一种磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法

1.本发明属于纳米颗粒制备领域，具体涉及到一种磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法。


背景技术：

2.基于安全性考虑，消费者对天然抗菌剂的关注度不断提高。肉桂皮精油是从植物的花、叶、果实、茎和其他部分获得的芳香的天然油状液体，具有优异的抗菌活性和抗氧化性，是控制食品中微生物生长的有效天然抗菌剂。然而，肉桂皮精油的保质期很短，它们的应用受到其挥发性、对环境条件(如氧气、光和热)的敏感性、强烈的香气和低水溶性的限制，这减少了与含水量高的食品中致病菌的接触。所以要寻找有效的方法改善肉桂皮精油的水溶性并提高其抑菌活性，延长其贮存期。
3.蛋清蛋白具有生物相容性、生物降解性、无毒性以及优异的起泡性和凝胶性被广泛应用于食品工业，并可以在各种条件下形成凝胶，如酸、碱和加热条件，形成的凝胶提供不同的纹理和微结构特征，因此成为装载和释放药物的理想候选物，但蛋清蛋白的热稳定较差且乳化性较低，对精油相容性差，包封率不高等问题，它在疏水性生物活性物质的的应用受到限制。
4.目前，未见有利用磷酸化改性技术制备磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的报道。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法。
8.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法，包括，
9.取蛋清蛋白粉末，加水溶解，离心去杂质，取上清，得到蛋清蛋白溶液；
10.将三聚磷酸钠溶液与蛋清蛋白溶液混合，调节ph至4～10，搅拌混合，制得混合溶液；
11.取混合溶液，加入肉桂皮精油，搅拌混合均匀，间歇微波处理，反应结束后，立即冰浴，4℃冰箱过夜，即得到磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油；
12.将磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油通过均质机均匀搅碎，得到颗粒溶液；
13.将颗粒溶液，超声破碎得到磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒；
14.将胶粒溶液于去离子水中透析，以除去多余的磷酸盐，冷冻干燥，即得所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒。
15.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述取蛋清蛋白粉末，加水溶解，其中，蛋清蛋白粉末与水的质量体积比以g：ml计为2～7:100。
16.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述离心去杂质，其中，离心转速为6000～8000rpm/min，离心时间为10～15min。
17.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述将三聚磷酸钠溶液与蛋清蛋白溶液混合，其中，三聚磷酸钠溶液的浓度为1～3％，三聚磷酸钠溶液与蛋清蛋白溶液的体积比为1～3:1～3。
18.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述取混合溶液，加入肉桂皮精油，其中，肉桂皮精油为肉桂皮精油乙醇混合液，肉桂皮精油与乙醇的体积比以ml：ml计为1:4～6；混合溶液与肉桂皮精油乙醇混合液的体积比以ml：ml计为5～10:1。
19.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述间歇微波处理，微波处理参数为：300～700w，100～115s，12～24s/次。
20.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述将磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油通过均质机均匀搅碎，其中，均质参数为：10000～11000rpm/min，3～6min。
21.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述超声破碎得到磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒，其中，超声参数为：400～800w，3s开/关脉冲，持续10～15min。
22.作为本发明所述磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述将胶粒溶液于去离子水中透析，其中，透析温度为1～4℃，透析时间为20～48h，透析袋分子量为3000～3500da。
23.本发明有益效果：
24.(1)本发明提供一种磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶体颗粒的制备方法，利用加热技术辅助三聚磷酸钠改性蛋清蛋白凝胶的过程，使蛋清蛋白和肉桂皮精油组装成胶体粒子，优选反应体系ph，实现良好的包埋效果；整个制备过程简单快捷，蛋清蛋白来源广泛，廉价易得，胶粒粒子制备周期短、分散性好、产率高。
25.(2)本发明针对肉桂皮精油水溶性差的问题，合理利用磷酸化蛋清蛋白系统包埋，不仅解决肉桂皮精油溶解性的问题，而且对肉桂皮精油的刺激性气味得到有效减弱；同时，本发明通过将肉桂皮精油与蛋清蛋白自组装制备胶体颗粒，对肉桂皮精油起到保护作用，减少了因环境因素造成的氧化分解，提高其生物利用率，并且胶粒能够使得肉桂皮精油与细菌接触，提高其抑菌效果。
26.(3)本发明充分利用蛋清蛋白和磷酸盐资源，不仅拓宽了肉桂皮精油的应用价值，而且为提高蛋清蛋白这一优质资源的附加价值提供新思路。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本
领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
28.图1为本发明实施例中不同制备条件对ee的影响图，其中，a表示油壁比，b表示ph值，c表示壁材的浓度，注：不同字母表示不同制备条件下的差异显著(p＜0.05)。
29.图2为本发明实施例中蛋清蛋白粉(n-ewp)(a1、a2分别代表放大500倍、1000倍的样品)、蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒(ewp-cbo)(b1、b2、b3分别代表放大100倍、500倍、4000倍的样品)和磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒(p-ewp-cbo)(c1、c2、c3分别代表放大100倍、500倍、4000倍的样品)的扫描电子显微图片图。
30.图3为本发明实施例中肉桂皮精油磷酸化蛋清蛋白胶粒对大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)和李斯特菌(c)的时间生长曲线的影响对比图。
31.图4为本发明实施例中不同温度(30-90℃)对蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒和磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的粒径和zeta-电位的影响图；其中，样品在不同温度(30-90℃)下反应30min后放置12h；a1和b1代表蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒和磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的粒径和zeta-电位图；a2和b2分别代表蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒和磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的形态。
32.图5为本发明实施例中不同的离子强度对磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的粒径和zeta-电位的影响图；其中，样品在不同的离子强度(0-400mm)下反应30min后放置12h；b1:磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的粒径和zeta-电位图；蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒(a)和磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒(b2)分别代表样品的形态。
33.图6为本发明实施例中微波加热时间对胶粒的溶解度的影响对比图。
具体实施方式
34.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
35.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
36.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
37.实施例1
38.配置一定量的ewp溶液，离心(6000rpm/min，10min)取上清；
39.将stp溶液(3％)溶解在蛋清蛋白溶液中，调ph，搅拌2h，加入肉桂皮精油(乙醇溶解，5ml注射器滴入)，按照一定油壁比，置于磁力搅拌器上搅拌3h，分别取50ml溶液进行间歇微波(700w，115s，24s/次)处理，反应结束后，立即冰浴，放置4℃冰箱过夜，制成p-ewp-cbo凝胶；
40.通过均质机(11000rpm/min，3min)均匀搅碎凝胶后进一步使用超声破碎仪(600w，3s开/关脉冲，持续15min)将凝胶纳米均匀化，于去离子水中4℃透析24h，以除去多余的磷酸盐，得到p-ewp-cbo胶粒；
41.使用冷冻干燥获得粉末并密封在4℃下保存直到分析。
42.(1)在蛋白浓度为10％，ph8条件下，考察不同油壁比(1:1、1:3、1:5、1:7、1:11)对p-ewp胶粒负载cbo包封率的影响。
43.(2)在固定油壁比1:7，蛋白浓度10％，考察不同ph值(2、3、4、5、6、7、8、9、10)对p-ewp胶粒负载cbo的影响。
44.(3)在固定油壁比1:7，ph 8条件下，考察不同蛋白浓度(4.2、4.9、5.6、6.3、7.0、7.7、8.4％)对p-ewp胶粒负载cbo的影响。
45.使用无水乙醇制备不同浓度的cbo标准溶液(0.5、1、1.5、2、2.5和3ml/l)，以无水乙醇为空白对照，在287nm处测定溶液的吸光度。所有实验至少一式三份进行。cbo浓度和吸光度分别作为横坐标和纵坐标。得到的标准校准曲线方程为：y＝0.1171x+0.0127，r2＝0.999。
46.将冻干颗粒(0.50g)加入25ml试管中，加入10ml乙醇，然后将试管置于摇床上。通过在25℃下轻轻摇动5min来提取冻干颗粒中的表面油，在25℃下使用超声处理60min提取总油。随后，通过在800rpm/min下离心10min收集样品以测量表面油和总油含量。使用紫外分光光度计在287nm处测定所有溶液的吸光度值。使用标准校准曲线估计cbo的量。一式三份检查所有样品。ee使用以下公式计算：
47.ee％＝(w
1-w2)/w0×
100
48.式中，w1为油进入颗粒的总质量(g)，w2为颗粒表面油的质量(g)，w0为加入系统的油质量(g)。
49.结果说明：包封率是评价包封物质质量好坏的重要指标，也是载体是否充分发挥包封性能的关键。
50.结果如图1可知，当油壁比为1:7、ph＝8、蛋白质浓度为6.3％时，最终包封率为93.8
±
1.9％。
51.实施例2
52.磷酸化蛋清-肉桂皮精油胶粒的工艺参数是在最优包封率的条件下进行制备：
53.配置蛋清蛋白溶液为6.3％，离心(6000rpm/min，10min)取上清；
54.将三聚磷酸钠溶液(3％)溶解在蛋清蛋白溶液中，调ph为8，搅拌2h，加入肉桂皮精油(乙醇溶解，5ml注射器滴入)，按照油壁比为1:7，置于磁力搅拌器上搅拌3h，分别取50ml溶液进行间歇微波(700w，115s，24s/次)处理，反应结束后，立即冰浴，放置4℃冰箱过夜，制成磷酸化蛋清蛋白肉桂皮精油凝胶；
55.通过均质机(11000rpm/min，3min)均匀搅碎凝胶后进一步使用超声破碎仪(600w，3s开/关脉冲，持续15min)将凝胶纳米均匀化，于去离子水中4℃透析24h，以除去多余的磷酸盐，得到磷酸化蛋清蛋白肉桂皮精油胶粒；
56.最后，使用冷冻干燥获得粉末并密封在4℃下保存直到分析。
57.磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的粒径、pdi、zeta-电位：
58.方法：用激光光散射仪测量磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒在动态光散射下的粒径大小和pdi。将1ml磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒转移到马尔文测量池中，将温度设定为25℃，散射角设定为90
°
。
59.对于所有的实验，测量分三步进行；每次测量包括11次独立的运行，持续时间为
10s，测量前的平衡时间为120s。
60.结果说明：粒径、pdi和电位是反应蛋白质胶粒均匀性及其在食品工业中应用效果的重要指标。
61.胶粒的pdi越小说明纳米颗粒分散性越好。
62.如表1所示，磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒粒径为133.6
±
0.8nm，pdi为0.265
±
0.01，zeta-电位为-35.4
±
0.057mv。说明此磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒具有优良的均匀性和分散性。
63.表1
[0064][0065]
实施例3
[0066]
磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒(最优包封率的条件下进行制备)的扫描电镜：
[0067]
方法：使用钨灯扫描电子显微镜观察磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的微观结构。
[0068]
首先，将双面导电碳带贴在扫描电子显微镜的样品台上，取少量粉末在胶带上轻轻铺开，然后用氮气枪吹掉没有牢固粘在胶带上的粉末状材料，再使用喷金器在材料表面喷金。加速电压被设定为20kv。
[0069]
结果说明：通过扫描电镜观察冻干样品来解释蛋白胶粒微观结构变化。如图2所示，磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒呈现片状形态，并且显示出一些相对紧凑的结构，具有一些不同大小的不均匀分布的孔隙，凝胶网络结构变得更细、更致密，具有大量不同大小的针叶状聚集体。
[0070]
实施例4
[0071]
抑菌能力测试
[0072]
方法：在96孔聚苯乙烯微量滴定板中测量大肠杆菌的细菌生长曲线。采用酶标仪进行测量。将2％的不同菌液的新鲜液体在37℃下培养12h，将菌液的最终浓度调整为107cfu/ml，将100ml相同最终浓度的肉桂皮精油、蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒和磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒(最优包封率的条件下进行制备)加入到细菌悬液中，在37℃下静置培养108h。对照组为无菌lb，每12h在600nm处测量吸光度。以培养时间为横轴，以od值为纵轴，构建生长曲线。实验重复3次，取其平均值。
[0073]
结果说明：测试结果如图3所示，当初始接种量为107cfu/ml时，1mic磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒对三种菌种的抑菌效果明显优于其他处理组，结果表明磷酸化改性可以显著提高蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的抑菌活性，并且磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒在108h之内完全抑制了病原菌的生长。
[0074]
实施例5
[0075]
稳定性测试方法：
[0076]
热稳定性：将新制备的胶粒(最优包封率的条件下进行制备)分散体在去离子水中
稀释两倍，并在水浴中孵育30min(30-90℃)。然后将样品冷却至环境温度过夜并分析粒度分布。
[0077]
离子强度：将新鲜制备的胶粒分散体用相同体积的氯化钠溶液稀释以形成一系列不同的盐浓度(0至400mm nacl)。取5ml样品放置样品瓶中在室温下放置24h，然后分析粒度分布。
[0078]
结果说明：通过将磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒分别置于不同温度和离子强度条件下观察样品的稳定性。
[0079]
如图4和图5所示，相比蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒，磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒对温度(30-90℃)和离子强度(0-200mm)具有更强的耐受力，说明磷酸化修饰能有效增强蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的环境适应性。
[0080]
实施例6
[0081]
将冻干后的样品在3000g离心15min，将检测溶液稀释25倍，通过bca试剂盒检测蛋白浓度，并根据样品中含氮总量分别测定上清液蛋白质和总蛋白质溶液：溶解度＝上清液中蛋白质含量/样品中蛋白质含量*100％。
[0082]
实验结果说明：图中为ewp-cbo代表蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒，p+ewp+cbo代表三聚磷酸钠、蛋清蛋白粉与肉桂皮精油三者进行简单混合的样品，p-ewp-cbo-75s代表采用微波加热时间为75s时所制备的磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒样品。
[0083]
后面以此类推为不同微波加热时间的磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒样品的溶解度。
[0084]
由图6中可知，当微波加热时间为115s时，磷酸化蛋清蛋白-肉桂皮精油胶粒的溶解度最高。
[0085]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。