有效改善代谢的油脂组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及食品化学与食品营养领域，具体涉及有效改善代谢的油脂组合物及其应用。


背景技术：

2.母乳是婴幼儿最佳的天然食物，其中脂肪作为重要的供能物质，虽然只占母乳的3-5％左右，却为婴幼儿提供了超过50％的能量。母乳脂肪中98％以上是甘油三酯，其主要的结构类型为sn-usu型，u代表不饱和脂肪酸，s代表饱和脂肪酸。母乳中的棕榈酸含量为20-30％，其中约有70％左右的棕榈酸在sn-2位，sn-1,3位主要是不饱和脂肪酸，典型的甘油三酯有sn-opo及sn-opl，其中o代表油酸，l代表亚油酸。由于国外母乳中opo的含量普遍大于opl的含量，因此，目前大量的研究都集中在1,3-二油酸-2-棕榈酸(opo)对婴幼儿的健康作用。目前opl对于机体的营养学作用还不明晰，opl/opo比例对对机体的营养学作用研究报道更为少见，因此，研究opl/opo比例对机体的营养学作用对于推进婴幼儿配方奶粉母乳化进程具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明第一方面提供一种油脂组合物，该油脂组合物中opl与opo的重量比opl/opo为0.8～2.0，优选为0.9～1.5，更优选为0.9～1.4，更优选为0.9～1.2或1.3～1.5。
4.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物中，sfa的含量为30～40wt％，mufa的含量为35～45wt％，pufa的含量为18～25wt％。
5.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物中，sfa的含量为35～40wt％，mufa的含量为37～42wt％，pufa的含量为20～24wt％。
6.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物中，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为15～25wt％，c18:3n-3的含量为1～5wt％。
7.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物中，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为18～23wt％，c18:3n-3的含量为1.5～3.5wt％。
8.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物中，所述油脂组合物的脂肪酸组成中，sn-2 c16:0的含量为35～50wt％，优选为38～45wt％。
9.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物中，sn-2 c16:0占比为55～65wt％，优选为55～62wt％。
10.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物的脂肪酸组成还具有以下特征中的一种或多种：20～30wt％、优选22～36wt％的c16:0，35～45wt％、优选38～42wt％的c18:1，2.5～4.0wt％的c14:0，3～6wt％的c18:0，和1.5～3.0wt％的c12:0。
11.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物含有植物油、乳脂和结构脂以及任选的藻油和任选的鱼油。
12.在一个或多个实施方案中，所述植物油为奶粉配方中植物油；优选地，所述植物油
选自菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、大豆油、玉米油、椰子油、棕榈仁油、亚麻籽油、棕榈油、核桃油、沙棘油和元宝枫油中的一种或多种。
13.在一个或多个实施方案中，所述植物油选自菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、椰子油、棕榈仁油和亚麻籽油中的一种或多种。
14.在一个或多个实施方案中，所述乳脂为牛乳脂和/或羊乳脂。
15.在一个或多个实施方案中，所述结构脂选自milkopas结构脂1、milkopas结构脂2、milkopas结构脂3和milkopas结构脂4中的一种或多种。
16.在一个或多个实施方案中，所述植物油选自菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、椰子油、棕榈仁油和亚麻籽油中的一种或多种。
17.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物含有植物油、乳脂和结构脂，其中，以油脂组合物总重计，植物油的含量为20～30wt％、优选25～29wt％，乳脂的含量为18～25wt％、优选10～23wt％，结构脂的含量为45～58wt％、优选48～55wt％。
18.在一个或多个实施方案中，所述植物油含有10～15wt％、优选11～13wt％的菜籽油，5～13wt％、优选7～11wt％的葵花籽油和/或高油酸葵花籽油，1～5wt％、优选2～4wt％的椰子油和/或棕榈仁油，以及1～3wt％的亚麻籽油，所述重量百分比以油脂组合物总重计。
19.在一个或多个实施方案中，所述油脂组合物含有占油脂组合物总重20～25wt％、优选22～24wt％的opl+opo。
20.本发明第二方面提供本文任一实施方案所述的油脂组合物的用途，所述用途为下述用途中的任意一种或多种：
21.用于制备用于降低对象肝脏和肾脏周围白色脂肪含量的组合物中的用途；
22.用于制备用于降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量的组合物中的用途；
23.用于制备用于增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量的组合物中的用途；
24.用于制备用于提高对象血清中游离胆汁酸鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、α鼠胆酸、β鼠胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合胆汁酸牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸和牛磺ω鼠胆酸中的一种或多种的水平；
25.用于制备用于提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄的组合物中的用途；
26.用于制备用于提高对象肠道中游离胆汁酸胆酸、脱氧胆酸、石胆酸及熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平，以及结合型胆汁酸牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平的组合物中的用途；
27.用于制备用于提高对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度的组合物中的用途；
28.用于制备用于提高对象拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)和变形菌门(proteobacteria)的丰度，降低髌骨细菌(patescibacteria)和脱硫杆菌(desulfobacter)的丰度的组合物中的用途；
29.用于制备用于降低肠道菌属中乳酸杆菌属和拟杆菌属的相对丰度，增加梭菌相对丰度的组合物中的用途；
30.用于制备用于提高嗜粘蛋白阿克曼菌和颤螺旋菌的相对丰度，降低布劳特氏菌、多尔氏菌和瘤胃球菌的相对丰度的组合物中的用途；
31.用于制备用于促进对象肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达，促进对象肝脏fxr的表达、抑制对象肠道fxr的蛋白表达，和/或，促进对象肠道中tgr5的表达的组合物中的用途；
32.在制备用于对象减肥的组合物中的用途；优选地，在制备用于减少婴幼儿肥胖，以预防其成人期发生肥胖的组合物中的用途；
33.在制备用于预防或治疗对象肝脏疾病如酒精性肝病(如酒精性脂肪肝)的组合物中的应用；
34.在制备增加婴幼儿肠道菌群多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良的组合物中的应用。
35.本发明第三方面提供一种食品、营养剂或药品，其含有本文任一实施方案所述的油脂组合物；优选地，所述食品选自奶粉，尤其是婴幼儿奶粉，食用油，面制品，油炸食品和婴幼儿辅食；所述营养剂包括代餐食品和健身用的营养剂；所述药品为降血脂药或降糖药。
36.本发明第四方面提供一种婴幼儿配方奶粉，其含有本文任一实施方案所述的油脂组合物；优选地，所述婴幼儿配方奶粉中还含有生牛乳、乳糖、白砂糖、葡萄糖浆、玉米糖浆、果糖和麦芽糊精中的一种或多种。
附图说明
37.图1：大鼠组织切片h&e染色图。a、油脂组合物中不同opl/opo比例对大鼠肝脏的组织学分析图；b、油脂组合物中不同opl/opo比例对大鼠肾周脂肪的组织学分析图。
38.图2：油脂组合物中不同opl/opo比例对sd大鼠肾周脂肪细胞数目的影响。
39.图3：油脂组合物中不同opl/opo比例对sd大鼠血清生化指标的影响。a、sd大鼠血清中甘油三酯(tag)含量变化图；b、sd大鼠血清中总胆固醇(tc)含量变化图；c、sd大鼠血清中高密度脂蛋白-胆固醇(hdl-c)含量变化图；d、sd大鼠血清中低密度脂蛋白-胆固醇(ldl-c)含量变化图。
40.图4：油脂组合物产品大鼠血清胆汁酸与血清生化指标的相关性分析结果。
41.图5：油脂组合物中不同opl/opo比例对sd大鼠胆酸合成蛋白和受体蛋白表达量的影响。a、胆酸合成蛋白cyp7a1表达含量变化图；b、胆酸合成蛋白cyp27a1表达含量变化图；c、肠道fxr表达含量变化图；d、肝脏fxr表达含量变化图；e、结肠tgr5表达含量变化图。
42.图6：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠肠道菌群多样性和组成结构的影响。a、肠道菌群chao含量变化图；b、肠道菌群ace含量变化图；c、shannon指数变化图；d、simpson指数变化图。
43.图7：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠肠道菌群(门水平)组成结构的影响。a、门水平聚类柱状图；b、厚壁菌门相对丰度变化图；c、疣微菌门相对丰度变化图；d、放线菌门相对丰度变化图；e、拟杆菌门相对丰度变化图；f、变形菌门相对丰度变化图；g、厚壁菌门/拟杆菌门相对丰度比值变化图；h、髌骨细菌相对丰度变化图；i、脱硫杆菌相对丰度变化图。
44.图8：油脂组合物产品对sd大鼠肠道菌群(属水平)组成结构的影响。a、属水平聚类
柱状图；b、乳酸杆菌属相对丰度变化图；c、s24-7菌属相对丰度变化图；d、梭菌属相对丰度变化图；e、厌氧菌属相对丰度变化图；f、瘤胃球菌属相对丰度变化图；g、嗜粘蛋白阿克曼菌属相对丰度变化图；h、拟杆菌属相对丰度变化图；i、毛螺菌属相对丰度变化图；j、多尔氏菌属相对丰度变化图；k、颤螺菌属相对丰度变化图；l、嗜胆菌属相对丰度变化图。
具体实施方式
45.应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
46.应理解，本文中，o代表油酸，p代表棕榈酸，l代表亚油酸。opo为1和3位为油酸、2位为棕榈酸的甘油三酯，opl为1位为油酸、2位为棕榈酸、3位为亚油酸的甘油三酯。
47.油脂组合物
48.适用于本发明的油脂组合物中，opl与opo的重量比(opl/opo)为0.8～2.0。在一些实施方案中，油脂组合物中的opl/opo为0.9～1.5。在另外一些实施方案中，油脂组合物中的opl/opo为0.9～1.4。在一些实施方案中，油脂组合物中的opl/opo为0.9～1.2。在一些实施方案中，油脂组合物中的opl/opo为1.3～1.5。
49.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物中，sfa的含量为30～40wt％，mufa的含量为35～45wt％，pufa的含量为18～25wt％。优选地，本发明的油脂组合物中，sfa的含量为35～40wt％，mufa的含量为37～42wt％，pufa的含量为20～24wt％。
50.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物中，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为15～25wt％，c18:3n-3的含量为1～5wt％。优选地，本发明的油脂组合物中，以脂肪酸总重计，c18:2n-6的含量为18～23wt％，c18:3n-3的含量为1.5～3.5wt％。
51.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物的脂肪酸组成中，sn-2 c16:0占比为55～65wt％，优选为55～62wt％。
52.在一些实施方案中，本发明油脂组合物的脂肪酸组成中，c16:0为20～30wt％，c18:1为35～45wt％，c18:2n-6为15～25wt％。在一些实施方案中，该油脂组合物的脂肪酸组成中，c16:0为22～36wt％。在一些实施方案中，该油脂组合物的脂肪酸组成中，c18:1为38～42wt％。在一些实施方案中，该油脂组合物的脂肪酸组成中，c18:2n-6为18～23wt％。
53.在一些实施方案中，本发明油脂组合物的脂肪酸组成中还包括2.5～4.0wt％的c14:0、3～6wt％的c18:0和1～5wt％、优选1.5～3.5wt％的c18:3n-3。在一些实施方案中，该油脂组合物的脂肪酸组成中还包括1.5～3.0wt％的c12:0。
54.在一些实施方案中，本发明油脂组合物的脂肪酸组成中，sn-2 c16:0的含量为35～50wt％。在一些实施方案中，该油脂组合物的脂肪酸组成中，sn-2 c16:0的含量为38～45wt％。
55.可通过混合原料油脂来制备得到本发明的油脂组合物。合适的原料油脂包括但不限于植物油、乳脂和结构脂。植物油可以是本领域奶粉配方中常用的植物油，包括但不限于菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、大豆油、玉米油、椰子油、棕榈仁油、亚麻籽油、棕榈油、核桃油、沙棘油和元宝枫油中的一种或多种。乳脂包括但不限于牛乳脂和/或羊乳脂。结构脂包括但不限于milkopas结构脂1、milkopas结构脂2、milkopas结构脂3和milkopas结构脂4。乳脂和结构脂可从市售途径获得。结构脂中含有opl和opo。原料油脂还可包括藻油和鱼
油等。可将这些原料油脂以一定的比例混合。该比例的选择应确保所得油脂组合物中的opl/opo的比值在本发明所限定的范围内。
56.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物含有植物油、乳脂和结构脂，其中，以油脂组合物总重计，植物油的含量为20～30wt％，乳脂的含量为18～25wt％，结构脂的含量为45～58wt％。在一些实施方案中，植物油的含量为25～29wt％，乳脂的含量为10～23wt％，结构脂的含量为48～55wt％。在一些实施方案中，植物油可以是菜籽油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、椰子油、棕榈仁油和亚麻籽油中的一种或多种。在一些实施方案中，所述植物油含有10～15wt％、优选11～13wt％的菜籽油，5～13wt％、优选7～11wt％的葵花籽油和/或高油酸葵花籽油，1～5wt％、优选2～4wt％的椰子油和/或棕榈仁油，以及1～3wt％的亚麻籽油，所述重量百分比以油脂组合物总重计。
57.在一些实施方案中，本发明的油脂组合物含有占油脂组合物总重20～25wt％、优选22～24wt％的opl+opo。
58.用途
59.本发明发现，本发明油脂组合物中的高opl/opo比，可以降低对象肝脏和肾脏周围白色脂肪含量，降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量，增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量，提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄。
60.此外，本发明还发现，油脂组合物中的高opl/opo比可增加对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即油脂组合物中的高opl/opo比可增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度，从而增加肠道菌群的多样性。更具体而言，油脂组合物中的高opl/opo比可提高对象拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)和变形菌门(proteobacteria)的丰度，降低髌骨细菌(patescibacteria)和脱硫杆菌(desulfobacter)的丰度。进一步地，提高油脂组合物中opl/opo比，可降低肠道菌属中乳酸杆菌属和拟杆菌属的相对丰度，增加梭菌相对丰度。进一步地，提高油脂组合物中opl/opo比，可提高嗜粘蛋白阿克曼菌和颤螺旋菌的相对丰度，降低布劳特氏菌、多尔氏菌和瘤胃球菌的相对丰度。
61.因此，本发明的所述油脂组合物可用于下述任意一项或多项用途：
62.用于制备用于降低对象肝脏和肾脏周围白色脂肪含量的组合物中的用途；
63.用于制备用于降低对象血清中总甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，提高对象血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量的组合物中的用途；
64.用于制备用于增加对象血清中总胆汁酸含量和牛磺酸结合型胆汁酸含量的组合物中的用途；
65.用于制备用于提高对象血清中游离胆汁酸鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、α鼠胆酸、β鼠胆酸及ω鼠胆酸中的一种或多种的水平，以及结合胆汁酸牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸和牛磺ω鼠胆酸中的一种或多种的水平；
66.用于制备用于提高对象肠道中总胆汁酸含量、促进胆汁酸从粪便中排泄的组合物中的用途；
67.用于制备用于提高对象肠道中游离胆汁酸胆酸、脱氧胆酸、石胆酸及熊脱氧胆酸中的一种或多种的水平，以及结合型胆汁酸牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧
胆酸中的一种或多种的水平的组合物中的用途；
68.用于制备用于提高对象肠道菌群chao、ace和shannon指数，即增加对象肠道菌群中的otu总数、提升对象肠道菌群的丰富度的组合物中的用途；
69.用于制备用于提高对象拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)和变形菌门(proteobacteria)的丰度，降低髌骨细菌(patescibacteria)和脱硫杆菌(desulfobacter)的丰度的组合物中的用途；
70.用于制备用于降低肠道菌属中乳酸杆菌属和拟杆菌属的相对丰度，增加梭菌相对丰度的组合物中的用途；
71.用于制备用于提高嗜粘蛋白阿克曼菌和颤螺旋菌的相对丰度，降低布劳特氏菌、多尔氏菌和瘤胃球菌的相对丰度的组合物中的用途；
72.用于制备用于促进对象肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达，促进对象肝脏fxr的表达、抑制对象肠道fxr的蛋白表达，和/或，促进对象肠道中tgr5的表达的组合物中的用途。
73.在一些实施方案中，本发明还提供本发明所述的油脂组合物在制备用于减肥的组合物中的用途。本文中，所述对象包括可以是任何感兴趣的对象，尤其指哺乳动物，更具体而言，对象包括人，宠物如猫、狗等。在一些实施方案中，所述对象为人类婴幼儿。研究表明，婴幼儿时期的肥胖与其成年后肥胖发生率有关。因此，在这些实施方案中，采用本发明的油脂组合物可减少婴幼儿肥胖，有助于预防其成人期发生肥胖。
74.前期研究结果表明，髌骨菌门的相对丰度与肝脏疾病相关，例如与酒精性肝病指标mda、ast和tg呈正相关性，也与甘油三酯呈正相关性。因此，在一些实施方案中，本发明还提供本文任一实施方案所述的油脂组合物在制备用于预防或治疗肝脏疾病如酒精性肝病(如酒精性脂肪肝)的组合物中的应用。
75.另外，婴儿是肠道菌群建立的关键时期，肠道菌群多样性延迟与过敏、哮喘和营养不良有关。由于本发明的油脂组合物有助于增加肠道菌群的多样性，因而可用于预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良。因此，在一些实施方案中，本发明还提供本文任一实施方案所述的油脂组合物在制备增加婴幼儿肠道菌群多样性，从而预防与肠道菌群多样性延迟相关的过敏、哮喘和营养不良的组合物中的应用。
76.应理解，本文所述各用途中的组合物可以是油脂组合物、食品、营养剂以及药物组合物等。
77.本文中，所述cyp7a1、cyp27a1、fxr和tgr5具有本文所周知的含义，分别指细胞色素p450家族成员7a1、细胞色素p450家族成员27a1、法尼醇x受体、g蛋白偶联胆汁酸受体。这些蛋白或其基因序列可从已知的数据库中获得。
78.食品、营养剂和药品
79.本发明的油脂组合物可作为油脂，用于各类食品、营养剂和药品中。
80.本文所述的食品可以是常规的各类食品，包括但不限于奶粉(尤其是婴幼儿奶粉)、油、面制品、油炸食品和婴幼儿辅食等。优选地，所述奶粉是婴幼儿配方奶粉或婴幼儿辅食，其中的油脂的一部分或全部为本发明的油脂组合物。
81.本文所述的营养剂可以是例如代餐食品，健身用的营养剂等。
82.本发明所述的药品可以使例如，降血脂药或降糖药。
83.本文中，所述奶粉除含有上述油脂组合物外，还可以包含常规奶粉的组成成分，包
括但不限于生牛乳、乳糖、白砂糖、葡萄糖浆、玉米糖浆、果糖、麦芽糊精、植物油和香精香料。在一些实施方案中，配方奶粉的成分包括以下成分中的一种或多种：脱盐乳清粉、精炼植物油、脱脂乳粉、乳糖、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯、低聚半乳糖(gos)、低聚果糖(fos)、浓缩乳清蛋白粉、二十二碳六烯酸(dha)、花生四烯酸(aa)、益生菌(动物双歧杆菌bb-12，活菌数不少于1
×
106cfu/g)、碳酸钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碘化钾、亚硒酸钠、醋酸维生素a、维生素d3、l-抗坏血酸、l-抗坏血酸钠、dl-α-醋酸生育酚、混合生育酚浓缩物、盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、植物甲萘醌、叶酸、烟酰胺、d-泛酸钙、d-生物素、叶黄素、l-肉碱酒石酸盐、氯化胆碱、肌醇、牛磺酸、核苷酸(5'单磷酸腺苷、5'-胞苷酸二钠、5'-鸟苷酸二钠、5'-尿苷酸二钠、5'-肌苷酸二钠)、氯化钾、柠檬酸钠、大豆磷脂、柠檬酸和氢氧化钾。各成分以其常规含量添加到本发明的奶粉中。
84.下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法、试剂和仪器，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、试剂和仪器。
85.实施例1：动物饲养
86.30只雄性sprague-dawley(sd)大鼠(21日龄，101.55
±
4.01g)购自中国科学院上海实验动物中心。首先，大鼠经过5天的适应性喂养，将其随机分为3组(每组10只)：对照组(control组)、油脂组合物a组和b组，并进行4周的实验饲料喂养。实验期间每3天记录一次动物体重和摄食量。
87.3组实验油脂的原料和用量(质量百分比)见表1-1，脂肪酸组成(质量百分比)见表1-2，各组动物饲料配方见表2。
88.表1-1
89.油脂名称controlab菜籽油9％12％13％葵花籽油/高油酸葵花籽油25％7％11％椰子油/棕榈仁油2％4％3％亚麻籽油2％2％2％乳脂24％20％23％结构脂138％
ꢀꢀ
结构脂2 55％ 结构脂3
ꢀꢀ
48％
90.上述原料均购自秦皇岛金海特油食品工业有限公司。
91.表1-2
[0092][0093][0094]
*：sn-2 c16:0占比(％)指sn-2 c16:0占所有c16:0的含量。
[0095]
表2：动物饲料配方
[0096][0097]
实施例2：动物饲养及处死
[0098]
实验饲料喂养4周后，将每只大鼠单独放置在代谢笼中3天。在此期间，每天收集每只大鼠的粪便样品。3天代谢笼实验结束后，动物被禁食12小时，使用二氧化碳麻醉后进行解剖。抽取大鼠血液，并在4℃下3500rpm离心10min，取上层血清。收集大鼠的褐色脂肪，附睾脂肪，肾周脂肪和皮下脂肪组织以及心、肝，脾，肺，肾，将其用生理盐水清洗并称重，收集大鼠的肠道内容物，使用生理盐水清洗后收集结肠组织，将上述收集的所有样品储存在-80℃以供进一步分析。
[0099]
实施例3：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠体重、摄食量的影响
[0100]
提高油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠体重、摄食量及粪便含水率的影响见表3。与对照组相比，喂食a组和b组油脂组合物的大鼠初始体重和摄食量无显著差异(p》0.05)，最终体重从389g分别降至379.7g和375.9g(p《0.05)。
[0101]
表3：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠体重、摄食量的影响
[0102][0103]
a,b
表示各组间差异显著性(spss软件，p＜0.05)。
[0104]
实施例4：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠内脏和脂肪组织重量的影响
[0105]
油脂组合物产品对sd大鼠内脏和脂肪组织重量的影响见表4。与对照组相比，喂食a组和b组油脂组合物的大鼠心、脾、肺、肾及皮下和附睾白色脂肪重量、褐色脂肪重量均无显著差异(p》0.05)。但与control组相比，b组大鼠的肝脏重量从12.63g降至11.01g(p《0.05)；肾周白色脂肪重量从6.07g降至5.01g(p《0.05)，上述结果表明提高油脂组合物中opl/opo比例可显著降低大鼠肝脏和肾周白色脂肪重量(p《0.05)。
[0106]
为了更直观地观察油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠肝脏细胞和脂肪细胞形貌的影响，采用h&e染色法对各组大鼠的肝脏和肾周脂肪组织切片进行了观察。由图1(a)可知，在相同放大倍数下，与control组大鼠肝脏细胞相比，b组大鼠的肝脏细胞未见脂质空泡，该结果与肝脏重量的结果一致。此外，与control组大鼠肾周脂肪细胞相比，b组大鼠的脂肪细胞体积明显减小(p《0.05，图1(b))。研究发现，脂肪细胞体积的大小可以反映个体肥胖的程度。与正常个体相比，肥胖个体的脂肪细胞体积更大，这主要是由于其脂肪细胞中更多的脂肪滴导致的。此外，还对该放大倍数下，可视区域内不同组大鼠的肾周脂肪细胞进行了细胞计数，比较脂肪细胞数量上的差异。从图2可知，与control组相比，b组大鼠肾周脂肪部位的脂肪细胞数量显著增加(p《0.05)，细胞数量从163.07个/mm2上升至199.10个/mm2(p《0.05)。上述结果进一步证明了油脂组合物中opl/opo比例的增加对于减轻大鼠体重的积极作用。
[0107]
表4：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠脏器和脂肪组织重量的影响
[0108] controlab心(g)1.20a±
0.091.27a±
0.161.28a±
0.12肝(g)12.63b±
1.8912.04b±
1.6111.01a±
1.35脾(g)0.77a±
0.130.77a±
0.090.79a±
0.10肺(g)1.70a±
0.151.72a±
0.121.73a±
0.15肾(g)2.80a±
0.332.80a±
0.262.61a±
0.41褐色脂肪(g)0.50a±
0.070.50a±
0.090.46a±
0.07皮下脂肪(g)7.50a±
2.057.94a±
1.547.04a±
1.45肾周脂肪(g)6.07b±
0.655.38
ab
±
0.345.01a±
0.86附睾脂肪(g)5.24a±
1.715.56a±
1.254.54a±
1.22
[0109]
a,b
表示各组间差异显著性(spss软件，p＜0.05)。
[0110]
实施例5：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠血清生化指标的影响
[0111]
油脂组合物产品对大鼠血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇及高密
度脂蛋白-胆固醇含量的影响见图3。与control组相比，b组大鼠血清中甘油三酯从0.29mmol/l降至0.23mmol/l(p《0.05)，总胆固醇从1.45mmol/l降至1.18mmol/l(p《0.05)，高密度脂蛋白-胆固醇从0.25mmol/l升至0.31mmol/l(p《0.05)；且与control组相比，a组和b组大鼠的低密度脂蛋白-胆固醇从1.29mmol/l分别降至1.05mmol/l和0.81mmol/l。上述结果表明提高opl/opo比例可显著降低大鼠血清中甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白-胆固醇含量，显著提高大鼠血清中高密度脂蛋白-胆固醇含量(p《0.05)。血清中甘油三酯和总胆固醇水平是反映机体血脂代谢水平最常用的两个生化指标，低密度脂蛋白-胆固醇和高密度脂蛋白-胆固醇分别是运输胆固醇到肝外组织和将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢的主要运载工具，上述实验结果反映出油脂组合物中opl/opo比例会影响大鼠体内的脂质代谢过程。
[0112]
实施例6：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠血清中胆汁酸含量的影响
[0113]
使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(uhplc 30a/quadrupole5500,shimadzu&sciex,japan)对大鼠血清中胆汁酸进行定量。其中，血清胆汁酸的前处理如下：取50μl血清样品于离心管，加入200μl蛋白沉淀液(甲醇：乙腈＝5:3，含50ng/ml霉酚酸)，充分涡旋，于-20℃静置1h，12000rpm离心15min，取上清液90μl加入10μl甘氨熊脱氧胆酸(gudca)内标溶液(250ng/ml)，充分混匀后上机检测。液相条件：色谱柱：acquity uplc beh c18 2.1
×
100mm,1.7m；柱温：40℃；流动相a:0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液；b:0.1％(v/v)甲酸-水溶液。洗脱梯度见表5。
[0114]
表5：液相流动相洗脱梯度
[0115][0116][0117]
质谱条件：负离子模式进行定量测试，离子源esi。气帘气：35psi，离子化电压：-4500v，去溶剂温度：500℃，雾化气：55psi，辅助加热气：55psi，采用多重反应监测(mrm)器对样品进行分析。原始数据通过analyst 1.6.3(ab sciex)软件进行分析，结果见表6。
[0118]
表6：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠血清中胆汁酸含量的影响(nmol/l)
[0119][0120][0121]
a,b
表示各组间差异显著性(spss软件，p＜0.05)。
[0122]
如表6所示，与control组大鼠血清中胆汁酸含量相比，a组和b组大鼠血清游离胆汁酸水平显著提高的是：鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、α鼠胆酸、β鼠胆酸及ω鼠胆酸(p《0.05)；结合胆汁酸水平显著提高的是：牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺α鼠胆酸、牛磺β鼠胆酸及牛磺ω鼠胆酸(p《0.05)。由于胆汁酸是重要的信号调控因子，在糖脂代谢及能量稳态中发挥重要的信号调控作用，通过血清胆汁酸与血清生化指标的相关分析中(图4)发现：提高油脂组合物中opl/opo比例，大鼠血清中总胆汁酸与牛磺酸结合型胆汁酸含量与血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇的含量呈显著负相关，而与血清中高密度脂蛋白-胆固醇的含量呈显著正相关(p《0.05)。
[0123]
实施例7：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠肠道内容物中胆汁酸含量的影响
[0124]
使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(uhplc 30a/quadrupole5500,shimadzu&sciex,japan)对大鼠肠道内容物中胆汁酸进行定量。其中，肠道内容物胆汁酸的前处理如下：称取50mg肠道内容物，加入1ml蛋白沉淀液(甲醇：乙腈＝5:3，含50ng/ml霉酚酸)，将其置于2ml研磨管加入2个研磨珠，研磨匀浆，后超声处理1h，在12000rpm离心10min，取上清液90μl加入10μl甘氨熊脱氧胆酸(gudca)内标溶液(250ng/ml)，充分混匀后上机检测。液相条件质谱条件同实施例6中所列。结果见表7。
[0125]
表7：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠肠道内容物中胆汁酸含量的影响(nmol/g)
[0126] controlab胆酸35.99a±
2.6432.43a±
3.9532.75a±
5.11鹅脱氧胆酸10.87a±
1.9112.96b±
2.3011.11a±
1.9脱氧胆酸9.26a±
1.1621.44b±
4.133.72c±
4.49石胆酸7.95a±
1.3215.03b±
2.2719.41c±
1.84熊脱氧胆酸8.4a±
1.4215.47b±
2.6221.93c±
2.26猪脱氧胆酸12.39b±
1.788.28a±
1.1212.82b±
1.32ω鼠胆酸37.78a±
3.1736.14b±
7.3449.03b±
6.24牛磺胆酸6.87a±
1.199.96b±
1.4910.11b±
1.09牛磺脱氧胆酸3.64a±
0.395.63b±
0.483.73a±
0.47牛磺鹅脱氧胆酸8.26a±
1.1613.44b±
2.117.70c±
2.49牛磺熊脱氧胆酸7.15a±
0.6213.03b±
2.2719.41c±
2.84
[0127]
a,b,c
表示各组间差异显著性(spss软件，p＜0.05)。
[0128]
如表7所示，与control组大鼠肠道内容物中胆汁酸含量相比，a组和b组大鼠肠道内容物中游离胆汁酸水平显著提高的是：胆酸、脱氧胆酸、石胆酸及熊脱氧胆酸(p《0.05)。结合型胆汁酸水平显著提高的是：牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸(p《0.05)。上述结果说明提高油脂组合物中opl/opo比例可显著提高大鼠肠道内容物中总胆汁酸含量，增加了胆汁酸通过粪便的排泄。
[0129]
实施例8：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠胆酸合成蛋白和受体蛋白表达量的影响
[0130]
利用elisa试剂盒对肝脏中促进胆固醇转变成胆汁酸的限速酶cyp7a1和cyp27a1、肝脏中胆汁酸受体蛋白fxr、结肠中胆汁酸受体蛋白fxr和tgr5的表达量分别进行测定。油脂组合物产品对sd大鼠胆酸合成蛋白cyp7a1和cyp27a1表达量的影响见图5(a)和图5(b)。与control组相比，a组和b组大鼠cyp7a1表达量从16.41u/l分别升至18.79u/l和22.26u/l；与control组相比，a组和b组大鼠cyp27a1表达量从17.61u/l分别升至20.32u/l和23.73u/l。上述结果表明，增加油脂组合物中opl/opo比例可促进大鼠肝脏中cyp7a1和cyp27a1的表达。cyp7a1和cyp27a1是肝脏中促进胆固醇转变成胆汁酸的限速酶，增加了肝脏中胆汁酸的合成，该结果与实施例6所述的血清胆汁酸结果相吻合。此外，cyp7a1和cyp27a1表达量与血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇的含量呈负相关，与血清中高密度脂蛋白-胆固醇的含量呈正相关。
[0131]
油脂组合物产品对sd大鼠结肠和肝脏中fxr表达量的影响见图5(c)和图5(d)。与control组相比，b组大鼠肝脏fxr表达量从332.03pg/ml升至455.29pg/ml(p《0.05)；肠道fxr表达量从568.88pg/ml降至476.35pg/ml(p《0.05)。上述结果表明，增加油脂组合物中opl/opo比例可促进大鼠肝脏fxr的表达，抑制肠道fxr的蛋白表达(p《0.05)。fxr广泛分布在肝、小肠等富含胆汁酸的器官中，可调控胆汁酸的合成、代谢及转运。在结肠中，fxr可诱导成纤维细胞生长因子15/19(fgf15/19)与肝细胞质膜上的fgfr4/β-klotho复合物结合，启动细胞外信号调节激酶1/2(erk1/2)和c-jun氨基末端激酶(jnk)信号通路，进而抑制cyp7a1表达和胆汁酸合成，熊脱氧胆酸，牛磺熊脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸是fxr受体的拮抗剂，这与本发明观察到的结果一致。而在肝脏中，激活fxr可诱导小异二聚体伴侣(shp)的表达，shp增加可与肝受体同系物-1(lrh-1)形成抑制性复合物，此复合物可阻断cyp7a1的转录，从而抑制胆汁酸合成。这与本实验结果不同，这是由于结肠fxr激活比肝fxr激活更能抑制cyp7a1介导的胆汁酸合成。fxr最有效的内源性配体是鹅脱氧胆酸，这与本发明中增加血清中鹅脱氧胆酸含量，从而促进肝脏fxr蛋白的表达结果相一致。
[0132]
油脂组合物产品对sd大鼠结肠中tgr5的表达量影响见图5(e)。与control组相比，b组大鼠结肠中tgr5表达量从9.71nmol/l升至13.12nmol/l(p《0.05)。上述结果表明，增加油脂组合物中opl/opo比例可促进大鼠肠道中tgr5的表达(p《0.05)。tgr5受体通过刺激肠内分泌细胞l细胞(glp-1)的释放，减少脂肪生成并诱导脂肪酸氧化，从而改善肝脏脂肪的变性。不同的胆汁酸可以作为信号因子通过tgr5受体调节机体代谢，对tgr5激动能力最强的是石胆酸，熊脱氧胆酸也具有tgr5受体的亲和性。最近的研究也表明，给小鼠灌胃熊脱氧胆酸和石胆酸的混合物可以改善高脂饮食诱导的肥胖及脂肪肝变性。这与本发明结果增加油脂组合物中opl/opo比例，大鼠肠道内容物中熊脱氧胆酸和石胆酸含量升高，促进大鼠结肠中胆酸受体tgr5的表达，从而调节大鼠脂质代谢的结果相一致。
[0133]
实施例9：油脂组合物中opl/opo比例对sd大鼠肠道菌群多样性和组成结构的影响
[0134]
采用ctab方法提取大鼠肠道内容物菌群的dna，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。以16s高变区中的v3+v4区为目标测序片段，采用带barcode的特异引物341f(5'-cctaygggrbgcascag-3'，seq id no:1，其中，y为t或c，r为g或a，b为g、c或t，s为g或c)和806r(5'-ggactacnngggtatctaat-3'，seq id no:2，其中，n为a、g、c或t)对目标片段进行pcr扩增，每个样品进行3次重复。pcr扩增产物通过质量分数2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收、纯化。对纯化后的pcr产物使用truseqtm dna sample prep kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和qpcr定量，文库合格后，在illumina miseq进行上机测序。
[0135]
根据barcode序列从下机数据中拆分出各样本数据，利用trimmomatic软件对双端序列分别进行去杂后，使用flash软件对每个样本的高质量双端reads进行拼接，得到最终的有效数据(effective tags)。利用uparse软件对所有样本的全部effective tags进行聚类，默认以97％的一致性将序列聚类成为otus(operational taxonomic units)。选取otu代表序列，与silva数据库比对，进行物种注释分析，获得分类学信息并在门、科、属分类水平下统计各样本的群落组成。使用mothur软件计算shannon指数、simpson指数、ace指数、chao指数。
[0136]
油脂组合物产品对sd大鼠肠道菌群alpha多样性指数的影响见图6。由图6可知，增加油脂组合物中opl/opo比例可增加大鼠肠道菌群chao、ace和shannon指数(p《0.05)，chao和ace是用来估计群落中otu数目的指数。shannon指数是用来估算样品中微生物多样性指数之一，shannon值越大，说明菌群多样性越高。结果表明，增加油脂组合物中opl/opo比例可增加大鼠肠道菌群中otu总数，提升大鼠肠道菌群的丰富度(p《0.05)。
[0137]
油脂组合物产品对sd大鼠肠道菌群组成结构的影响见图7，由门水平的聚类柱状图7(a)中可知，五组大鼠肠道菌群中丰度较高的菌群为厚壁菌门(firmicutes)、疣微菌门(verrucomicrobia)、放线菌门(actinobacteria)，拟杆菌门(bacteroidetes)和变形菌门(proteobacteria)；从图7(e)中可看出，与control组相比，b组大鼠拟杆菌门相对丰度从4.73％上升至6.08％。前期的研究结果表明，拟杆菌门降低会导致肥胖，说明提高油脂组合物中opl/opo比例可显著调节肠道菌群中与肥胖有关的菌门(p《0.05)。
[0138]
此外，与control组相比，a组大鼠放线菌门的相对丰度从4.88％上升至6.93％(p《0.05，见图7，d)，b组大鼠变形菌门相对丰度从1.01％上升至1.49％(p《0.05，见图7，f)。而在肠道菌对胆汁酸代谢的第二条途径中氧化胆酸上的醛基需要hsdh酶，这种酶则在厚壁菌、放线菌、拟杆菌及变形菌四种肠道菌门中存在，说明提高油脂组合物中opl/opo比例可显著调节肠道菌群中与胆酸代谢有关的菌门(p《0.05)。
[0139]
除上述菌门外，本发明还讨论了在门水平相对丰度较低但五组间仍有显著性差异的菌门：髌骨细菌(patescibacteria)和脱硫杆菌(desulfobacter)，从图中可以看出，与control组相比，b组大鼠的髌骨菌门的相对丰度从0.01％下降至0.00％(p《0.05，见图7，h)。前期研究结果表明，髌骨菌门的相对丰度与肝脏疾病相关，且与甘油三酯呈正相关性，这与本实验结果中甘油三酯含量降低的趋势相符。总之，增加油脂组合物中opl/opo比例可显著调节肠道菌群中与肥胖、脂质代谢及胆汁酸代谢有关的菌门，对宿主肠道健康具有积极作用。
[0140]
由属水平的聚类柱状图8(a)可知五组大鼠肠道菌群中丰度较高的菌属。依次对菌属进行差异性分析见图8：与control组相比，b组大鼠的嗜粘蛋白阿克曼菌(见图8，g)、颤螺旋菌(见图8，k)相对丰度显著升高(p《0.05)，布劳特氏菌(见图8，e)、多尔氏菌(见图8，j)和瘤胃球菌(见图8，f)相对丰度显著降低(p《0.05)。上述菌属均是与肥胖症和脂质代谢有关的菌属，其中，嗜粘蛋白阿克曼菌通过激活回肠和结肠中参与葡萄糖和脂质转运和氧化(pgc-1α)的基因表达，降低脂质水平；且其可促进肝脏胆固醇转运基因(低密度脂蛋白受体)的表达，通过激活参与胆汁酸合成和转运相关基因调节胆汁酸代谢。颤螺旋菌的相对丰度与血清胆固醇含量呈负相关。在肥胖症的发展过程中，布劳特氏菌、多尔氏菌和瘤胃球菌的相对丰度明显增加。上述结果都表明提高油脂组合物中opl/opo比例可显著调节肠道菌群中与肥胖、脂质代谢有关的菌属(p《0.05)。
[0141]
与control组相比，a组和b组大鼠梭菌(clostridiun)的相对丰度从4.72％分别升至8.84％和11.96％(p《0.05，见图8，d)，乳酸杆菌的相对丰度从12.72％降至10.61％和10.93％(见图8，b)。拟杆菌的相对丰度从1.27％降至0.25％和0.33％(见图8，h)。肠道菌群对胆汁酸的修饰作用包括3种：(1)去结合作用(水解初级结合胆汁酸上的牛磺酸或甘氨酸基团，使之变成游离初级胆汁酸)；(2)差向异构作用；(3)脱羟基作用，通过这些作用，初级结合胆汁酸转化为次级游离胆汁酸。胆汁酸的去结合过程是由具有胆盐水解酶(bsh)活性
的细菌主导的。这种微生物酶可切割甘氨酸和牛磺酸与胆汁盐的类固醇核结合部分的酰胺键，具有底物特异性。胆盐水解酶活性是肠道微生物影响机体脂质代谢的关键特征，已经鉴定出具有胆盐水解酶活性的细菌大多为乳酸杆菌属(lactobacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、梭菌属(clostridium)和肠球菌属(enterococcus)等革兰氏阳性细菌，在一些共生的革兰氏阴性拟杆菌属(bacteroides)中也检测到胆盐水解酶，本发明中乳酸杆菌和拟杆菌的相对丰度降低，使得肠道内容物中结合型胆汁酸牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸含量升高，牛磺鹅脱氧胆酸及牛磺熊脱氧胆酸抑制fxr的表达，显著抑制肠道fgf15信号，上调cyp7a1表达水平，促进肝脏中胆汁酸的合成，降低肝脏胆固醇水平。而梭菌属(clostridium)具有脱羟基作用，其与肠道内容物中次级胆汁酸：石胆酸和脱氧胆酸含量呈正相关。石胆酸含量升高促进大鼠结肠中胆酸受体tgr5的表达，进而刺激glp-1的释放，glp-1可减少脂肪生成诱导脂肪酸氧化，调节大鼠脂质代谢。有研究表明在基因背景作用下导致的肥胖易感及肥胖抵抗小鼠模型中，梭菌的丰度和小鼠体重呈现明显负相关。这些与本发明结果相一致，综上所述，提高油脂组合物中opl/opo比例可降低sd大鼠肠道菌属中乳酸杆菌属和拟杆菌属的相对丰度，增加梭菌相对丰度(p《0.05)，进而调节大鼠的胆酸代谢和脂质代谢。除上述丰度较高的菌属外，从实验结果中还观察到丰度较低但各组间存在显著性差异的菌属。与control组相比，b组嗜胆菌(bilophila)相对丰度从0％增加至0.015％(见图8，l)，嗜胆菌是一种胆酸喜欢的菌属，更进一步表明提高opl/opo比例可促进胆酸代谢。