达显著降低，而合生元干预能显著上调抗炎细胞因子il-4、il-10的表达(图2c)。同时，用westernblotting对tnf-α、il-1β、il-23蛋白水平的表达进行了验证（图2d）。该结果表明本实验使用的合生元制剂疗可以通过减轻aom/dss诱导的结肠炎症反应，有效保护肠道屏障。[0041]4、调节微生物群落结构我们预测合生元干预可改变aom/dss诱导的cac小鼠的肠道微生物群组成。因此，实验结束后我们收集了各组的粪便样本，采用16srdna菌群测序测序分析结肠黏膜微生物组成。我们发现aom/dss诱导的cac小鼠otu数量仅为1861，与control组（2304）相比显著减少。给予合生元干预后，otu数目（2104）显著增加。alpha多样性分析是衡量物种丰富度(chao1)和多样性(shannon和simpson指数)的综合指标。如图3所示，与对照组相比，模型组小鼠结肠内细菌种群显著减少，而合生元干预后肠道微生物的相对丰度明显增加，且多样性呈增加的趋势，但无显著性差异(图3b)。主成分分析(pca)显示，对照组与aom/dss模型组以及合生元干预组之间相似性具有显著差异(图3c)，组间菌群结构发生了明显变化。因此，我们进一步研究了各组间门水平的细菌分类谱(图3d)。在所有样本中检测到19个门，其中bacteroidetes（拟杆菌门）、firmicutes（厚壁菌门）是最丰富的门。与正常对照组相比，cac组小鼠的firmicutes相对丰度显著减少，bacteroidetes相对丰度增加，firmicutes与bacteroidetes比率明显降低。合生元干预可以通过逆转这种趋势(图3e))。在科水平上，合生元干预治疗可使burkholderiaceae（伯克氏菌科）、peptococcaceae（消化球菌科）、deferribacteraceae（脱铁杆菌科）呈现增多趋势，pasteurellaceae（巴氏杆菌科）、streptococcaceae（链球菌科）、sphingomonadaceae（鞘脂单胞菌科）、pseudomonadaceae（假单胞菌科）、enterococcaceae（肠球菌科）明显减少(图3f)。此外，我们筛选出各组间具有显著差异的菌属，发现在模型组当中一些条件致病菌如致病性大肠埃希菌escherichiae.coli，shigella、bacteroides_fragilis、acinetobacter、anaerotruncus、fusobacteriumnucleatum等特定微生物显著升高，而lactobacillus、bifidobacterium、ruminococcusroseburia、butyricicoccus、faecalibacterium、roseburia、subdoligranulu、clostridiumleptum等有益菌相对丰度发生显著降低，而给予合生元干预可恢复其至正常水平(图3g-i)。随后，我们进一步对种水平上的差异菌进行了比较，发现益生菌akkermansia在合生元干预组中显著增加（图3j）。以上结果表明，在cac形成过程中给予合生元干预可以有效缓解肠道菌群结构的紊乱，且可通过增加肠道益生菌的相对丰度，减少致病菌的相对丰度，从而减少炎症的发生，抑制cac的形成与发展。[0042]5、促进肠道菌群产生scfa，调节色氨酸与胆汁酸代谢肠道微生物对宿主的影响涉及一系列宿主-微生物轴的复杂相互作用。然而小分子代谢物是协调这种相互作用的关键，观察肠道微生物调节的代谢物变化，可让我们更好地理解合生元靶向肠道微生物以改善aom/dss诱导的cac的生化机制。因此，我们使用非靶向代谢组学方法来分析不同分组粪便标本中的代谢物，试图筛选出与aom/dss诱导的cac的发展有关的差异代谢物。与预期一致，不同分组间存在明显的代谢差异(图4a)。合生元干预治疗可以有效调节某些相关代谢物的水平，并使其恢复到正常组的水平(图4b)。[0043]scfa是由肠道菌群，特别是乳酸杆菌和双歧杆菌产生的，在维持肠道菌群的平衡和预防肠道疾病方面起着重要作用。在本研究中，对aom/dss诱导的cac小鼠使用特制的合生元制剂可使乳酸杆菌、双歧杆菌和阿克曼菌显著增加，而这些细菌被称为scfa产生菌[24]。结果显示，乙酸是粪便中最丰富的scfa。模型组粪便中乙酸、丙酸丁酸、戊酸的含量均显著下降，合生元处理显著增加了粪便中4种短链脂肪酸含量(图4c)。且报道称scfa的产生会抑制肠道中某些病原体的生长[25]，因此我们猜测合生元制剂可能通过增加scfa的产生来抑制cac小鼠模型中特定病原体的生长。以上结果表明，本实验使用的合生元制剂可能通过刺激aom/dss诱导的cac小鼠肠道特定有益菌的生长和scfa的产生，减少病原菌的增殖，从而抑制炎症的发生。[0044]同时我们发现各组间代谢差异还涉及色氨酸代谢与胆汁酸代谢。分析结果显示模型组中l-tryptophan（色氨酸）、5-hydroxy-l-tryptophan（5-羟基-l-色氨酸）、asparaginyl-tryptophan（天冬酰胺酰-色氨酸）水平显著升高，吲哚乙酸（iaa）、吲哚丙酸（ipa)、吲哚丙烯酸(ia)水平明显降低；且与正常组相比，初级胆汁酸(ca)、鹅去氧胆酸(cdca)在模型组内显著聚积，次级胆汁酸(dca)、石胆酸(lca)水平明显下降。给予合生元干预可明显逆转这些代谢物的变化趋势并使其逐渐恢复至正常(图4e-f）。[0045]6、抑制wnt/β-catenin信号通路，促进凋亡，抑制增殖此外，为了进一步探讨合生元对cac干预作用的具体分子机制，我们还对结肠组织进行了转录组测序。利用kegg数据库对差异蛋白编码基因进行pathway分析，结果显示wnt/β-catenin信号通路起了关键作用(图5a)。此外，之前结果显示所有炎症因子il-23水平在合生元干预之后降低效果最显著。所以我们将il-23与wnt/β-catenin信号通路进行了相关性分析。基于cor值，cor》0为正相关，发现wnt/β-catenin通路中与il-23呈正相关的基因有23个，分别为dkk2、notum、axin2、nlk、wif1、tcf7、ccnd1、mmp7、wnt6、wnt10a、senp2、vangl2、lef1、vangl1、nkd1、fzd10、wnt16、wnt3、bambi、nfatc3、wisp1、gsk3b、plcb2;cor《0则为负相关，呈负相关的基因有6个：fzd1、sfrp2、wnt5a、tbl1x、ppp3cb、daam1(图5b)。因此，我们使用wb和qpcr对其中显著相关的分子进行了进一步验证，结果显示，在模型组小鼠中，wnt3、wnt10a信号显著增强，其受体frizzled9表达显著增加，β-catenin表达也有所增加，然而合生元干预都能明显逆转这一表达趋势(图5c、e)。此外与对照组相比，模型组中与β-catenin结合的下游转录因子lef/tcf的表达显著增加，下游靶基因mmp8的表达明显增高，促凋亡蛋白bax水平显著下调，抗凋亡蛋白bcl-2水平显著上调。而给予合生元干预制剂处理后，其表达水平都明显得到逆转(图5d、e)。同时我们使用ihc染色检测了各组间细胞增殖指标ki67的表达情况，发现模型组阳性率显著高于空白对照组，而合生元干预组阳性率相对于模型组有明显的降低(图5f)。以上结果提示在aom/dss诱导的cac中，wnt/β-catenin信号通路被异常激活，促进癌细胞增殖，凋亡受到抑制，同时伴有il-23介导的炎症反应增强。而合生元干预治疗可通过抑制这一通路的激活从而抑制cac的发生发展。当前第1页12当前第1页12