专利名称：生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的方法
技术领域：
本发明是关于一种生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮和14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮的新方法，上述化合物是已知的雄甾烯衍生物，并且据报道具有雄性激素作用，芳香酶(aromafase)活性抑制作用，或抑制细胞增殖以对抗人体乳腺癌细胞的作用。
作为一种制备式Ⅰ所示6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的方法。
有一种已知方法，它包括将属于Acremonium属的菌株Acremonium Strictum在营养介质中培养并将6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮从发酵液体培养基中分离出来[日本专利KOKAI(Laid-Open)No.63-192796]。
然而，这种已知方法存在一些问题，即6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的产率低并由于存在着反应产生的副产物而不能以足够量的到纯化的产物。
另一种已知方法包括将属于Acremonium属的特殊菌株即Acremonium Strictum(上述)在含有营养源的介质中培养，将6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮从发酵液体培养基中分离出来并将二酮化合物氧化得到14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮[日本专利KOKOKU(Post-Exam Publn)No.1-32236]。三酮化合物可用作制癌剂。然而，该方法也存在缺点，即14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮的产率低。
本发明的目的是消除前面存在的问题并提供一种新的产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮和14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮的方法。
为了开发一种有效的生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的方法，本发明者从土壤中分离出许多微生物并研究了它们的生产效力。现在发现属于漆斑菌属(Myrothecium)的微生物能有效地生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮，同时减小副产物的生产。
本发明的第一个方面是提供了一种方法，它包括在补充有-4-雄甾烯-3，17-二酮的介质中培养属于漆斑菌 属并能水解-4-雄甾烯-3，17-二酮的微生物以产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮，并将6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮从发酵液体培养基中分离出来。
本发明的第二个方面是提供了一种属于 漆斑菌 属并能将4-雄甾烯-3，17-二酮水解成6β，14α-二烯基-4-雄甾烯-3，17-二酮的微生物。
本发明的第三个方面是提供了一种生产14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮的方法，它包括将4-雄甾烯-3，17-二酮用上面定义的微生物羟基化，氧化所得6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮成14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮;其中在补充有4-雄甾烯-3，17-二酮的介质中培养属于 漆斑菌 属的微生物并将4-雄甾烯-3，17-二酮水解以产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮，并将所得的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮从发酵液体培养基中分离出来。
我们对从发酵液体培养基中分离出来的产物的物理化学性质进行了研究。结果显示该产物与真正的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮相符。
该产物的物理化学性质如下所示。
(1)形态 白色粉末(2)分子量 318(3)分子式 C19H26O4(4)熔点 256-257℃(5)UV吸收光谱 最大吸收236nm(中性，在甲醇中)(6)EI质谱 m/z＝318(7)IR吸收光谱 (KBr法)3460，2960，1748，1682，1650cm-1
(8)质子核磁共振谱(CDCl3) &ppm18-H1.08(3H，s)19-H1.42(3H，s)6-H4.49(1H，t)4-H5.83(1H，s)(9)13C-核磁共振谱(CDCl3) &ppmC-134.4，C-232.6，C-3200.4，C-4126.8C-5167.4，C-673.0，C-737.3，C-832.6，C-947.0，C-1038.5，C-1119.4，C-1224.7，C-1352.9，C-1480.5，C-1530.3，C-1633.0C-17218.2，C-1818.0C-1919.6。
能用于本发明的微生物的一个特殊实施是 漆斑菌种，NK-928521。除了该菌株，所有微生物，包括天然的和人工的突变体也能用于本发明，只要这些微生物属于 漆斑菌 属并能水解4-雄甾烯-3，17-二酮以产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。人工突变体可用常规方法如用UV线处理得到。
菌株NK-928521具有下列微生物学性质。
(1)在各种介质中的生长条件菌株NK-928521在各种琼脂介质中的生长条件如下表所示。
菌株在25℃培养14天后观察到的条件。
表1在介质中的生长条件(1)马铃薯-葡萄糖 它生长的极好,菌落直径达63.0mm。
-琼脂介质 在菌落表面长有厚的绒毛状或羊毛状气生菌丝,呈白色。后表面具有与表面相同的颜色。
(2)麦芽提取物-琼 它生长极好,菌落直径达58.3mm。
脂介质 羊毛状气生菌丝长在菌落表面,呈白色至黄褐色。后表面具有与表面相同的颜色。
(3)Czapek琼脂介质 它生长的很好,菌落直径达64.5mm。
在菌落表面长有薄的气生菌丝。生长的菌丝是潜在的。
(4)燕麦片-琼质介质 它生长的很好。菌落直径达63.5mm。
在菌落表面羊毛状气生菌丝长成带状,呈白色。
(5)玉米粉-琼脂介质 它生长的很好,菌落直径达69.3mm。
在菌落表面长有薄的松散的羊毛状气生菌丝。生长的菌丝是潜在的。
该菌株的分生孢子属细胞采积浅橄榄色至暗绿色的分生孢子座上，在玉米粉琼脂介质上具有发散的或白色的外周。介质上分生孢子的形成需3至4周。具有隔膜的菌丝是无色，光滑和很薄的;隔膜宽2.0～3.0μm。分生孢子梗形成薄的无色acevulus，具有隔膜的外周菌丝是弯曲的，分叉的，天色及光滑的。
分生孢子梗由薄的分生孢子座构成并反复分叉。每枝有2至4个小枝，瓶梗长在最后的小枝上。分生孢子梗是天色的并具有隔膜。细胞大小为7.0-15.0×2.0-3.0μm。2至6个瓶梗是轮状的并相互紧密连接成层状，简状(8.0-16.0×2.0-3.0μm)，是天色。有分子孢子的外周呈黑色。
分生孢子呈船形，螺形或柠檬形(5.0-7.0×2.0-4.0μm)，突出的Pruncate座并呈褐橄榄色，表面是光滑的且大多数分生孢子在分生孢子座上聚积成一大块。
(2)生理性质最适宜的生长温度约25℃。微生物在10-33℃，优选20-30℃下生长，但在37℃下不生长。最适宜的生长PH为约6.0。微生物在4.0至8.0的PH下生长。
基于上面微生物学性质，由Ainswurth，G.C.Aniswrth and Bisby′s Dictionary of the Fungi，the ed.(by Hawksworth，Sutton，and Ainsworth)，CMI，Kew(1983)清楚地说明该微生物是属于真菌门， 米知菌亚门， 丝孢纲的漆斑菌 属的菌株。因此，该微生物被确定为 漆斑菌种。NK-928521。
菌株NK928521由Nahnal Znstitute Bioscience andHuman-Techhogy Agency of Indusfial Science and Technology(Ibarakiken，Japan)于1992.10.29保藏，登记号为FERM P-13234。然后，根据布达佩斯条约，于1993.10.1成为的目标保藏，登记号为FEMR BP-4432。
本发明生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的方法通过下列步骤进行向适当地含有碳源，氮源，无机物和菌株所用的其它营养物的普通介质中加入作为底物的4-雄甾烯-3，17-二酮，然后在该介质中培养菌株。作为碳源，除了甘油外还可以使用如葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖。糊精，淀粉，稠的麦芽糖浆，糖浆，油和脂，有机酸，或其它，在碳源中，优选蔗糖。
氮源的实例包括有机或无机氮化合物，如大豆粉，棉籽粉，玉米浸渍液(C.S.L.)，胨，酪旦白，酪旦白氨基酸，酵母提取物，胚芽，肉羹，尿素，氨基酸和铵盐，在这些氮源中，优选使用大豆粉和C.S.L.。作为无机化合物，无机盐如钠，钾，钙和镁盐或磷酸盐可单独使用或以其适当的混合形式使用。
介质也可适当地含有重金属如铁，铜，锌，镁和钴盐，或维生素如生物素和维生素B1。表面活性剂如硅氧烷和二(亚烷基)二醇醚也可加入介质中。
对于培养来说，可使用微生物培养所用的常规技术，但液体培养，尤其是震荡培养和深充气搅拌培养最适合于该培养。培养温度通常在10℃和33℃之间，优选20℃和30℃之间。培养的PH通常为2至8，优选4至7。
培养所需时间随培养条件而变，但通常为1至10天。介质中4-雄甾烯-3，17-二铜的浓度通常为0.02至2.0%(W/V)，优选0.1至1.5%(W/V)。
向介质中加入4-雄甾烯-3，17-二酮的时间没有特殊限制;底物可以在培养开始时作为介质的组分而存在，也可以在培养过程中连续地或间断地加入。当如葡萄糖，麦芽糖和蔗糖的碳源或如胨和酵母提取物的氮源在培养过程中加入时，底物可以和这些碳源或氮源一起加入介质中。
培养完成后，聚积在发酵液体培养基中的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮可通过利用产物的物理化学性质从液体培养基中获得。
也就是说，6β，14α-二羟基-4雄甾烯-3，17-二酮包括在发酵液体培养基的含细胞的不溶部分和滤液中。因此，将发酵液体培养基离心或过滤以分成含细胞的不溶部分和滤液。然后，可以提取并收集所需的6β，14α-二羟-4-雄甾烯-3，17-二酮。
所需产物也通过用非水有机溶剂如氯仿，乙酸乙酯，乙酸丁酯，丁醇，甲基异丁酮等从发酵液体培养基中直接提取来获得。
为了从发酵液体培养基滤液中分离6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮，可以将滤液吸附在载体上，如活性碳，纤维素粉末和吸附树脂(如聚苯乙烯型多孔聚合物凝胶，异丁烯酸盐型多孔聚合物凝胶，球形多孔聚乙烯醇凝胶，丙烯酸盐型多孔聚合物凝胶等等)，然后用适当的溶剂洗脱。
从这些载体中，用水混溶性有机溶剂如含水酒精和含水丙酮洗脱6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。如果需要，将如此洗脱得到的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮进一步用柱色谱法纯化。
从含培养细胞的不溶馏分中，分离出6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮并通过用水混溶性有机溶剂如丙酮和乙醇从不溶馏分中萃取产品使其得以回收。萃取到的产品可进一步通过甾体纯化所用的常规方法来纯化。该方法可以是例如使用载体如硅胶，活性氧化铝吸附树脂的柱色谱法。
在使用硅胶做载体的柱色谱法中，可用适当的溶剂，单独的或混合的如氯仿，乙酸乙酯，丙酮和甲醇进行洗脱。高效液相色谱技术也可优先用于本产品的分离和纯化，可以使用的载体的典型实例包括硅胶和通过使用化学方法将十八烷，氨基或辛基连接在硅胶上而获得的化学粘合型硅胶，或者吸附树脂如聚苯乙烯型多孔聚合物凝胶。
作为流动相，己烷，异丙醇，含水甲醇，含水乙腈等可用于洗脱，此外，逆流分配技术好可优先用于本产品分离和纯化。逆流分配技术是一种基于液体相间的分配的分离纯化方法。己烷-乙酸乙酯-乙腈，氯仿-甲醇-水等溶剂混合物可用作分配系统。
如果需要，可以用吸附树脂如极多孔树脂和活性碳处理细胞滤液或色谱法的洗脱液以用于脱色，由此可除去滤液或洗脱液颜色。
由此获得的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮可用常规方法如通过日本专利KOKOKV(Post-Exam Publn)NO.I-32236中所述方法或其改进方法进行氧化以产生14α-羟-4-雄甾烯-3，6，17-三酮。
更详细地，可将6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮溶解在仿中。向溶液中加入氧化剂如活化二氧化锰以进行氧化。氧化完成后，过滤反应混合物以除去氧化剂。充分洗涤后，除去溶剂以获得粗产品。
然后将粗产品溶解在少量氯仿或甲醇中。将溶液进行高效液相色谱法，用硅胶柱和洗脱剂(氯仿∶甲醇＝98∶2)以洗脱和分馏14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮。
本发明通过下列实施例做更详细的描述，但并不限制在其范围内。
实施例1将已进行过斜面培养的一白金圈体积的菌株NK-958521(FERM-BP-4432)在置于500ml锥形瓶中的100ml液体介质(3.0%麦芽提取物2.0%多胨，1.0%在豆粉，0.5%KH2PO4，0.5% MgSO4，TH2O-所有浓度均用w/v%表达)上接种。在27℃下振荡培养3天以得到初级种子培养物。
将全部种子培养物接种到置于30升瓶发酵器中的20升液体介质A(5%琼脂，2.0%C.S.L.，1.0%大豆粉，0.5%KH2PO4，0.5%MgSO4，7H2O-所有浓度用w/v%表达)上。在27℃充气搅拌培养3天以获得次级种子培养物。
将种子培养物以0.6升的体积接种到置于30升瓶发酵器中的20升液体介质B(10%琼脂，2.0%C.S.L.，1.0%大豆粉，0.5%KH2PO4，0.5%MgSO4，7H2O，0.75% 4-雄甾烯-3，17-二酮-所有浓度均用w/v%表达)上。在27℃充气搅拌培养5天。
将2升如此获得的发酵液体培养基用2升水稀释并向稀释液中加入3.0%过滤酸。将所得混合物用一个事先装有硅藻土的 布 氏漏斗过滤以分成上清液和细胞。将如此得到的滤液通过作为吸附树脂的DIAION PH-20(商标)以吸附6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮，发后用60%乙醇洗脱。将洗脱液减压浓缩并过滤收集所形成的晶体。
将晶体溶解在140ml丙酮中，通过精密过滤消除溶液的浊度后，将28ml水加入系统中，然后再次减压浓缩。过滤收集沉淀出的晶体。重复前面所说的丙酮重结晶得到的2.4g 6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮，为白色粉末。
实施例2获得突变体的方法将10ml浓度3.6×105/ml的菌株NK-928521(FERM-BP-4432)的孢子悬浮液放置在Petri盘中后，将悬浮液在40cm处接触UV线3分钟，该UV线来自于一个15W的UV无菌，同时用一个磁搅拌器轻微搅拌。将UV处理的悬浮液用生理盐水稀释100至1000倍，然后用玻璃棒向含有商业上可得到的PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)的Petri盘中分别加0.1ml稀释液，然后在25℃培养一周将出现的菌落移至斜面介质上并在25℃下再培养一周，按与实施例1相似的方法将如此得到的突变体用于生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。
实施例3突变体生产6β，14α-二羟基-4雄甾烯-3，17-二酮的证实。
将已进行过斜菌培养生长的实施例2中得到的一白金圈体积的突变体接种到置于25×200mm试验管中的10ml液体介质3.0%麦芽提取物2.0%多胨，1.0%大豆粉，0.5%KH2PO4，0.5%MgSO4·7H2O-所有浓度均用w/v%表示)上。在27℃下震荡培养3天得到种子培养介质。将1.5ml种子培养介质接种到置于500ml 锥形瓶中的50ml液体介质C(5%琼脂，2.0%C.S.L.，1.0%大豆粉，0.5%KH2PO4，0.5%MgSO4·7H2O，0.5%4-雄甾烯-3，17-二酮-所有浓度均用w/v%表示)上，然后在27℃下充气旋转培养5天。
6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的分析称取1g上述培养基，置于试管中。将9ml甲醇加入到培养基中进行萃取，然后将一部分萃取物转移到离心管中。在15000rpm下离心5分钟，除去细胞碎片并在下列条件下通过HPLC定量测定上清液。
分析柱Senshu-pok C 186.0×150mm流动相乙腈/水＝1/2流量1.0ml/分柱温40℃检测240nm样品体积5μl突变体产生1.82mg/g 6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。
实施例4在48ml氯仿中溶解1g实施例1得到的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。然后，向溶液中加入6g活化二氧化锰并将反应在室温下进行几小时。反应后，从反应混合物中除去二氧化锰充分洗涤反应混合物后，用旋转蒸发器蒸发溶剂得到粗馏分。
将该馏分溶解在少量氯仿(或甲醇)中。将溶液进行高效色谱(由Senshu Kogoku K.K.生产)，使用硅胶柱和洗脱剂(氯仿甲醇＝98∶2)以洗脱和分馏14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮。
根据本发明，具有特定生物活性并可用作制备药物的起始物质的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮和14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮可被更有效地高产地加以生产，因为很难从所需产品中分离出来的不需要的副产物的产生可被尽可能地减少。
权利要求
1.一种生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的方法，它包括步骤在加有4-雄甾烯-3，17-二酮的介质中培养属于漆斑菌属并能水解4-雄甾烯-3，17-二酮以产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的微生物，以及从培养过的介质中分离6β，14α-二羟基-4雄甾烯-3，17-二酮。
2.一种属于漆斑菌 属并能水解4-雄甾烯-3，17-二酮以产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的微生物。
3.一种生产14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮的方法，它包括用权利要求2的微生物羟基化4-雄甾烯-3，17-二酮，将所得的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮氧化成14α-羟基-4-雄甾烯-3，6，17-三酮;其中在加有4-雄甾烯-3，17-二酮的介质中培养属于漆斑菌属并能水解4-雄甾烯-3，17-二酮以产生6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的微生物，并将所得的6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮从培养介质中分离出来。
全文摘要
本发明提供了一种新的生产6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮的方法，包括在加有4-雄甾烯-3，17-二酮的介质中培养属于Myrothecium属并能水解4-雄甾烯-3，17-二酮以产生6β，14α-二羟基-4雄甾烯-3，17-二酮的微生物，并从培养介质中分离6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。根据本发明方法，6β，14α-二羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮和14α-雄甾烯-3，6，17-三酮可用简单方法高产地生产。
文档编号C12P33/06GK1095418SQ9312155
公开日1994年11月23日 申请日期1993年11月27日 优先权日1992年11月27日
发明者吉冈秀树, 浅田创, 藤田真司 申请人:日本化药株式会社