专利名称：生产c蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，特别涉及在哺乳动物细胞系中生产高水平的功能性重组C蛋白的方法。
许多蛋白质在成熟过程中都要经历高度的转译后修饰。人C蛋白(HPC)在初始RNA转录本转译过程中或者在转译后不久，被γ-羧基化、β-羟基化和糖基化。许多细胞系如金黄仓鼠AV12细胞系，不能有效地进行这些转译后修饰过程，所以这些细胞系所产生的C蛋白分子功能不充分。另一些细胞系如人肾293细胞系虽然产生功能充分的C蛋白分子，但这些细胞系中C蛋白分子的表达水平略低。本发明涉及在通常不产生功能充分的C蛋白分子的细胞系中提高功能充分的C蛋白产量的方法。本发明还涉及在通常产生功能充分的C蛋白分子的细胞系中提高C蛋白分子总产量的方法。本发明的方法涉及在高于常用培养温度(37℃)的温度下培养产C蛋白的细胞系。
就本文所公开并要求保护的本发明的目的而言，下列术语定义如下。
腺病毒转化细胞系表达腺病毒ElA基因产物的细胞系。
人C蛋白人C蛋白酶原和活化的人C蛋白。
新生蛋白经mRNA转录本转译产生的尚未经过任何转译后修饰的多肽。但是，有些转译后修饰，如谷氨酸残基的γ-羧基化和天冬氨酸残基的羟基化，在由mRNA转录本完全转译出蛋白之前便可能开始进行了。
C蛋白活性人C蛋白与蛋白水解、酰胺水解、酯水解以及生物(抗凝或血纤维蛋白原溶解)活性有关的任何性质。测定蛋白抗凝活性的方法是本领域公知的(参见Grinnell等，Bio/Technology 51189-1192，1987)。
酶原无酶活性的蛋白水解酶前体。这里所用的C蛋白酶原是指分泌的无活性形式的C蛋白，不论是单链的还是双链的。
本公开所使用的所有氨基酸缩写，都是美国专利商标局按37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)的规定而认可的缩写。
本发明涉及一种在经过腺病毒转化的重组哺乳动物宿主细胞中提高C蛋白产量的方法。该方法包括在约38℃至39℃之间的温度下，培养经过腺病毒转化的重组哺乳动物宿主细胞。本发明还涉及一种在经过腺病毒转化的重组哺乳动物宿主细胞中提高功能性C蛋白产量的方法，该方法包括在约38℃至39℃之间的温度下培养宿主细胞。
曾用许多细胞系来生产重组人C蛋白。但是，由于人C蛋白分子要经历高度的转译后修饰，大多数普通细胞系或者不产生功能充分的C蛋白，或者虽然产生功能充分的C蛋白但表达或必泌水平仍然较低。例如，金黄仓鼠AV12细胞系通常不能产生含有所有9个γ-羧基化谷氨酸残基的C蛋白分子，而这9个残基是完整活性所必需的。另一方面，人胚肾293细胞产生的C蛋白分子通常是充分γ-羧基化和β-羟基化的，但这些细胞系的人的C蛋白产量较低。
哺乳动物细胞培养物通常是在37℃下进行培养的。如果在37℃下培养含有人C蛋白基因编码质粒的经腺病毒转化的金黄仓鼠AV12-644细胞系(ATCC CRL9595)，该细胞系产生的C蛋白只有40%至50%是充分γ-羧基化的，致使粗制培养基中C蛋白的功能较低。而同一细胞系在38.5℃至39℃下培养时，条件培养基中所分泌出的C蛋白的功能性抗凝活性则有所提高。该细胞系在较高温度下培养时C蛋白的分泌速度比37℃下的分泌速度约低20%-30%，但这种分泌速度的下降由于所分泌的C蛋白功能提高而得到补偿。
人肾293细胞(ATCC CRL1573)是转化的原生胚人肾细胞，该细胞含有并表达腺病毒5的转化基因。曾使用这些细胞来表达若干种重要的基因产物，学术机构和企业中的许多不同的实验室都曾使用过这些细胞。例如，Yan的美国专利4，981，952和Bang等人的美国专利4，992，373都公开了使用293细胞系来生产人C蛋白。人胚肾293细胞如果携有编码人C蛋白基因的表达质粒，就会分泌充分γ-羧基化的人C蛋白。在37℃下培养时，该293细胞系分泌比活约为350U/mg的重组人C蛋白。提高这些重组293细胞的培养温度并未使所分泌的C蛋白的功能有所提高(因为该细胞系产生的C蛋白已经充分γ-羧基化了)。但是，在38℃-39℃下培养重组293细胞与该细胞在37℃下培养相比，C蛋白的分泌速度有所提高。就本公开的目的而言，C蛋白产量的增加有时是指该细胞的C蛋白总分泌量增加，有时是指所分泌的C蛋白功能提高。
技术人员将会理解，本发明并不局限于使用腺病毒转化的人胚肾细胞系或腺病毒转化的金黄仓鼠AV12-664细胞系。许多哺乳动物细胞系都可用来产生人C蛋白。例如，HepG2细胞系就是曾用来生产人C蛋白的一种人肝细胞系。BHK(幼年仓鼠肾)细胞系、SA7细胞系、SV20细胞系、FAZA细胞系和MK2细胞系，也都曾用来生产人C蛋白。以上列出的细胞系虽然并不都是腺病毒转化细胞系，但技术人员知道，许多哺乳动物细胞系都可以用腺病毒来转化，从而建立起一个特异的腺病毒转化细胞系，这样便可以在本发明的方法中使用。
还应该理解，本发明不仅仅局限于38℃和39℃的温度。大多数哺乳动物细胞的发酵都在37℃下进行。但已经发现发酵温度为约38℃时会提高腺病毒转化细胞的C蛋白产量。因为许多发酵罐温度和暖室(warm-room)温度都会有0.5℃以下的波动，所以术语“约”应视为温度偏离所述温度0.5℃以内。所以，术语“约”38℃可以是37.5℃-38.5℃。另外，术语“约”39℃可以是38.5℃-39.5℃。一旦培养温度达到约40℃，大多数哺乳动物细胞的生长情况都不好。本发明方法的优选温度范围是约38℃-39℃，而本发明最优选的实施方案是腺病毒转化细胞系的培养温度约为39℃。
技术人员还会认识到，本发明的方法将会让人更容易选择那些表达高水平C蛋白的克隆。例如，由于某个细胞系的C蛋白分泌水平提高，更易于测定粗制培养基中的分子，所以也就更易于选择所需产物的表达水平最高的克隆。39℃下分离出的克隆与37℃下分离出的克隆相比，表达水平平均提高约69%-93%。
提供下列实施例以说明本发明，但这些实施例不应误认为是对本发明的限制。
实施例1在293细胞中生产人C蛋白用技术人员公知的技术，例如Yan的美国专利4，981，952(其全部内容在此列为参考)中所述的技术，在人肾293细胞中生产重组人C蛋白(rHPC)。Bang等人的美国专利4，775，624公开并请求保护编码人C蛋白的基因，该专利的全部内容在此列为参考。用于在293细胞中表达人C蛋白的质粒是Bang等人的美国专利4，992，373中所公开的质粒pLPC，该专利的全部内容在此列为参考。质粒pLPC的构建也描述于欧洲专利公开0445939及Grinnell等，Bio/Technology51189-1192，1987中，这两篇文献的内容也在此列为参考。简单地说，将质粒pLPC转染到293细胞中，然后鉴定出稳定的转化体并进行传代培养。给显示出最高表达水平的克隆作不同的命名(例如CC35和CC31-1)，并在标准细胞培养条件下进行培养。另一种方法是，用质粒pGTC来建立稳定转化的细胞系GT-21。质粒pGTC的构建公开于欧洲专利公开0445939中。在37℃下培养后，可以用Yan的美国专利4，981，952的技术，从培养液中分离出人C蛋白。这样生产的人C蛋白可以以未活化的酶原形式使用，也可以用本领域技术人员公知的方法活化。另外，在相同条件下于39℃培养相同的克隆。结果列于表Ⅰ中。
表Ⅰ培养温度对293细胞C蛋白分泌量的影响克隆 ng/106/天(37℃) ng/106/天(39℃) 提高百分比CC35 395 663 68CC35 425 664 56GT-21 237 747 215CC31-1 1164 2361 103CC35 824 1227 49CC35 2100 3906 86即使以不同的细胞密度培养细胞从而致使每个细胞的表达水平不同(例如CC35)，所观察到的39℃下分泌量的增加百分比也是一致的。
实施例2在AV12-664细胞中生产人C蛋白基本上按照实施例1的教导，用质粒pLPC生产人C蛋白，所不同的是使用金黄仓鼠AV12-664细胞代替人胚肾293细胞。用Grinnell等人的技术(Bio/Technology 51189-1192，1987)测定功能性抗凝活性。结果列于表Ⅱ。
表Ⅱ培养温度对AV12细胞产生的人C蛋白的功能性抗凝活性的影响温度 单位数/毫克37℃ 216±6239℃ 460±19
权利要求
1.一种提高腺病毒转化重组哺乳动物宿主细胞的C蛋白产量的方法，该方法包括在约38℃和约39℃之间的温度下培养所述腺病毒转化重组哺乳动物宿主细胞。
2.权利要求1的方法，其中重组哺乳动物宿主细胞为293细胞。
3.权利要求1的方法，其中培养温度为约38℃。
4.权利要求1的方法，其中培养温度为约39℃。
5.权利要求2的方法，其中培养温度为约38℃。
6.权利要求2的方法，其中培养温度为约38.5℃。
7.权利要求2的方法，其中培养温度为约39℃。
8.一种提高重组法生产的C蛋白分子的γ-羧基化水平的方法，该方法包括在约38℃和约39℃之间的温度下，培养产生所述C蛋白分子的重组AV12宿主细胞。
9.权利要求8的方法，其中在约38℃下培养重组AV12宿主细胞。
10.权利要求8的方法，其中在约39℃下培养重组AV12宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及一种在腺病毒转化哺乳动物细胞中生产高水平的功能性重组蛋白的方法，该方法是在约38℃和约39℃之间的温度范围内培养能够产生重组蛋白的细胞。该方法能提高某些细胞系的总蛋白表达水平，并提高另一些细胞系的功能性蛋白的水平。
文档编号C12N15/12GK1107887SQ9411910
公开日1995年9月6日 申请日期1994年12月15日 优先权日1993年12月15日
发明者B·W·格林内尔 申请人:伊莱利利公司