新的多肽的制作方法

专利名称：：新的多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及青霉素结合蛋白(PBP)变异体，所述蛋白与细菌肽聚糖的生物合成有关。本发明还公开了编码PBP变异体的DNA分子，以及携载该DNA分子的载体和细胞。本发明还涉及治疗用化合物的检测和设计方法，所述化合物对PBP有高亲和性，所述方法用到了PBP变异体。
背景技术：
：细菌和大多数单细胞生物体都具有细胞壁，细胞壁含有交联的多糖-肽复合物，叫做肽聚糖。肽聚糖的生物合成包括三个阶段(1)胞液中前体(糖核苷酸)的合成，(2)前体跨膜转运，形成多糖链，(3)细胞壁中的单一肽聚糖链相互交联。在肽聚糖生物合成的后一阶段，必须在新的聚糖链和已存在的肽聚糖之间形成新键。新合成的链大约有10个二糖那样长，并由转糖基酶延伸至100和150个二糖单元之间的最终聚糖链。肽聚糖由转肽酶的作用而交联起来，转肽酶将一个聚糖链的末端D-ala与相邻区域中二氨基庚二酸残基上的游离ε-氨基基团连接起来。有些抗生素通过干扰肽聚糖层的形成而抑制细菌生长。交联反应是两类重要的抗生素的作用目标，这两类抗生素是青霉素和头孢菌素。青霉素被认为可以与催化交联的转肽酶进行不可逆的反应。与青霉素有相互作用的蛋白被分成三组β内酰胺酶；低分子量青霉素结合蛋白，主要包括羧肽酶；高分子量青霉素结合蛋白。青霉素结合蛋白是这样一些酶，已表明它们可与放射性标记的青霉素G结合。在大肠杆菌中，这些蛋白被称作例如PBP1A和PBP1B，二者均属于高分子量PBP。已知为膜结合蛋白的PBP1A和PBP1B维持细胞的完整性，并控制肽聚糖一侧的细胞壁在生长过程中延伸。细菌可以耐受PBP1A或PBP1B的失活，但两个基因都缺失时(被命名为ponA和ponB)是致死性的(Yousif等，1985)。已知PBP1B是双功能酶，同时具有转肽酶和转糖基酶活性(Ishino等，1980)。因为PBP1A可以替换PBP1B，所以相信PBP1A也是双功能的。β内酰胺抗生素，如青霉素，仅抑制这些蛋白的转肽酶活性。转糖基酶反应被例如默诺霉素(moenomycin)抑制，默诺霉素是一种磷酸糖酯，用作动物营养中的生长促进剂，它也具有广谱的杀菌活力。转糖基酶存在于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中。这表明通过抑制转糖基酶来干扰肽聚糖的生物合成，可能对重要的临床病原体产生致死作用。PBP1B中假定的转糖基肽结构域被指认为N末端478个氨基酸(Nakagawa等，1987)。这些区域包括位于PBP1A和1B的N末端半区之间的三个保守氨基酸序列，它们可能代表与转糖基酶活性有关的区域。从金黄色葡萄球菌中制备青霉素结合蛋白2A的方法公开于EP-A-0505151中发明公开关于对抗生素有抗性的细菌的报道在不断增多。因此，人们需要新的化合物，这些化合物通过结合青霉素结合蛋白而抑制细菌生长。本发明提供PBP变异体，它们有助于检测和设计对PBP有高亲和性的治疗用化合物的方法。相应地，本发明的一个目的是提供这样一些多肽，它们是细菌双功霉素结合蛋白与细胞膜结合，并具有转糖基酶和转肽酶活性，并且所述衍生物缺少膜锚定序列，但保留了所述酶活性中的一个或两个。上述“细菌细胞”优选地是大肠杆菌细胞或肺炎链球菌细胞。本发明的可溶PBP变异体保留了转糖基酶活性，表明缺少膜锚定序列的可溶PBP变异体可以识别与脂相连的底物，并将二糖聚合成重复单元。因此可以假设缺少与酶连接有关的残基的其他PBP类似物可能有酶本发明的另一目的是提供这样的多肽，它们是细菌双功能青霉素结合蛋白的截短的水溶性衍生物，当在细菌细胞内表达时，所述青霉素结合蛋白与细胞膜结合，并且同时具有转糖基酶和转肽酶活性，所述衍生物缺少膜锚定序列，但保留了转糖基酶活性。上述“细菌细胞”优选地是大肠杆菌细胞。高分子量青霉素结合蛋白氨基酸序列的排列和对β内酰胺和羧肽酶中与青霉素结合有关的基元的编辑，表明PBP1A和1B的C末端半区是转肽酶活性的功能性结构域，并且它包括了青霉素结合结构域。此外，Nakagawa等(1987)指出编码PBP1BN末端478个氨基酸的截短的ponB基因可以有转糖基酶作用。基于这些发现，人们认为高分子量PBP1A和1B蛋白是两个结构域蛋白，N末端半区形成转糖基酶结构域，C末端半区形成转肽酶结构域。计算机分析预测两个结构域由连接物或铰链区连接在一起，连接物或铰链区对蛋白的功能没有结构上的或酶活性上的贡献。预计大肠杆菌PBP1B的连接物区域是从位置545到559，而对大肠杆菌PBP1A来说是在位置501周围。本发明PBP的单功能截短变异体在用于X射线晶体学时，有助于得到青霉素结合蛋白的转糖基酶结构域的结构信息。此外，单功能变异体的减小了的大小有利于结晶。本发明的水溶性多肽优选地具有与序列表中SEQIDNO2、4、6、12、或13一致的氨基酸序列。缺失ponA和ponB基因是致死的(Yousif等，1985)，这个观察结果并未对被编码的PBP1A蛋白的转糖基酶活性的必要性提出疑问，因为缺失导致转糖基和转肽活性都消失。此外，这一实验并未提出这样的可能性，即转糖基酶活性可能来自于除PBP1A或PBP1B外的一种青霉素结合蛋白。也可能存在对转糖基酶活性有贡献的，迄今未被描述过的青霉素结合蛋白和/或其他蛋白。形成PBP1A和1B的假定转糖基酶结构域的氨基酸的排列表明这两种蛋白的N末端半区中12个氨基酸中的9个(区域1)、9/10(区域2)和8/10(区域3)的三个序列(stretch)是相同的(Broome-Smith等，1985)(图14)。这相同的三个区域同样存在于近来被描述的其他两个蛋白序列中肺炎链球菌PBP1A(Martin等，1992)和来自流感嗜血杆菌的94kDa蛋白(Tomb等，1991)。这些残基在不同物种的保守性表明它们对于维持蛋白的结构特性，或对于它自身的转糖基作用都是非常必要的。PBP1A和1B的重叠的功能性转糖基酶和转肽酶活性表明了催化中心的保守性，并且被设计为与PBP1A的催化中心相互作用的分子也应当会与PBP1B反应。对被表达蛋白的功能性转糖基酶活性的研究可以如下进行用合适的底物直接进行体外检测，或测量该蛋白补偿染色体上相关基因缺失的能力。已经表明，带有编码野生型产物(PBP1A或PBP1B)的基因的载体能够维持大肠杆菌细胞的生存(Yousif等，1985)。这种转移-补偿(trans-complementation)技术可用于评估编码PBP的突变基因的功能特性，突变基因带有使酶的(转糖基或转肽)功能之一失活的突变。这些突变产物在转移中补偿染色体ponA和ponB缺失的能力将限制单一酶功能的必要性。因此需要这样一种研究工具，它可以使研究青霉素结合蛋白转糖基酶活性特异性失活的效果成为可能。因此，本发明的另一方面是一种多肽，它是细菌双功能青霉素结合蛋白的转糖基酶缺陷型衍生物，当在细菌细胞中表达时，所述青霉素结合蛋白与细胞膜结合，并且具有转糖基酶和转肽酶活性，而且所述衍生物缺少转糖基酶活性但保留转肽酶活性。上述“细菌细胞”优选地是大肠杆菌细胞。转糖基酶缺陷型PBP变异体可以被有利地用于X射线晶体学，目的是得到PBP活性部位的结构信息。晶体形式的可溶性转糖基酶缺陷型PBP变异体的结构分析可用于描述催化区域，有助于设计能够特异性地抑制转糖基酶活性的分子。优选地，本发明的转糖基酶缺陷型多肽是这样一种多肽，由于编码该多肽的基因的第二保守区域的突变或缺失而导致其缺少转糖基酶活性。进一步优选地，本发明的转糖基酶缺陷型多肽具有与序列表中SEQIDNO7、8、9或10相同的氨基酸序列。用于富集青霉素结合蛋白的常规纯化方法利用了“青霉素”亲和性。蛋白与青霉素的结合是共价的，需要严格的条件才能洗脱结合的蛋白。这可能导致蛋白的酶活性在一定程度上失活。因此需要替代的亲和基质以有效地纯化蛋白。因此本发明包括这样一种多肽，该多肽包含(a)第一多肽，它是本发明的PBP变异体；(b)附加的多肽，它使得与亲和基质的结合成为可能；在所述的多肽之间有切割位点。上述“附加的多肽”优选地是谷胱甘肽-S-转移酶或是与谷胱甘肽基本类似的多肽。这样的附加的多肽允许用GlutathioneSepharose亲和基质对蛋白进行快速纯化。在另一优选方式中，附加的多肽是富含组氨酸残基的多肽，这些组氨酸残基赋予蛋白结合镍亲和柱的能力。附加的多肽可与可溶PBP/膜结合PBP的N末端或C末端融合。融合蛋白与亲和基质结合的能力使蛋白得以固定化。这种固定化的蛋白可用于分析结合活性蛋白的不同配体的竞争性结合，并因此用于筛选与感兴趣的酶结构域结合的化合物。本发明的多肽并未被严格地限定于序列表中显示的序列中的任何一个。本发明进一步包括带有修饰(如替换、小的缺失、插入或倒位)的多肽，这些多肽仍基本上具有PBP变异体的生化活性，PBP变异体的氨基酸序列在序列表中公开。因此本发明包括这样一些多肽，它们的氨基酸序列与本发明的任一PBP变异体的氨基酸序列有至少90％的同源性，优选有至少95％同源性。本发明的进一步的目的是提供分离和纯化的DNA分子，这些分子具有编码本发明的任一PBP变异体的核苷酸序列。在本发明的优选方式中，所述DNA分子具有与序列表中SEQIDNO1、3或5相同的核苷酸序列。但是，本发明的DNA分子不被严格地限定于序列表中显示的序列中的任何一个。本发明进一步包括带有修饰(如替换、小的缺失、插入或倒位)的DNA分子，这些DNA仍编码基本上具有本发明的PBP变异体的生化活性的蛋白。本发明也包括这样的DNA分子，由于遗传密码，该DNA分子的核苷酸序列与编码本发明的PBP变异体的核苷酸序列是简并的。遗传密码的天然简并性是本领域众所周知的。因此应当理解，序列表中显示的DNA序列仅是大而确定的一组DNA序列中的示例，这些DNA序列编码PBP变异体，而PBP变异体的氨基酸序列显示在序列表中。本发明的另一方面是一种可复制表达载体，它携带了本发明的DNA分子，并能介导DNA分子的表达。在本语境中，术语“可复制”意味着载体能够在其被导入的某一给定类型的宿主细胞中复制。载体的例子是这样一些病毒，比如噬菌体、粘粒、质粒和其他重组载体。通过本领域已知的方法可以将核酸分子插入载体基因组中。本发明的载体优选地是下面表1中列出的质粒中的一种。本发明也包括携载了本发明的载体的宿主细胞。这样的宿主细胞可以是原核细胞，单核的真核细胞或得自多细胞生物体的细胞。因此，宿主细胞可以是例如细菌、酵母或哺乳动物细胞。对熟悉重组DNA方法的人来说，将载体有效地导入宿主细胞所用的方法是熟知的。本发明的另一方面是制备一种多肽的方法，该多肽是青霉素结合蛋白的衍生物，所述方法包括在培养基中或培养基上生长本发明的宿主细胞以表达多肽，并且任意地回收该多肽。合适的宿主细胞可以是任何上述的细胞类型，用于生长细胞的培养基可以是任何适于此目的的常规培养基。已经证明，高分子量青霉素结合蛋白锚定在膜上，但蛋白的主体位于细胞周质中(Edelman等1987)。因此，缺少膜信号/锚定信号的PBP衍生物在异源环境(即胞液)中被强迫折叠成它们的天然状态。这经常导致错误的折叠，表达的蛋白的主体聚集成非天然形式，被称作包涵体。人们现在惊奇地发现，通过编码PBP变异体的基因的受控转录，能够得到高产率的活性水溶性PBP变异体。这种受控转录涉及(I)利用次优浓度的诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和(ii)在降低的温度下培养表达PBP变异体的细胞。这些因素的累积作用有助于活性可溶蛋白的整体回收。结果，通过所述(i)次优的去抑制启动子系统和(ii)降低培养温度以延长代时的组合来实现的低速率表达，能增加缺少膜锚定片段的蛋白的溶解性。本发明的另一重要方面是一种制备本发明的水溶性多肽的方法，其包括培养携载了表达载体的大肠杆菌细胞，该载体中编码多肽的DNA序列受控于异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子，在次优的诱导该启动子的IPTG浓度和20至24℃之间，优选22℃下进行培养。IPTG浓度优选地为约0.01mM。在表达编码本发明PBP变异体的ponAdel23基因时，通过(i)利用次优浓度的诱导物IPTG受控地将T7启动子去抑制和(ii)通过在22℃下培养降低生长速率，导致活性蛋白的产率达到诱导的感兴趣蛋白总量的约50％。生长和诱导条件对有效回收可溶蛋白至关重要，因为高温生长和高浓度IPTG诱导会造成大部分蛋白失活，形成包涵体。应当理解，这种受控表达法也可用于其它可诱导的启动子系统，例如tac系统，其中诱导物是IPTG，宿主是lacY阴性宿主。获得酶活性部位构型的相关结构资料的一个途径是生产能抑制酶促反应的单克隆抗体并确定其性质。抑制活性的抗体代表封闭活性部位袋或与底物竞争进入活性部位袋的分子，或代表能阻止催化活性必须的结构转变的分子。在任一情况下，抗体均可用作将靶酶与放射性标记的抑制性化合物结合相互作用定量化的工具，只要抑制性抗体的亲和性已知，即可判定相互作用的亲和程度。由抑制性抗体识别得到的表位图可推定形成活性位点的残基。因而本发明的另一方面是一种鉴定能结合细菌双功能青霉素结合蛋白的抗体的方法，包括将本发明的多肽用于抗体结合试验并选择能结合多肽的抗体。本发明还包括针对本发明的PBP变异体的单克隆抗体。可如此制备单克隆抗体用已知的杂交瘤技术将免疫动物的产抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选生产所需抗体的杂交瘤细胞素。本发明的另一方面是检测结合青霉素结合蛋白的化合物的方法，该方法包括(a)将本发明的PBP变异体多肽接触待研究的化合物；(b)检测该化合物是否结合该PBP变异体。例如，一种检测结合青霉素结合蛋白的化合物的方法包括(a)培养本发明的宿主细胞；(b)裂解该细胞，分离粗细胞提取物；(c)将该细胞提取物接触潜在的青霉素结合蛋白抑制物；(d)在该细胞提取物中引入能结合青霉素结合蛋白的试剂，(e)除去该试剂的未结合部分，(f)检测该试剂在细胞提取物中的存在。检测结合青霉素结合蛋白的化合物的另一方法包括(a)将固定在固相支持物上的本发明的PBP变异体多肽接触一种可能的青霉素结合蛋白的抑制物；(b)将一种已知能结合青霉素结合蛋白的试剂提触固定化的多肽；(c)除去该试剂的未结合部分；(d)检测与固定化的多肽结合的所述试剂的存在。该方法的优选形式是一种检测结合青霉素结合蛋白转糖基酶结构域的化合物的方法，该方法包括(a)在本发明的多肽不是转糖基酶缺陷型PBP变异体前提下，将固定化于固相支持物的该多肽转糖基酶结构域与可能的青霉素结合蛋白转糖基酶活性抑制物接触；(b)将结合青霉素结合蛋白转糖基酶结构域的试剂接触固定化的多肽；(c)去除该试剂的未结合部分；(d)检测与固定化的多肽结合的所述试剂的存在。对转肽酶特异的抗体可被固定化到BIAcore传感器芯片表面。BIAcore系统，其中“BIA”代表“生物特异性相互作用分析”，购自PharmaciaBiosensor，瑞典。根据输出RU信号检测结合于固定化的抗体上的蛋白。用竞争性检测可筛选TP抑制物，其中可溶性蛋白与受试化合物预温育。受试化合物与蛋白结合会导致结合TP特异性抗体的蛋白减少。同样，对转糖基酶特异的单克隆抗体可用于筛选TG抑制物。类似地，氨苄青霉素或修饰的默诺霉素可偶合到表面上，用于间接竞争性检测，其中蛋白与受试配体预温育后引入BIAcore。因此，检测结合青霉素结合蛋白的化合物的另一方法可包括(a)将本发明的PBP变异体多肽接触可能的青霉素结合蛋白抑制物；(b)将固定于固相支持物上的结合青霉素结合蛋白的试剂接触多肽；(c)检测与固定化的试剂结合的多肽的存在。该方法的优选形式是检测结合青霉素结合蛋白转糖基酶结构域的化合物的方法，该方法包括(a)在本发明的多肽不是转糖基酶缺陷型PBP变异体的前提下，将该多肽转糖基酶结构域与可能的青霉素结合蛋白抑制物接触；(b)将固定于固相支持物的结合青霉素结合蛋白转糖基酶结构域的试剂接触该多肽；(c)检测与固定化的试剂结合的多肽的存在。上述“结合青霉素结合蛋白的试剂”可以例如是单克隆抗体或标记的抗生素化合物如[3H]氨苄青霉素。本发明的另一方面是一种确定青霉素结合蛋白的蛋白结构的方法，其特征在于，本发明的PBP变异体多肽被用于X射线晶体学。本发明优选的PBP变异体的某些特征由下面表1总结。列于表中的质粒已按照布达佩斯协议保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，阿伯丁，苏格兰，英国。保藏日期为1994年6月28日。</tables>发明的实施例下列实施例中，术语“标准方法”和“标准操作”指普通的实验室手册如Sambrook，Fritsch和Maniatis(1989)的手册中的方法与操作。实施例11.1构建编码大肠杆菌PBP1A可溶形式的基因用Kyte和Dolittle(1982)描述的计算机程序推导出参与PBP1A膜锚定区域的可能的氨基酸残基。图1给出N末端60个氨基酸的预测的疏水性。基于该疏水性图预测N末端23个氨基酸对蛋白质的膜锚定结构域贡献很大，但不一定完全涵盖膜锚定结构域。该区域假定为参与“膜定位”的区域。携载天然ponA基因(编码野生型PBP1A)的pBS98质粒得自B.S.Spratt教授，微生物遗传学组，生物科学学院，Sussex大学，Brighton，英国。pBS98的构建由Broome-Smith等(1985)描述。根据下列标准方法制携载pBS98的细胞中获得质粒DNA。聚合酶链式反应(PCR)用的寡聚核苷酸引物用AppliedBiosystems380A型合成。用的5′寡聚核苷酸引物是TG-82NcoI↓5′-TCGACCATGGGCCTATACCGCTACATCG-3′MGLYRYI23242526272829(氨基酸序号)TG-82有下列特征(1)它能构建突变体ponA基因，其编码产物将野生型PBP1A的第24个氨基酸(甘氨酸)作为所表达的突变体蛋白的第2个氨基酸；(2)它引入由限制性酶NcoI识别的DNA序列。这样引入的ATG密码子在适当的系统中表达时对应突变体PBP1A的第1个氨基酸。所用的3′寡聚核苷酸引物是TG-645′-CGCGGATCCGAATCACAACAATTCCTGTGC-3′↑BamHITG-64有下列特征(1)它在PBP1A蛋白的第850个氨基酸后引入一个终止密码子；(2)它引入限制性内切酶BamHI位点，协助克隆进适当的表达载体。用这些引物以及pBS98DNA作模板，按照标准方法进行PCR。扩增到约2.5kb的DNA片段。片段用限制性酶NcoI消化后再用BamHI消化。这段2.5kb的NcoI-BamHIDNA片段然后连接到由NcoI和BamHI预先切割的载体pBR329(Covarrubias等1982)中。用标准方法将两段DNA片段连接，将连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中。转化的细胞铺到含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。37℃温育过夜后对单个的氨苄青霉素抗性菌落检测其四环素敏感性，因为插入NcoI-BamHI区域使质粒对氯霉素和四环素敏感。携带2.5kb插入序列的重组质粒命名为pARC0488。NcoI-BamHI2.5kbDNA片段从pARC0488中释放出来，连接到NcoI-BamHI酶切并纯化的pARC038(图2)上。pARC038质粒是pET11d的衍生物(Studier等，1990)。其中EcoRI和PstI位点用T4外切核酸酶制成平末端，EocRI-PstI0.75kbDNA片段换成平末端的卡那霉素抗性盒(PharmaciaBiochemicals)。连接混合物转化至大肠杆菌BL26(DE3)的感受态细胞中。转化混合物铺到含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上。从几个卡那霉素抗性菌落中微量制备质粒DNA，用标准方法用限制性外切核酸酶筛选。一个携载含预定结构的质粒的菌落(图3)标为pARC0558(NCIMB40666)。SEQIDNO1给出标识为ponAdel23的突变体ponA基因DNA序列。SEQIDNO2给出可溶性PBP1Adel23的氨基酸序列。1.2.ponAdel23的表达携载pARC0558的大肠杆菌BL26(DE3)细胞(得自J.J.Dunn博士，生物学系，Brookhaven国立实验室，长岛，纽约，美国)在含50μg/ml卡那霉素的LB中长到600nmO.D.值为0.6，用0.01mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6小时。诱导6小时后收获细胞，用弗氏压碎机破碎。低速离心除去未破碎的细胞及残片后，用下列任一方法得到胞液(可溶)级分(1)按Page等(1982)的描述，其中用蔗糖梯度离心将沉淀、膜和可溶蛋白分开；或(2)得到的上清200,000×g离心90分钟，所得上清作为胞液/可溶蛋白级分。1.3表达的PBP1Adel23的青霉素结合对得到的胞液级分用Rojo等(1984)的方法检查突变体PBP1A是否存在。该方法用[125I]头孢环己烯作为标记的青霉素，因为它对PBP1A特异。能结合标记的头孢环己烯的突变体PBP1Adel23在胞液级分即可看出。表达的突变体蛋白约50％分到可溶性蛋白中，剩下的50％分到包涵体和/或膜连部分。细胞用低于最优浓度的IPTG诱导并且培养物在22℃生长故能得到高水平的活性突变体PBP1Adel23。图4给出可溶性PBP1Adel23的青霉素结合图。1.4纯化可溶性PBP1Adel2322℃诱导6小时得到的大肠杆菌BL26(DE3)/pARC0558细胞沉淀用A缓冲液(30mMTris-Cl，pH8.0；10mMEDTA；10μg/ml亮肽素；10μg/ml抑肽酶；5mMDTT)洗2次，重悬于相同的缓冲液中。细胞悬浊液于1200磅通过弗氏压碎机。将裂解物10,000rpm离心10分钟。得到的混合物用硫酸铵调至30％饱和。混合物12,000rpm离心10分钟，沉淀悬浮于含1MNaCl的A缓冲液中。溶解的沉淀物用头孢环己烯-Affigel10基质处理。根据生产商(BioradLaboratories，美国)的指导将头孢环己烯偶联到Affigel10上。含可溶性PBP1Adel23的级分溶于含1MNaCl的A缓冲液中后4℃与头孢环己烯-affigel10小珠温育16小时。然后用含1MNaCl的A缓冲液洗小珠直到280nm的吸收接近零。检测洗脱液中青霉素结合活性来监测PBP1Adel23的洗脱。用如Rojo等(1984)的描述制备的[125I]头孢环己烯测量该活性。用1M羟胺(pH8.5)于25℃从小珠上洗脱结合的PBP1Adel23120分钟。该级分用含0.25MNaCl的A缓冲液和YM30滤膜(Amicon，美国)超滤浓缩。超滤也除去羟胺。含有＞85％的PBP1Adel23蛋白的纯化级分即结合青霉素，也有转糖基酶活性。图5给出纯化的不同阶段不同级分考马斯亮蓝染色图和[125I]头孢环己烯/青霉素结合图。将纯化的蛋白测序确证可溶性PBP1Adel23的N末端氨基酸序列。1.5可溶性PBP1Adel23的转糖基酶活性基本上按Ishino等(1980)描述的方法测量可溶性PBP1Adel23的转糖基酶活性。检测酶活的底物基本上按Heijenoort等(1992)描述的方法制备与纯化。将PBP1Adel23催化的肽聚糖形成量与不同浓度的膜连形式天然PBP1A形成的肽聚糖量相比，测量PBP1Adel23的依赖浓度的转糖基酶活性。如图6所示，突变体可溶性PBP1Adel23的肽聚糖聚合效率与蛋白的膜连形式的酶活几乎相同。从而发现去除第23个氨基酸残基片段并不干扰蛋白采取具有两种酶活即转糖基酶和转肽酶活性的天然结构的能力。实施例22.1构建编码大肠杆菌PBP1B可溶形式的基因。编码PBP1B的ponB基因得自质粒pBS96，该质粒得自B.S.Spratt教授，微生物遗传学小组，生物科学学院，Sussex大学，Brighton，英国。pBS96的构建，野生型ponB基因的核苷酸序列以及导出的氨基酸序列由Broome-Smith等(1985)描述。图7给出用Kyte和Doolittle(1982)给出的方法推导的N末端约150个氨基酸的疏水图。分析疏水图可知PBP1B序列65至87位的氨基酸对N末端疏水性贡献很大，可假定为蛋白质的膜锚定结构域。另外Edelman等(1987)的β-内酰胺酶研究显示C末端氨基酸到87位氨基酸在大肠杆菌细胞的周质中，PBP1B的N末端氨基酸到65位在细胞质中。图8给出构建编码PBP1B可溶形式的突变体ponB基因所采取的策略。首先从pBS96质粒(Broome-Smith等，1985)的ponB基因PCR扩增ponB基因5′端约200bp的DNA片段。所用的寡聚核苷酸引物5′引物是TG-77(5′-GAAAAACCATGGCCGGGAATGACC-3′)，它包括NcoI限制酶位点，该位点与序列的起始ATG密码子重合，3′引物是TG-84(5′-AAGTCGCGAGCCGCGTTTGCCAC-3′)，它包括限制酶NruI位点并编码对应PBP1B序列64位的氨基酸。第1步PCR扩增片段用限制酶NcoI和NruI酶切后克隆进克隆载体pBR329(Covarrubias等，1982)的NcoI-NruI位点。用标准方法连接，转化和筛选，得到带有所期望的结构的重组质粒，命名为pARC0574(图8)。用对应氨基酸87至480的引物序列PCR扩增约1.2kb的另一DNA片段。该DNA片段编码PBP1B的TG结构域的C末端半区部分。5′引物是TG-79(5′-CGGATATCGATCAAAAAATTCGTAGCCG-3′)，它包括限制酶EcoRV酶切位点的核苷酸序列，3′引物是TG-80(5′-GCGGATCCTTAGTCGACGACCACAATCGCAG-3′)，它含有BamHI酶切序列。第2步以pBS96(Broome-Smith等，1985)DNA上的ponB基因作模板PCR扩增该片段。扩增的片段用标准方法克隆至pBR329(Covarrubias等，1982)的EcoRV-BamHI位点中。得到的重组质粒称为pARC0534(图8)。第3步克隆进pARC0547的200bpNcoI-NruI片段切成NcoI-NruI片段，再克隆进NcoI-EcoRV切割的pARC0534中，得到pARC0551(图8)。pARC0551上突变体ponB基因上编码PBP1BN末端64个氨基酸的DNA序列融合到编码88-480氨基酸的核苷酸序列上。然后将pBS96的1.3kbPstI-BamHIDNA片段连接到PstI-BamHI切割的pARC0551中。连接混合液用标准方法转化大肠杆菌DH5α。筛选各个转化体，鉴定到携载具有期望的结构的重组质粒的菌落。该质粒称为pARC0552。然后切下pARC0552中含有整个突变体ponB基因的NcoI-BamHI片段，连接到T7表达载体pARC038中，得到pARC0559(NCIMB40667，图9)。第1步的克隆片段的3′端有核苷酸序列TCG(部分的NruI位点序列)，而第2步克隆的片段的5′端有序列ATC(部分的EcoRV切割序列)。TCG和ATC融合得到的接合(junction)核苷酸序列引入了丝氨酸和异亮氨酸的密码子。因此突变体ponB基因编码的PBP1B的氨基酸序列1至64对应野生型PBP1B，并连接到序列87-844上。两段通过丝氨酸和异亮氨酸连接。SEQIDNO3给出突变体ponB基因的核苷酸序列，其推出的氨基酸由SEQIDNO4给出。2.2可溶性PBP1B的表达将pARC0559的质粒DNA转化入T7表达宿主大肠杆菌BL26(DE3)中，用标准方法确证转化的质粒的限制酶图谱。大肠杆菌BL26(DE3)/pARC0559于22℃生长并用0.01mMIPTG诱导，细胞生长6小时。然后收获细胞，通过弗氏压碎机破碎。裂解物10,000rpm离心10分钟，得到的上清再用Beckman超离心机于200,000×g离心45分钟。2.3确定表达的可溶性PBP1B的性质对得到的上清，即胞液/可溶级分，用[125I]氨苄青霉素作放射性配体检查突变体PBP1B是否存在。根据Rojo等(1984)对制备[125I]头孢环己烯的描述制备[125I]氨苄青霉素。在可溶级分检测到突变体PBP1B，它结合放射性的氨苄青霉素。也可用与1.4节描述方法类似的方法用氨苄青霉素-affigel小珠纯化可溶性PBP1B。图10给出不同部分考马斯亮蓝染色蛋白图和富集的PBP1B部分与[125I]氨苄青霉素的结合。纯化的蛋白在肽聚糖转糖基酶试验(Heijenoort等，1992)中有酶活，其结合青霉素的亲和力与膜连天然PBP1B相近。实施例33.1构建编码肺炎链球菌PBP1A可溶形式的基因肺炎链球菌PBP1A的分子结构预计与大肠杆菌PBP1A和PBP1B蛋白的类似，因为该蛋白通过N末端膜锚定序列锚定于膜上。编码天然膜连肺炎链球菌PBP1A的基因的核苷酸序列及其推出的氨基酸序列由Martin等(1992)描述。图11给出由Kyte和Doolittle法推出的N末端100个氨基酸的疏水性图。一段38个氨基酸的片段对该区域的疏水性贡献很大，假定为与膜作用的结构域。去除编码肺炎链球菌PBP1AN末端38个氨基酸的核苷酸序列构建肺炎链球菌PBP1A的突变体基因。用根据Martin等(1992)报道的序列设计的引物以标准PCR方法从肺炎链球菌PM1菌株(得自S.A.Lacks，生物系，Brookhaven国立实验室，Upton，纽约，美国)(Lacks，1968)的染色体扩增出2.5kb编码肺炎链球菌PBP1A的DNA片段，并将扩增的片段克隆进肺炎链球菌载体pLS101(Balganesh和Lacks，1984)。用携载野生型基因的质粒DNA作模板构建编码肺炎链球菌PBP1A可溶形式的突变体基因并根据标准方法PCR扩增2.3kb的DNA片段。所用的引物序列是5′引物TG-24(5′-TACGTTACCATGGCTCCTAGCCTATCC-3′)和3′引物TG-25(5′-GACAGGATCCTGAGATGTCTTCTCA-3′)。5′引物TG-24含有限制性酶NcoI识别的序列而3′引物TG-25包括限制酶BamHI位点。PCR扩增的DNA片段用NcoI和BamHI消化后，连接到NcoI-BamHI切割的pARC039中，质粒pARC039是pET8c的衍生物(Studier等，1990)，其中编码β-内酰胺酶的基因被卡那霉素抗性盒取代。用标准方法连接和筛选后，作详细的限制性酶切图谱确认重组质粒的结构并转化入T7表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中(Studier等，1990)。重组质粒称为pARC0512(NCIMB40665)，图示见图12。SEQIDNO5给出突变体肺炎链球菌PBP1A基因的核苷酸序列，由其推出的氨基酸序列由SEQIDNO6给出。3.2表达肺炎链球菌PBP1A的可溶形式并确定其性质。用与1.2节描述类似的方法表达编码肺炎链球菌PBP1A的基因。分离大肠杆菌BL21(DE3)/pARC0512的胞液级分并检查肺炎链球菌PBP1Adel38可溶形式的存在。用于结合试验的放射性配体是[3H]苯甲基青霉素(Amersham)，制备如前述。当培养物于22℃生长用0.01mMIPTG诱导时突变体基因表达的蛋白约50％位于可溶级分，结合[125I]青霉素(Rojo等，1984)或[3H]青霉素(Amersham)。生长和诱导条件对有效回收可溶蛋白至关重要，高温生长或高浓度IPTG诱导使大部分蛋白失活并形成包涵体。诱导后6-8小时发现最优水平的可溶活性蛋白质(图13)。也可基本上用纯化可溶大肠杆菌PBP1B蛋白的方法有效纯化可溶肺炎链球菌PBP1Adel38蛋白。可溶PBP1Adel38结合青霉素的效率与天然膜连肺炎链球菌PBP1A的效率相近。实施例44.1转糖基酶缺陷的大肠杆菌PBP1B选择区域2(图14)中的保守氨基酸作定点诱变。在10个氨基酸的这一段序列中构建了三种不同的突变(a)PBP1B序列270和271位的谷酰胺变成丙氨酸；(b)PBP1B序列270和271位的谷酰胺变成亮氨酸；(c)编码264至271位氨基酸的核苷酸序列缺失。基本按照Kunkel等(1985)的方法构建ponB基因突变体。切除pBS96的ponB基因的1.5kbEcoRI-SalI片段并按标准方法克隆进EcoRI-SalI切割的M13mp19中。(a)将编码谷酰胺残基270和271的核苷酸序列突变成编码丙氨酸残基的序列所用引物是TG-215′-ACGCTGACGGCCGCTCTGGTGAAA-3′TLTAALVK(b)将编码谷酰胺残基270和271的序列突变成编码亮氨酸残基的序列所用引物是TG-235′-ACGCTGACGCTATTGCTGGTGAAA-3′TLTLLLVK(c)去除全部位于保守区域2的编码264至271位氨基酸的核苷酸所用的引物是TG-225′-CGCACGGTACAGCTGGTGAAAAAC-3′RTVQLVK260261262263272273274(氨基酸序号)诱变后用Sanger等(1977)的方法确定突变的EcoRI-SalI片段的核苷酸序列。测序确认核苷酸变化也排除无关的变化。用标准方法将这段突变的1.5kbDNA片段连接回EcoRI-SalI切割的pBS96中，连接的DNA转化入大肠杆菌DH5α细胞。对卡那霉素抗性转化体分析其质粒组成，携带TG-21突变(a)的质粒称为pARC0438(NCIMB40661)。突变的蛋白称为PBP1BQQ-AA(SEQIDNO7)。将TG-23引入突变(b)的质粒称为pARC0468(NCIMB40662)。突变体蛋白称为PBP1BQQ-LL(SEQIDNO8)。用TG-22得到缺失(c)的质粒称为pARC0469(NCIMB40663)。突变体蛋白称为PBP1Bdel8(SEQIDNO9)。将pBS96，pARC0438，pARC0468和pARC0469四种质粒DNA分别转化入大肠杆菌ponBspcr细胞(Broome-Smith等；1985)中，其中缺失的ponB基因用壮观霉素抗性标记物标记。生长具有pBS96，pARC0438或pARC0468各质粒的大肠杆菌ponBspcr细胞，用Spratt(1977)描述的方法制备膜制备物，用放射性青霉素标记后在8％SDS-PAGE上分析青霉素结合蛋白分布。首先用对纯化的膜连天然PBP1B(图15)制得的抗PBP1B血清分析突变体蛋白的体内稳定性与膜定位。发现突变体蛋白定位于膜上，未检测到与抗体反应的蛋白质降解片段说明无大的不稳定性。另外突变体蛋白结合青霉素的亲和性与野生型PBP1B的相近(图15)。如Heijenoort等(1978)的描述检测转糖基酶活性，在表达突变体蛋白质的膜上未检测到活性，而带有野生型PBP1B的膜有转糖基酶活性。这说明263至271氨基酸对转糖基酶活性至关重要。突变体蛋白结合青霉素的亲和性与野生型的相近，表明突变体蛋白的转肽酶活性可能也与野生型的相近。已知质粒表达的双功能蛋白PBP1B可以反式补偿ponA和ponB缺失(Yousif等，1985)，因而检查了转糖基酶阴性/转肽酶阳性蛋白PBP1BQQ-AA和PBP1Bdel8补偿编码PBP1A和1B的染色体缺失的能力。将野生型ponB和突变体ponB基因克隆进低拷贝数载体pMAK705(Hamilton等；1989)中。得到的质粒称为pARC0462(野生型ponB，图16)，pARC0463(ponBdel8，图17)和pARC0470(ponBQQ-AA，图18)。质粒分别转化大肠杆菌delponA(ponA基因缺失的大肠杆菌)。大肠杆菌delponA/pARC0462，大肠杆菌delponA/pARC0463和大肠杆菌delponA/pARC0470用作P1噬菌体的受体以转导ponBspcr标记物。如Miller(1972)的描述进行转导。在大肠杆菌ponBspcr菌株(Yousif等，1985)上制备噬菌体P1裂解物。转染后，转染的细胞在壮观霉素上铺平板。将含有ponBspcr的DNA片段转导入任一受体中并整合进受体染色体，使染色体ponB基因失活并使染色体ponA-和ponB-。该基因型对细胞是致死的，只有编码ponB的质粒或ponB突变能行使反式互补功能，大肠杆菌壮观霉素抗性转导体才会存活。下列大肠杆菌菌株接受了噬菌体P1转导反式互补分析(1)大肠杆菌AMA1004，其基因组编码野生型ponA和ponB；(2)大肠杆菌AMA1004，其基因组ponB失活，并且是编码突变体ponB基因的质粒的宿主；(3)大肠杆菌AMA1004，它是编码野生型ponB基因的pARC0462质粒的宿主；(4)大肠杆菌AMA1004，它是编码PBP1Bdel8的pARC0463质粒的宿主；(5)大肠杆菌AMA1004，它是编码PBP1BQQ-AA的pARC0470质粒的宿主。结果(每毫升的Kmr转导体数)(1)E.coliAMA10043.0×104(2)E.coliAMA1004，ponBspcr＜1(3)E.coliAMA1004，ponBspcr(PBP1Bwt)1.1×104(4)E.coliAMA1004，ponBspcr(PBP1Bdel8)＜1(5)E.coliAMA1004，ponBspcr(PBP1BQQ-AA)＜1用相同的P1噬菌体裂解物对内源标记物trp转导得到相近数目的转导体。上述结果显示只有野生型PBP1B才能得到可存活的转导体，ponBQQ-AA或ponBdel8编码的TG-TP+产物不能补偿染色体编码的PBP1A和1B的缺失。不过，由于这些突变体蛋白结合青霉素，因而认为有转肽酶活性，不能够补偿一定是由于缺少转糖基酶活性。这些结果证实PBP1A或1B的转糖基酶活性对大肠杆菌细胞的存活是必不可少的。上述突变说明区域2参与蛋白的转糖基酶活性。由于该段氨基酸在4种高分子量青霉素结合蛋白即大肠杆菌PBP1A，1B，肺炎链球菌PBP1A和流感嗜血菌的94kDa蛋白(图14)中保守，有理由认为对所有利用与大肠杆菌PBP1A和1B利用的底物类似的转糖基酶，该区域均类似地参与其催化或结构。4.2转糖基酶缺陷的大肠杆菌PBP1A选保守区域2作定点诱变，用如下PCR诱变将编码大肠杆菌PBP1A123位和124位的谷酰胺的核苷酸序列变成编码丙氨酸的序列。ponA基因的5′半区扩增成2个片段，5′片段对应氨基酸1至123(片段A)，3′片段对应氨基酸124至434(片段B)。用于扩增片段A的5′引物是TG-93(5′-GCGCGGACCATGGTGAAGTTCGTAAAGTAT-3′)，3′引物是TG-106(5′-CAGTGCTGCAGTAATGGTACTTGCCCCTTG-3′)。扩增片段A的3′引物包括限制酶PstI识别的序列，使编码123和124位谷酰胺残基的序列变成编码丙氨酸残基的序列。扩增片段B的5′引物是TG-107(5′-ATTACTGCAGCACTGGCGAGAAACTTCTTC-3′)，3′引物是TG-108(5′-TCGCGAGATATCTGGCGGATTGATCGACAC-3′)扩增片段B的5′引物包括限制酶PstI的识别序列，并与扩增片段A的3′引物的限制酶PstI识别序列相重迭。片段A3′端与片段B5′端连接形成PstI位点，并使编码谷酰胺123和124的核苷酸序列变成编码丙氨酸123和124的序列。扩增的片段A和B分别克隆进pBR329中，得到相应的克隆pARC0565和pARC0566。将得自pARC0565和pARC0566的片段A和B连接得到pARC0567。将pARC0489(与pARC0558(图3)相同，只是还有Lacl和Lac操纵子序列)的XhoI-BamHI片段引入pARC0567使ponA序列完全得到pARC0568。然后用pARC0568包括Q123-Q124至A123-A124突变区域的MluI-BglII片段替换pBS98中除突变外完全相同的MluI-BglII片段，得到pARC0571质粒(图19；NCIMB40668)，突变体蛋白称为PBP1AQQ-AA(SEQIDNO10)。突变体表达研究显示突变体蛋白定位于膜上(用抗PBP1A抗体检测)，其结合青霉素的亲和性与天然PBP1A的相近。做与前节描述类似的体内补偿实验以验证突变体PBP1A蛋白反式补偿的能力。用噬菌体P1转导和将ponBspcr转导入携载编码突变体蛋白PBP1AQQ-AA的质粒的宿主大肠杆菌(受体)delponA中进行体内补偿。为了进行互补分析，将野生型ponA基因克隆进低拷贝数载体PMAK705(Hamilton等，1989)中得到pARC0583，将编码PBP1AQQ-AA的突变体ponA基因克隆进pMAK705得到pARC0582.下列大肠杆菌菌株接受噬菌体P1转导反式补偿分析(1)大肠杆菌AMA1004，其基因组编码ponA和ponB；(2)大肠杆菌AMA1004，其基因组中ponA失活，并且是编码突变体ponA基因的质粒的宿主；(3)携载编码野生型ponA基因的pARC0538质粒的宿主；(4)携载编码PBP1AQQ-AA的pARC0582质粒的宿主。结果(每毫升的Spcr转导体数)(1)E.coliAMA10042.1×103(2)E.coliAMA1004，ponA＜1(3)E.coliAMA1004，ponA(PBP1Awt)1.64×103(4)E.coliAMA1004，ponA(PBP1BQQ-AA)＜1用相同的P1噬菌体裂解物对内源标记物trp转导得到相近数目的转导体。如上所示用大肠杆菌delponA/pARC0582作受体得不到存活的转导体，显示突变体PBP1AQQ-AA不能补偿染色体编码的PBP1A/1B的缺失。这表明PBP1A区域2的Q123和Q124也影响蛋白的转糖基酶活性，因为互补功能丧失一定反映了转糖基酶活性的丧失。检验蛋白结合青霉素的亲和性得知其转肽酶活性不受影响。这些结果支持区域2是参与转糖基酶功能的至关重要的一段氨基酸。这可以解释这段氨基酸的强进化保守性。实施例55.1截短的大肠杆菌PBP1B用5′引物TG-77(5′-GAAAAACCATGGCCGGGAATGACC-3′)和3′引物TG-116(5′-ATGGGATCCTTAATCATTCTGCGGTGA-3′)PRC扩增构建编码含N末端553个氨基的截短PBP1B的突变体基因。引物5′端对应野生型的氨基酸553，后面跟着终止密码子和限制酶BamHI位点。用pBS96DNA作模板扩增到1.7kb的片段。PCR扩增片段用PstI和BamHI切割后克隆进PstI-BamHI限制酶切的pARC0555(pARC0555含有NcoI-BamHI片段克隆进表达载体pET11d得到的全长ponB基因。NcoI位点包含起始密码子ATG)得到pARC0592(NCIMB40669；图21)。表达的蛋白(SEQIDNO11)有转糖基酶活性，因而证实该结构域结构上独立。用pARC0592的PstI-BamHI片段替换pARC0559的PstI-BamHI片段(图9)得到pARC0593(NCIMB40670，图22)，构建到可溶截短PBP1B，即具有N末端553个氨基酸但缺乏65-87的膜锚定疏水结构域的PBP1B。突变体ponB基因编码PBP1B可溶形式，表达的蛋白(SEQIDNO12)具有转糖基酶活性。5.2截短大肠杆菌PBP1B的最小底物结合结构域对假定的PBP1B的TG结构域(氨基酸1-553)结构进行详细的计算机分析表明氨基酸210-368似乎足以结合脂联底物和进行转糖基酶反应。这段氨基酸包括3个保守的结构域区域I，II和III。编码截短蛋白段210-368的突变体如下构建。用5′引物TG-154(5′-CAATCCATGGGTGAGCAGCGTCTGTTTG-3′)，其中起始ATG密码子后面紧接着编码PBP1B的第210个氨基酸的序列，以pBS96为底物扩增出约480bp的片段。3′引物对应序列TG-155(5′-TCCAGAATTCCAGTTTTGGGTTACG-3′)，其中编码PBP1B的368氨基酸的序列后面紧跟着有EcoRI限制位点的核苷酸序列，使得与编码肠激酶位点和一段组氨酸的序列融合，可在Ni亲和柱上快速纯化蛋白(参阅下面6.2节)。将NcoI-EcoRI片段克隆进NcoI-EcoRI限制酶切的pARC0400质粒中得到重组质粒pARC0392(NCIMB40659，图23)。重组质粒转化入大肠杆菌BL26(DE3)中，用IPTG诱导后基本上在可溶级分检测到约17kDa的蛋白。用相似的思路可预计PBP1A的最小底物结合区域涉及野生型蛋白的62-220段。该蛋白与一段组氨酸融合起来生成，可以用Ni2+柱将表达的产物高效亲和纯化。预计结果将与截短的PBP1B相似。实施例66.1可溶大肠杆菌PBP1A与谷胱甘肽-S-转运酶N末端融合如下节描述将ponAdel23基因5′端在框融合到编码谷胱甘肽-S-转运酶的序列上。选来构建融合基因的载体是pGEX-3X，购自PharmaciaBiochemicals。为了将ponAdel23的5′起始ATG在框融合到编码谷胱甘肽-S-转运酶的基因上，用包括限制酶EcoRI位点的序列的PCR引物引入一个BamHI位点。用的5′引物是TG-1155′-TCGAGGATCCCCATGGGCCTATACCGCTACATCG-3′＝=========EcoRIBamHI用的3′引物是TG-106，描述见于4.2节。PCR扩增的DNA片段A用BamHI和PstI消化后克隆进标准克隆载体pUC8的BamHI-PstI位点中得到pARC0496。该片段A包括PBP1Adel23蛋白的N末端102个氨基酸。一段得自片段A的BamHI-MluI(位点在片段A中)270bp片段，一段得自pARC0490(pARC0490具有克隆进低拷贝数载体pWKS29(FuWang等，1991)的XbaI-BamHI位点的野生型ponA基因其余部分，帮助ponAdel23基因3′端切成EcoRI片段)的包括ponA基因其余部分的2.2kbMluI-EcoRI片段和EcoRI-BamHI切割的pGEX-3X连接到一起，转化感受态大肠杆菌细胞。对各个转化体筛选重组质粒，含有预期结构的质粒称为pARC0499(NCIMB40664；图24)。pARC0499编码的融合产物C末端是谷胱甘肽-S-转移酶序列，通过Xa因子切割识别序列连到PBP1Adel23序列上。1mMIPTG诱导后，发现预期大小的融合蛋白被诱导。该蛋白结合青霉素，在转糖基酶试验中有活性，将悬浊液通过弗氏压碎机破碎细胞后，如1.4节所述制备无细胞上清部分纯化PBP1Adel23。上清部分通过谷胱甘肽Sepharose基质(PharmaciaBiochemicals)用谷胱甘肽洗脱结合的GST-PBP1Adel23。洗脱的蛋白80％均质。透析除去游离的谷胱甘肽，用Xa因子切割GST-PBP1Adel23。纯化的PBP1Adel23在青霉素结合和转糖基酶反应中均有活性。6.2可溶大肠杆菌PBP1A与组氨酸序列C末端融合如下描述将ponAdel23基因3′端在框融合编码一段6个组氨酸的序列上。第一步，用pBS98DNA作模板，5′引物TG-115(5′-TCGAGGATCCCCATGGGCCTATACCGCTACATCG-3′)和3′引物TTG-121(5′-GTTAGAATTCGAACAATTCCTGTG-3′)扩增ponAdel23基因。3′引物在ponAdel23基因3′端引入EcoRI位点并去除翻译终止密码子。PCR扩增的修饰ponAdel23基因片段用PstI和EcoRI消化释放出930bp5′端片段并连入PstI-EcoRI消化的pBR329中得到重组质粒pARC0467。下一步合成带有编码6个组氨酸的序列和编码含肽激酶位点的氨基酸的序列的双链合成寡聚核苷酸，连接到pARC0467上ponAdel23基因3′端刚产生的EcoRI位点上。所用的合成性寡聚核苷酸是TG122EcoRI-----5′-AATTCGACGACGACGACAAGCACCACCACCACCACCACTGATAAG-3′-------------------＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝肠激酶组氨酸和TG123(5′-GATCCTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGTCGTCG-3′)。质粒pARC0467用EcoRI线性化，连接合成性双链寡聚核苷酸。连接后从连接混合物中释放出一段PstI-BamHI(片段A)，并克隆进pARC0558(图3)的PstI-BamHI位点，得到pARC0400(NCIMB40660；图25)。突变体ponAdel23融合基因因此编码PBP1Adel23序列C末端融合氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys再融合His-His-His-His-His-His的蛋白。Asp-Asp-Asp-Asp-Ly序列被蛋白水解酶肠激酶识别，并在赖氨酸残基后切割。6个组氨酸残基使蛋白质能结合金属镍。重组质粒pARC0400转化入大肠杆菌BL26(DE3)细胞中，用与纯化PBP1Adel23时相同的培养和温度条件下诱导。细胞通过弗氏压碎机破碎。裂解物10,000pm离心10分钟。低速离心得到的上清再于200,000×g离心45分钟，得到的上清代表胞液级分。该级分包含融合基因编码的蛋白，该重组融合蛋白称为PBP1Adel23EH、PBP1Adel23EH蛋白结合[125I]头孢环己烯，在转糖基酶试验中有活性。可溶级分通过Ni亲和柱，基本按照QIAGENInc.，9259Eton大街，Chateworth，加州91311美国的“TheQiaExpressionist”方法用浓度递增的咪唑分批洗脱结合的蛋白。用250mM咪唑洗脱大部分PBP1Adel23EH蛋白，蛋白约85％同质。从柱上只能洗脱结合头孢环己烯的蛋白。因此可方便地利用融合蛋白结合Ni柱的能力有效纯化和将活性蛋白固定化。实施例77.1细胞提取物在酶试验和筛选中的应用对据实施例6制取的粗细胞提取物，可根据与按Hackenbeck(1983)制备的[3H]氨苄青霉素反应分析其结合青霉素的能力。为了改进方法用于大规模筛选，用96孔微量滴定板盛载反应物，用BeckmanBiomek机器人进行试验。粗细胞提取物与[3H]氨苄青霉素于37℃混合15分钟。用TCA沉淀反应体系的蛋白质，收集到玻璃滤膜上，洗去未结合的氨苄青霉素，用闪烁计数仪对滤膜计数。或用放射自显影检测氨苄青霉素的结合程度。根据上法可用竞争性试验估计受试化合物结合PBP变异体转肽酶位点的能力。该试验中在加入氨苄青霉素前让受试化合物接触粗细胞提取物15分钟。玻璃滤膜上的放射性量减少则表明是阳性结果。7.2可溶固定化蛋白在筛选中的应用如上述纯化的含组氨酸肽的蛋白质可用于筛选抑制转肽酶活性或转糖基酶活性的化合物。纯化的全长或截短蛋白固定化到偶合了Ni(II)的琼脂糖凝胶上。含有固定化蛋白的小珠等分试样被转移到微量滴定板的小孔中，受试化合物加入板中温育，然后洗去未结合的受试化合物。将[3H]氨苄青霉素加入反应容器中，基本按上述进行反应可检测到结合双功能蛋白的转肽酶位点的化合物。或可用结合转肽酶区域的单克隆抗体。在竞争性试验中用结合蛋白转糖基酶区域的单克隆抗体可估计能结合转糖基酶位点的化合物。实施例88.1生产PBP1A的单克隆抗体基本按《抗体实验手册》(HarlowDavidLane编，冷泉港，美国)所述制备单克隆抗体(mAb)。纯化膜连PBP1A用作免疫原。用50μg纯化的天然PBP1A和弗氏完全佐剂免疫6-8周龄的Balb-C小鼠。腹腔内激发注射(booster)20μgPBP1A和不完全弗氏佐剂。两周后用PBP1A作包被抗原ELISA验证血清抗体的存在。有循环抗体的小鼠用20μgPBP1A和盐水每日腹腔内注射免疫共4天，宰杀小鼠分离脾细胞供融合用。融合实验用的骨髓瘤细胞系是Sp2/0-Ag14，这些细胞与免疫小鼠的脾细胞以10∶1的比例融合。用标准方法进行融合，当细胞＞90％汇合时用ELISA对PBP1A监测克隆是否生产抗体。72个生产量多的克隆分到24孔中，用下列筛选对分泌的抗体定性；(1)ELISA对PBP1A膜连形式；(2)ELISA对PBP1Adel23可溶形式；(3)对膜连PBP1A作点印迹分析，去除单克隆抗体仅因为去污剂增溶的纯化PBP1A蛋白纯化时构象变化而与之反应的情况；(4)ELISA对PBP1B膜连形式。根据这些筛选，选出一组5个分泌抗体的克隆，亚克隆两次以保证单克隆性。用标准方法制取这些杂交瘤克隆的腹水，根据蛋白质G-Sepharose(PharmaciaBiochemicals)生产商的推荐用蛋白质G-Sepharose亲和层析从腹水中纯化IgG。ELISA，点印迹和Western印迹中这些纯化的抗体与PBP1A膜连与可溶形式均特异性反应。用每孔3个细胞的克隆方法得到克隆。为保证单克隆性，这些克隆限制稀释成每孔1个细胞亚克隆到96孔微量滴定板上。显微镜下确证每孔得到一个细胞，然后用巨噬细胞给料层使之生长得到单个杂交细胞的后代。亚克隆后用全长PBP1AELISA检测PBP1A的mAb有分泌。最后对每个母体杂交瘤选择2个克隆，其中之一在初始激发(primed)的Balb/c小鼠的腹水中扩展开。所有5个克隆均适应于腹腔生长，生产腹水mAb。腹水mAb用纯化PBP1AELISA测定效价，所有的腹水mAbELISA效价均大于5×105，在Western印迹中识别全长蛋白。用蛋白质G亲和柱纯化腹水mAb。使用购自Sigmachemicals(美国)的试剂盒用小鼠Ig同型体(isotype)ELISA确定mAb的免疫球蛋白同型体。4个单克隆属于IgG1，1个属于IgG2a免疫球蛋白同型体。用全长膜连PBP1A/1Bwestern印迹进一步确定mAb性质，另外用PBP1A膜连N末端，PBP1BN末端和PBP1BC末端的不同截短形式Western印迹确定mAb的转糖基酶(TG)和转肽酶(TP)活性。表达全长和截短膜连PBP，制备到的膜部分在SDS-PAGE上分离。蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用多克隆大肠杆菌PBP1A抗体和单克隆抗体作western印迹分析。基本按denBlaauwen等(1990)的描述确定mAb的青霉素结合抑制能力。蛋白质-G亲和纯化的mAb与PBP1A预温育后，加入[3H]苄基青霉素或[125I]头孢环己烯，两个mAb竞争性抑制放射性标记的青霉素与PBP1A的结合。通过筛选原始杂交瘤克隆分泌的抗体，western印迹与代表PBP1AN末端434个氨基酸的蛋白反应，得到对PBP1A的TG结构域特异性的单克隆抗体。TG-2克隆的抗体与PBP1AN末端截短的434氨基酸类似物反应但抑制PBP1A的转糖基酶活性(＞80％抑制)。这说明抗体识别的蛋白质序列涉及(a)底物结合；(b)催化酶促反应或(c)别构地改变蛋白的构象。无论哪种可能性，鉴定到与TG-2和PBP1A结合竞争的化合物，就鉴定到与PBP1A上相同序列相互作用的分子。因此竞争性结合试验可用作筛选试验，鉴定TG抑制性化合物。附图简述图1大肠杆菌PBP1A的疏水性图。该图显示PBP1AN末端55个氨基酸疏水性模式的扩展形式。图2T7翻译融合表达载体pARC038的图示——载体序列＝＝＝赋予卡那霉素抗性的基因Kmr，编码乳糖抑制子的基因(lacIq)，复制原点(ori)，T7乳糖操纵子启动子，T7噬菌体终止子。不同基因的转录方向由箭头标出。标出了相关的限制酶位点。限制位点旁的数字代表核苷酸位置，以上面12点钟位置的核苷酸位置为0。图3编码大肠杆菌可溶PBP1Adel23的pARC0558载体的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1Adel23的突变体基因，卡那霉素抗性Kmr，乳糖抑制子(lacIq)和复制原点ori。图4可溶性PBP1Adel23的表达。A版代表携载pARC0558的大肠杆菌BL26(DE3)的未诱导和诱导的培养物[125I]头孢环己烯结合的放射自显影图。B版代表相同的未诱导和诱导的细胞考马斯亮蓝染色蛋白图。泳道(1)未诱导的胞液级分；泳道(2)未诱导的膜部分；泳道(3)诱导的胞液级分；泳道(4)诱导的膜级分，泳道(M)分子量标记。图5纯化的PBP1Adel23的SDS-PAGE图样。A版考马斯蓝染色。B版[125I]头孢环己烯结合蛋白图。泳道(1)大肠杆菌BL26(CD3)/pARCO0558胞液级分(200,000g上清)；泳道(2)30％硫酸铵上清级分；泳道(3)30％硫酸铵沉淀级分；泳道(4)头孢环己烯Affigel通过级分，泳道(5)分子量标记；泳道(6-8)头孢环己烯affigel洗脱级分。图6野生型PBP1A和突变体PBP1Adel23纯化蛋白的转糖基酶活性图。(▲-▲)代表可溶PBP1Adel23的活性；(●-●)代表用辛烷基-β-葡糖苷增溶的膜连PBP1A的活性。X轴代表蛋白浓度，用的是μg级。Y轴代表形成的肽聚糖量。图7大肠杆菌PBP1B的疏水性图。该图是大肠杆菌PBP1BN末端150个氨基酸的扩展疏水性图。图8克隆大肠杆菌PBP1B可溶转糖基酶结构域的图示。——载体序列＝＝＝编码ponB基因片段和β-内酰胺酶的序列将编码PBP1BN末端64个氨基酸的NcoI-NruI片段克隆进pARC0534的NcoI-EcoRV位点中得到pARC0551质粒。该重组质粒携载编码PBP1B的氨基酸1至480并且内部缺失氨基酸65至87的基因。图9编码可溶性PBP1B的pARC0559的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1B可溶形式(solPBP1B)的突变体ponB基因，乳糖抑制子(lacIq)，卡那霉素抗性(Kmr)，和复制原点(ori)等序列。箭头代表基因的转录方向。图10可溶性PBP1B的纯化。A版不同级分的SDS-PAGE和考马斯蓝染色。B版相同级分的[125I]氨苄青霉素结合图。泳道(1)和(2)大肠杆菌BL26(DE3)/pARC0559诱导细胞的胞液级分；泳道(3)氨苄青霉素-Affigel柱通过的级分；泳道(4)分子量标记；泳道(5)和(6)氨苄青霉素-Affigel柱的洗脱级分。图11肺炎链球菌PBP1A的疏水性图。该图是肺炎链球菌PBP1AN末端100个氨基酸的扩展疏水性图。图12编码肺炎链球菌PBP1A可溶形式的pARC0512质粒的图示。——载体序列＝＝＝编码可溶性肺炎链球菌PBP1A(sPBP1A)的基因，卡那霉素抗性Kmr和复制原点(ori)等序列。图13可溶性肺炎链球菌PBP1A的青霉素结合图。宿主大肠杆菌BL21(DE3)/pARC0512。A版考马斯蓝染色。B版体内用[3H]苯甲基青霉素标记后做SDS-PAGE。泳道(1)和(2)于22℃分别诱导了2小时和22小时的细胞的胞液级分；泳道(3)于30℃诱导了2小时的细胞的胞液级分；泳道(4)于37℃诱导了2小时的细胞的胞液级分；泳道(5)分子量标记。图14高分子量青霉素结合蛋白转糖基酶结构域保守区域的氨基酸排列。该图比较了E.1A(大肠杆菌PBP1B)，E.1B(大肠杆菌PBP1B)，S.1A(肺炎链球菌PBP1A)和H.inf(流感嗜血菌PBP1A)的区域1，2，和3的保守残基。(*)表示相同的氨基酸残基。图15对携载具有编码突变体PBP1B的基因的质粒的大肠杆菌细胞膜蛋白的分析。A版[3H]苯甲基青霉素结合图。B版用抗PBP1B血清作western印迹。泳道(1)分子量标记；泳道(2)大肠杆菌JM101/pBS96细胞的膜级分；泳道(3)大肠杆菌900521ponBSpcr细胞(该宿主缺少染色体编码的PBP1B)的膜级分；泳道(4)大肠杆菌900521ponBspc/pARC0438细胞的膜级分；泳道(5)大肠杆菌900521ponBspc/pARC0469的膜级分；泳道(6)大肠杆菌900521ponBspc/pARC0468的膜级分。图16编码野生型PBP1B的pARC0462质粒的图示——载体序列＝＝＝ponB基因，复制原点(ori)，氯霉素乙酰基转移酶(cmr)和lacZ多重克隆位点部分的序列。图17编码突变体ponB基因的pARC0463质粒的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1Bdel8氨基酸的突变体ponB基因，复制原点(ori)，氯霉素乙酰基转移酶(cmr)和lacZ多重克隆位点部分的序列。图18编码突变体ponB基因的pARC0470质粒的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1BQ271-272-A271-272的突变体ponB基因复制原点(ori)，氯霉素乙酰基转移酶(cmr)和lacZ多重克隆位点等序列。图19携载突变体ponA基因的pARC0571质粒图示——载体序列＝＝＝突变体ponA基因(PBP1AQQ-AA)，卡那霉素抗性(Kmr)，复制原点(ori)等序列。图20野生型和突变体大肠杆菌PBP1A的[125I]青霉素结合蛋白图。泳道(1)大肠杆菌AMA1004ponBspcr/pBS98(野生型ponA)；泳道(2)大肠杆菌BL21(DE3)ponBspcr/pARC0570(野生型ponA)；泳道(3)大肠杆菌AMA1004delponA/pARC0571(QQ-AAponA)；泳道(4)大肠杆菌AMA1004delponA/pBS98(野生型ponA)；泳道(5)分子量标记。图21质粒pARC0592的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1BN末端553个氨基酸的截短ponB基因(hinge1B)，卡那霉素抗性(Kmr)和复制原点(ori)等序列。图22质粒pARC0593的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1B截短的N末端553个氨基酸的可溶形式的截短ponB基因(可溶hinge1B)，卡那霉素抗性Kmr和复制原点(ori)等序列。图23质粒pARC0392的图示——载体序列＝＝＝编码PBP1B蛋白的截短片段，即氨基酸210-368序列3′端在框融合编码肠激酶位点的序列，后面是一段6个组氨酸的突变体基因，卡那霉素抗性Kmr和复制原点(ori)等序列。图24质粒pARC0499的图示——载体序列＝＝＝突变体ponAdel23基因5′端在框融合编码谷胱甘肽-S-转移酶的序列，β-内酰胺酶ampr和复制原点(ori)等序列。图25质粒pARC0400的图示——载体序列＝＝＝突变体ponAdel23序列3′端在框融合编码肠激酶位点后面跟着一段6个组氨酸的序列，卡那霉素抗性Kmr和复制原点(ori)等序列。参考文献Balganesh，T.S.和Lacks，S.(1984)基因29，221-230denBlaauwen，T.等(1990)细菌学杂志172，63-70Broome-Smith，J.K.等(1985)欧洲生化杂志，147，437-446CovarrubiasL.和Bolivar，F.(1982)基因1779-89Edelman，A.等(1987)分子微生物学1，101-106FuWang，R.和Kushner，S.R.(1991)基因100，195-199Hackenbeck等编，青霉素靶点，W.deGruyter出版物柏林/纽约1983Hamilton，C.A.等(1989)细菌学杂志171，4617-4622Heijenoort，Y.van等(1978)FEBS快报89，141-144Heijenoort，Y.van等(1992)细菌学杂志174，3549-3557Ishino，F.等(1980)生化和生物物理研究通报97，287-293Kunkel，T.A.(1985)美国国家科学院院刊82，488-492Kyte和Doolittle(1982)分子生物学杂志157，105-132Lacks，S.A.(1968)遗传学60，685-706Martin，C.等(1992)细菌学杂志174，4517-4523Miller，J.H.编(1972)分子遗传学实验，冷泉港出版Nakagawa，J.S.等(1984)生物化学杂志259，13937-13946Page，W.J.等(1982)细菌学杂志151，237-242Rojo等(1984)抗生素杂志37，389-393Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约Sanger等(1977)美国国家科学院院刊74，5463-5467Spratt，B.S.(1977)欧洲生化杂志72，341-352Studier，F.W.等(1990)酶学方法185，61-89Tomb，F.等(1991)基因104，1-10Yousif，S.Y.等(1985)遗传微生物学杂志131，2839-2845序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名ASTRAAKTIEBOLAG(B)街道Kvarnbergagatan16(C)城市Sodertalje(E)国家Sweden(F)邮编(ZZP)S-15185(G)电话+46-855326000(H)电传+46-855328820(I)电报19237astras(ii)发明名称新的多肽(iii)序列数13(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQIDNO1的资料(i)序列特征(A)长度2487个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体大肠杆菌(B)菌株DH5α(vii)直接来源(A)文库PCR克隆(B)克隆pARC0558SolublePBP1Adel23(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1…2487(ix)特征(A)名称/关键词matpeptide(B)定位1…2484(xi)序列描述SEQIDNO1ATGGGCCTATACCGCTACATCGAGCCACAACTGCCGGATGTGGCGACA48MetGlyLeuTyrArgTyrIleGluProGlnLeuProAspValAlaThr151015TTAAAAGATGTTCGCCTGCAAATTCCGATGCAGATTTACAGCGCCGAT96LeuLysAspValArgLeuGlnIleProMetGlnIleTyrSerAlaAsp202530GGCGAGCTGATTGCTCAATACGGTGAGAAACGTCGTATTCCGGTTACG144GlyGluLeuIleAlaGlnTyrGlyGluLysArgArgIleProValThr354045TTGGATCAAATCCCACCGGAGATGGTGAAAGCCTTTATCGCGACAGAA192LeuAspGlnIleProProGluMetValLysAlaPheIleAlaThrGlu505560GACAGCCGCTTCTACGAGCATCACGGCGTTGACCCGGTGGGGATCTTC240AspSerArgPheTyrGluHisHisGlyValAspProValGlyIlePhe65707580CGTGCAGCAAGCGTGGCGCTGTTCTCCGGTCACGCGTCACAAGGGGCA288ArgAlaAlaSerValAlaLeuPheSerGlyHisAlaSerGlnGlyAla859095AGTACCATTACCCAGCAGCTGGCGAGAAACTTCTTCCTCAGTCCAGAA336SerThrIleThrGlnGlnLeuAlaArgAsnPhePheLeuSerProGlu100105110CGCACGCTGATGCGTAAGATTAAGGAAGTCTTCCTCGCGATTCGCATT384ArgThrLeuMetArgLysIleLysGluValPheLeuAlaIleArgIle115120125GAACAGCTGCTGACGAAAGACGAGATCCTCGAGCTTTATCTGAACAAG432GluGlnLeuLeuThrLysAspGluIleLeuGluLeuTyrLeuAsnLys130135140ATTTACCTTGGTTACCGCGCCTATGGTGTCGGTGCTGCGGCACAAGTC480IleTyrLeuGlyTyrArgAlaTyrGlyValGlyAlaAlaAlaGlnVal145150155160TATTTCGGAAAAACGGTCGACCAACTGACGCTGAACGAAATGGCGGTG528TyrPheGlyLysThrValAspGlnLeuThrLeuAsnGluMetAlaVal165170175ATAGCCGGGCTGCCGAAAGCGCCTTCCACCTTCAACCCGCTCTACTCG576IleAlaGlyLeuProLysAlaProSerThrPheAsnProLeuTyrSer180185190ATGGATCGTGCCGTCGCGCGGCGTAACGTCGTGCTGTCGCGGATGCTG624MetAspArgAlaValAlaArgArgAsnValValLeuSerArgMetLeu195200205GATGAAGGGTATATCACCCAACAACAGTTCGATCAGACACGCACTGAG672AspGluGlyTyrIleThrGlnGlnGlnPheAspGlnThrArgThrGlu210215220GCGATTAACGCTAACTATCACGCGCCGGAGATTGCTTTCTCTGCGCCG720AlaIleAsnAlaAsnTyrHisAlaProGluIleAlaPheSerAlaPro225230235240TACCTGAGCGAAATGGTGCGCCAGGAGATGTATAACCGTTATGGCGAA768TyrLeuSerGluMetValArgGlnGluMetTyrAsnArgTyrGlyGlu245250255AGTGCCTATGAAGACGGTTATCGCATTTACACCACCATCACCCGCAAA816SerAlaTyrGluAspGlyTyrArgIleTyrThrThrIleThrArgLys260265270GTGCAGCAGGCCGCGCAGCAGGCGGTACGTAATAACGTGCTGGACTAC864ValGlnGlnAlaAlaGlnGlnAlaValArgAsnAsnValLeuAspTyr275280285GACATGCGCCACGGCTATCGCGGCCCGGCAAATGTGCTGTGGAAAGTG912AspMetArgHisGlyTyrArgGlyProAlaAsnValLeuTrpLysVal290295300GGCGAGTCGGCGTGGGATAACAACAAGATTACCGATACGCTGAAGGCG960GlyGluSerAlaTrpAspAsnAsnLysIleThrAspThrLeuLysAla305310315320CTGCCAACCTATGGTCCGCTGCTGCCTGCCGCAGTCACCAGCGCCAAT1008LeuProThrTyrGlyProLeuLeuProAlaAlaValThrSerAlaAsn325330335CCTCAGCAAGCGACGGCGATGCTGGCGGACGGGTCGACCGTCGCATTG1056ProGlnGlnAlaThrAlaMetLeuAlaAspGlySerThrValAlaLeu340345350AGTATGGAAGGCGTTCGCTGGGCGCGTCCTTACCGTTCGGATACTCAG1104SerMetGluGlyValArgTrpAlaArgProTyrArgSerAspThrGln355360365CAAGGACCGACGCCGCGTAAAGTGACCGATGTTCTGCAAACGGGTCAG1152GlnGlyProThrProArgLysValThrAspValLeuGlnThrGlyGln370375380CAAATCTGGGTTCGTCAGGTTGGCGATGCATGGTGGCTGGCACAAGTG1200GlnIleTrpValArgGlnValGlyAspAlaTrp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erAlaArgProLeuGlyValGlnProArgGlyGlyValIle385390395400SerProGlnProAlaPheMetGlnLeuValArgGlnGluLeuGlnAla405410415LysLeuGlyAspLysValLysAspLeuSerGlyValLysIlePheThr420425430ThrPheAspSerValAlaGlnAspAlaAlaGluLysAlaAlaValGlu435440445GlyIleProAlaLeuLysLysGlnArgLysLeuSerAspLeuGluThr450455460AlaIleValValValAspArgPheSerGlyGluValArgAlaMetVal465470475480GlyGlySerGluProGlnPheAlaGlyTyrAsnArgAlaMetGlnAla485490495ArgArgSerIleGlySerLeuAlaLysProAlaThrTyrLeuThrAla500505510LeuSerGlnProLysIleTyrArgLeuAsnThrTrpIleAlaAspAla515520525ProIleAlaLeuArgGlnProAsnGlyGlnValTrpSerProGlnAsn530535540AspAspArgArgTyrSerGluSerGlyArgValMetLeuValAspAla545550555560LeuThrArgSerMetAsnValProThrValAsnLeuGlyMetAlaLeu565570575GlyLeuProAlaValThrGluThrTrpIleLysLeuGlyValProLys580585590AspGlnLeuHisProValProAlaMetLeuLeuGlyAlaLeuAsnLeu595600605ThrProIleGluValAlaGlnAlaPheGlnThrIleAlaSerGlyGly610615620AsnArgAlaProLeuSerAlaLeuArgSerValIleAlaGluAspGly625630635640LysValLeuTyrGlnSerPheProGlnAlaGluArgAlaValProAla645650655GlnAlaAlaTyrLeuThrLeuTrpThrMetGlnGlnValValGlnArg660665670GlyThrGlyArgGlnLeuGlyAlaLysTyrProAsnLeuHisLeuAla675680685GlyLysThrGlyThrThrAsnAsnAsnValAspThrTrpPheAlaGly690695700IleAspGlySerThrValThrIleThrTrpValGlyArgAspAsnAsn705710715720GlnProThrLysLeuTyrGlyAlaSerGlyAlaMetSerIleTyrGln725730735ArgTyrLeuAlaAsnGlnThrProThrProLeuAsnLeuValProPro740745750GluAspIleAlaAspMetGlyValAspTyrAspGlyAsnPheValCys755760765SerGlyGlyMetArgIleLeuProValTrpThrSerAspProGlnSer770775780LeuCysGlnGlnSerGluMetGlnGlnGlnProSerGlyAsnProPhe785790795800AspGlnSerSerGlnProGlnGlnGlnProGlnGlnGlnProAlaGln805810815GlnGluGlnLysAspSerAspGlyValAlaGlyTrpIleLysAspMet820825830PheGlySerAsn835(2)SEQIDNO10的资料(i)序列特征(A)长度850个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型peptide(vi)来源(A)生物体大肠杆菌(vii)直接来源(B)克隆pARC0571PBP1AQQAA(xi)序列描述SEQIDNO10MetLysPheValLysTyrPheLeuIleLeuAlaValCysCysIleLeu151015LeuGlyAlaGlySerIleTyrGlyLeuTyrArgTyrIleGluProGln202530LeuProAspValAlaThrLeuLysAspValArgLeuGlnIleProMet354045GlnIleTyrSerAlaAspGlyGluLeuIleAlaGlnTyrGlyGluLys505560ArgArgIleProValThrLeuAspGlnIleProProGluMetValLys65707580AlaPheIleAlaThrGluAspSerArgPheTyrGluHisHisGlyVal859095AspProValGlyIlePheArgAlaAlaSerValAlaLeuPheSerGly100105110HisAlaSerGlnGlyAlaSerThrIleThrAlaAlaLeuAlaArgAsn115120125PhePheLeuSerProGluArgThrLeuMetArgLysIleLysGluVal130135140PheLeuAlaIleArgIleGluGlnLeuLeuThrLysAspGluIleLeu145150155160GluLeuTyrLeuAsnLysIleTyrLeuGlyTyrArgAlaTyrGlyVal165170175GlyAlaAlaAlaGlnValTyrPheGlyLysThrValAspGlnLeuThr180185190LeuAsnGluMetAlaValIleAlaGlyLeuProLysAlaProSerThr195200205PheAsnProLeuTyrSerMetAspArgAlaValAlaArgArgAsnVal210215220ValLeuSerArgMetLeuAspGluGlyTyrIleThrGlnGlnGlnPhe225230235240AspGlnThrArgThrGluAlaIleAsnAlaAsnTyrHisAlaProGlu245250255IleAlaPheSerAlaProTyrLeuSerGluMetValArgGlnGluMet260265270TyrAsnArgTyrGlyGluSerAlaTyrGluAspGlyTyrArgIleTyr275280285ThrThrIleThrArgLysValGlnGlnAlaAlaGlnGlnAlaValArg290295300AsnAsnValLeuAspTyrAspMetArgHisGlyTyrArgGlyProAla305310315320AsnValLeuTrpLysValGlyGluSerAlaTrpAspAsnAsnLysIle325330335ThrAspThrLeuLysAlaLeuProThrTyrGlyProLeuLeuProAla340345350AlaValThrSerAlaAsnProGlnGlnAlaThrAlaMetLeuAlaAsp355360365GlySerThrValAlaLeuSerMetGluGlyValArgTrpAlaArgPro370375380TyrArgSerAspThrGlnGlnGlyProThrProArgLysValThrAsp385390395400ValLeuGlnThrGlyGlnGlnIleTrpValArgGlnValGlyAspAla405410415TrpTrpLeuAlaGlnValProGluValAsnSerAlaLeuValSerIle420425430AsnProGlnAsnGlyAlaValMetAlaLeuValGlyGlyPheAspPhe435440445AsnGlnSerLysPheAsnArgAlaThrGlnAlaLeuArgGlnValGly450455460SerAsnIleLysProPheLeuTyrThrAlaAlaMetAspLysGlyLeu465470475480ThrLeuAlaSerMetLeuAsnAspValProIleSerArgTrpAspAla485490495SerAlaGlySerAspTrpGlnProLysAsnSerProProGlnTyrAla500505510GlyProIleArgLeuArgGlnGlyLeuGlyGlnSerLysAsnValVal515520525MetValArgAlaMetArgAlaMetGlyValAspTyrAlaAlaGluTyr530535540LeuGlnArgPheGlyPheProAlaGlnAsnIleValHisThrGluSer545550555560LeuAlaLeuGlySerAlaSerPheThrProMetGlnValAlaArgGly565570575TyrAlaValMetAlaAsnGlyGlyPheLeuValAspProTrpPheIle580585590SerLysIleGluAsnAspGlnGlyGlyValIlePheGluAlaLysPro595600605LysValAlaCysProGluCysAspIleProValIleTyrGlyAspThr610615620GlnLysSerAsnValLeuGluAsnAsnAspValGluAspValAlaIle625630635640SerArgGluGlnGlnAsnValSerValProMetProGlnLeuGluGln645650655AlaAsnGlnAlaLeuValAlaLysThrGlyAlaGlnGluTyrAlaPro660665670HisValIleAsnThrProLeuAlaPheLeuIleLysSerAlaLeuAsn675680685ThrAsnIlePheGlyGluProGlyTrpGlnGlyThrGlyTrpArgAla690695700GlyArgAspLeuGlnArgArgAspIleGlyGlyLysThrGlyThrThr705710715720AsnSerSerLysAspAlaTrpPheSerGlyTyrGlyProGlyValVal725730735ThrSerValTrpIleGlyPheAspAspHisArgArgAsnLeuGlyHis740745750ThrThrAlaSerGlyAlaIleLysAspGlnIleSerGlyTyrGluGly755760765GlyAlaLysSerAlaGlnProAlaTrpAspAlaTyrMetLysAlaVal770775780LeuGluGlyValProGluGlnProLeuThrProProProGlyIleVal785790795800ThrValAsnIleAspArgSerThrGlyGlnLeuAlaAsnGlyGlyAsn805810815SerArgGluGluTyrPheIleGluGlyThrGlnProThrGlnGlnAla820825830ValHisGluValGlyThrThrIleIleAspAsnGlyGluAlaGlnGlu835840845LeuPhe850(2)SEQIDNO11的资料(i)序列特征(A)长度553个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型peptide(vi)来源(A)生物体大肠杆菌(vii)直接来源(B)克隆pARC0592截短的PBP1B(xi)SEQUENCEDESCRIPTIONSEQIDNO11MetAlaGlyAsnAspArgGluProIleGlyArgLysGlyLysProThr151015ArgProValLysGlnLysValSerArgArgArgTyrGluAspAspAsp202530AspTyrAspAspTyrAspAspTyrGluAspGluGluProMetProArg354045LysGlyLysGlyLysGlyLysGlyArgLysProArgGlyLysArgGly505560TrpLeuTrpLeuLeuLeuLysLeuAlaIleValPheAlaValLeuIle65707580AlaIleTyrGlyValTyrLeuAspGlnLysIleArgSerArgIleAsp859095GlyLysValTrpGlnLeuAlaAlaAlaValTyrGlyArgMetValAsn100105110LeuGluProAspMetThrIleSerLysAsnGluMetValLysLeuLeu115120125GluAlaThrGlnTyrArgGlnValSerLysMetThrArgProGlyGlu130135140PheThrValGlnAlaAsnSerIleGluMetIleArgArgProPheAsp145150155160PheProAspSerLysGluGlyGlnValArgAlaArgLeuThrPheAsp165170175GlyAspHisLeuAlaThrIleValAsnMetGluAsnAsnArgGlnPhe180185190GlyPhePheArgLeuAspProArgLeuIleThrMetIleSerSerPro195200205AsnGlyGluGlnArgLeuPheValProArgSerGlyPheProAspLeu210215220LeuValAspThrLeuLeuAlaThrGluAspArgHisPheTyrGluHis225230235240AspGlyIleSerLeuTyrSerIleGlyArgAlaValLeuAlaAsnLeu245250255ThrAlaGlyArgThrValGlnGlyAlaSerThrLeuThrGlnGlnLeu260265270ValLysAsnLeuPheLeuSerSerGluArgSerTyrTrpArgLysAla275280285AsnGluAlaTyrMetAlaLeuIleMetAspAlaArgTyrSerLysAsp290295300ArgIleLeuGluLeuTyrMetAsnGluValTyrLeuGlyGlnSerGly305310315320AspAsnGluIleArgGlyPheProLeuAlaSerLeuTyrTyrPheGly325330335ArgProValGluGluLeuSerLeuAspGlnGlnAlaLeuLeuValGly340345350MetValLysGlyAlaSerIleTyrAsnProTrpArgAsnProLysLeu355360365AlaLeuGluArgArgAsnLeuValLeuArgLeuLeuGlnGlnGlnGln370375380IleIleAspGlnGluLeuTyrAspMetLeuSerAlaArgProLeuGly385390395400ValGlnProArgGlyGlyValIleSerProGlnProAlaPheMetGln405410415LeuValArgGlnGluLeuGlnAlaLysLeuGlyAspLysValLysAsp420425430LeuSerGlyValLysIlePheThrThrPheAspSerValAlaGlnAsp435440445AlaAlaGluLysAlaAlaValGluGlyIleProAlaLeuLysLysGln450455460ArgLysLeuSerAspLeuGluThrAlaIleValValValAspArgPhe465470475480SerGlyGluValArgAlaMetValGlyGlySerGluProGlnPheAla485490495GlyTyrAsnArgAlaMetGlnAlaArgArgSerIleGlySerLeuAla500505510LysProAlaThrTyrLeuThrAlaLeuSerGlnProLysIleTyrArg515520525LeuAsnThrTrpIleAlaAspAlaProIleAlaLeuArgGlnProAsn530535540GlyGlnValTrpSerProGlnAsnAsp545550(2)SEQIDNO12的资料(i)序列特征(A)长度532个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型peptide(vi)来源(A)生物体大肠杆菌(vii)直接来源(B)克隆pARC0593截短的可溶PBP1B(xi)序列描述SEQIDNO12MetAlaGlyAsnAspArgGluProIleGlyArgLysGlyLysProThr151015ArgProValLysGlnLysValSerArgArgArgTyrGluAspAspAsp202530AspTyrAspAspTyrAspAspTyrGluAspGluGluProMetProArg354045LysGlyLysGlyLysGlyLysGlyArgLysProArgGlyLysArgGly505560SerIleAspGlnLysIleArgSerArgIleAspGlyLysValTrpGln65707580LeuAlaAlaAlaValTyrGlyArgMetValAsnLeuGluProAspMet859095ThrIleSerLysAsnGluMetValLysLeuLeuGluAlaThrGlnTyr100105110ArgGlnValSerLysMetThrArgProGlyGluPheThrValGlnAla115120125AsnSerIleGluMetIleArgArgProPheAspPheProAspSerLys130135140GluGlyGlnValArgAlaArgLeuThrPheAspGlyAspHisLeuAla145150155160ThrIleValAsnMetGluAsnAsnArgGlnPheGlyPhePheArgLeu165170175AspProArgLeuIleThrMetIleSerSerProAsnGlyGluGlnArg180185190LeuPheValProArgSerGlyPheProAspLeuLeuValAspThrLeu195200205LeuAlaThrGluAspArgHisPheTyrGluHisAspGlyIleSerLeu210215220TyrSerIleGlyArgAlaValLeuAlaAsnLeuThrAlaGlyArgThr225230235240ValGlnGlyAlaSerThrLeuThrGlnGlnLeuValLysAsnLeuPhe245250255LeuSerSerGluArgSerTyrTrpArgLysAlaAsnGluAlaTyrMet260265270AlaLeuIleMetAspAlaArgTyrSerLysAspArgIleLeuGluLeu275280285TyrMetAsnGluValTyrLeuGlyGlnSerGlyAspAsnGluIleArg290295300GlyPheProLeuAlaSerLeuTyrTyrPheGlyArgProValGluGlu305310315320LeuSerLeuAspGlnGlnAlaLeuLeuValGlyMetValLysGlyAla325330335SerIleTyrAsnProTrpArgAsnProLysLeuAlaLeuGluArgArg340345350AsnLeuValLeuArgLeuLeuGlnGlnGlnGlnIleIleAspGlnGlu355360365LeuTyrAspMetLeuSerAlaArgProLeuGlyValGlnProArgGly370375380GlyValIleSerProGlnProAlaPheMetGlnLeuValArgGlnGlu385390395400LeuGlnAlaLysLeuGlyAspLysValLysAspLeuSerGlyValLys405410415IlePheThrThrPheAspSerValAlaGlnAspAlaAlaGluLysAla420425430AlaValGluGlyIleProAlaLeuLysLysGlnArgLysLeuSerAsp435440445LeuGluThrAlaIleValValValAspArgPheSerGlyGluValArg450455460AlaMetValGlyGlySerGluProGlnPheAlaGlyTyrAsnArgAla465470475480MetGlnAlaArgArgSerIleGlySerLeuAlaLysProAlaThrTyr485490495LeuThrAlaLeuSerGlnProLysIleTyrArgLeuAsnThrTrpIle500505510AlaAspAlaProIleAlaLeuArgGlnProAsnGlyGlnValTrpSer515520525ProGlnAsnAsp530(2)SEQIDNO13的资料(i)序列特征(A)长度159个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体大肠杆菌(vii)直接来源(B)克隆pARC0392(xi)序列描述SEQIDNO13GlyGluGlnArgLeuPheValProArgSerGlyPheProAspLeuLeu151015ValAspThrLeuLeuAlaThrGluAspArgHisPheTyrGluHisAsp202530GlyIleSerLeuTyrSerIleGlyArgAlaValLeuAlaAsnLeuThr354045AlaGlyArgThrValGlnGlyAlaSerThrLeuThrGlnGlnLeuVal505560LysAsnLeuPheLeuSerSerGluArgSerTyrTrpArgLysAlaAsn65707580GluAlaTyrMetAlaLeuIleMetAspAlaArgTyrSerLysAspArg859095IleLeuGluLeuTyrMetAsnGluValTyrLeuGlyGlnSerGlyAsp100105110AsnGluIleArgGlyPheProLeuAlaSerLeuTyrTyrPheGlyArg115120125ProValGluGluLeuSerLeuAspGlnGlnAlaLeuLeuValGlyMet130135140ValLysGlyAlaSerIleTyrAsnProTrpArgAsnProLysLeu14515015权利要求1.一种多肽，它是细菌双功能青霉素结合蛋白的水溶性活性衍生物，所述青霉素结合蛋白在细菌细胞内表达后结合细胞膜并能表现转糖基酶和转肽酶活性，所述衍生物缺少膜锚定序列但仍能表现一种或两种上述酶活性。2.根据权利要求1的多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQIDNO2、4、6、12或13相同或基本相似。3.一种多肽，它是细菌双功能青霉素结合蛋白的转糖基酶缺陷型衍生物，该青霉素结合蛋白在细菌细胞内表达后结合细胞膜并能表现转糖基酶和转肽酶活性，该衍生物不能表现转糖基酶活性但能表现转肽酶活性。4.根据权利要求3的多肽，其中衍生物不能表现转糖基酶活性是由于编码该多肽的基因的第二保守区域有突变或缺失。5.根据权利要求3的多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQIDNO7、8、9或10相同或基本相似。6.根据权利要求1或3的多肽，其中细菌细胞是大肠杆菌细胞或肺炎链球菌细胞。7.一种多肽，其含有(a)根据权利要求1或3的第一多肽和(b)容许与亲和基质结合的附加的多肽；多肽之间有一切割位点。8.根据权利要求7的多肽，其中附加的多肽是谷胱甘肽-S-转移酶或基本与谷胱甘肽-S-转移酶相似的多肽。9.根据权利要求7的多肽，其中附加的多肽是富含组氨酸残基的多肽。10.一种分离并纯化的DNA分子，其核苷酸序列编码根据权利要求1、3或7的多肽。11.根据权利要求10的DNA分子，其核苷酸序列与序列表中SEQIDNO1、3或5相同或基本相似。12.一种携带根据权利要求10的DNA分子并能介导其表达的可复制表达载体。13.根据权利要求12的载体，它是下列载体pARC0558(NCIMBNo.40666)，pARC0559(NCIMBNo.40667)，pARC0512(NCIMBNo.40665)，pARC0438(NCIMBNo.40661)，pARC0468(NCIMBNo.40662)，pARC0469(NCIMBNo.40663)，pARC0571(NCIMBNo.40668)，pARC0593(NCIMBNo.40670)，pARC0392(NCIMBNo.40659)，pARC0499(NCIMBNo.40664)，或pARC0400(NCIMBNo.40660)。14.一种携载根据权利要求12的载体的细胞。15.一种生产多肽的方法，该多肽是青霉素结合蛋白的衍生物，所述方法包括在培养基中或培养基上生长根据权利要求14的细胞以表达多肽，并任选地回收多肽。16.一种生产根据权利要求1的水溶性多肽的方法，其包括培养携载一种表达载体的大肠杆菌细胞，载体中所述多肽的DNA编码序列受控于异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，培养时用次优浓度的IPTG诱导该启动子，温度范围为20到24℃。17.一种鉴定能够结合细菌双功能青霉素结合蛋白的抗体的方法，其包括将根据权利要求1或3的多肽用于抗体结合检测并筛选结合该多肽的抗体的步骤。18.一种检测结合青霉素结合蛋白的化合物的方法，其包括(a)用根据权利要求1、3或7的多肽接触待检测的化合物；(b)测定该化合物是否结合青霉素结合蛋白。19.一种检测结合青霉素结合蛋白的化合物的方法，其包括(a)培养根据权利要求14的细胞；(b)裂解该细胞并分离粗细胞提取物；(c)将该细胞提取物接触可能的青霉素结合蛋白抑制物；(d)将已知结合青霉素结合蛋白的试剂引入该细胞提取物中；(e)除去该试剂中未结合的部分；(f)检测该试剂是否存留于细胞提取物中。20.一种检测结合青霉素结合蛋白的化合物的方法，其包括(a)将固定于固体支持物上的根据权利要求1、3或7的多肽接触可能的青霉素结合蛋白抑制物；(b)将一种已知结合青霉素结合蛋白的试剂接触固定化的多肽；(c)除去该试剂中未结合的部分；(d)检测该试剂是否结合固定化的多肽。21.一种检测结合青霉素结合蛋白的化合物的方法，其包括(a)将根据权利要求1、3或7的多肽接触可能的青霉素结合蛋白抑制物；(b)将一种已知结合青霉素结合蛋白的试剂接触该多肽，所述试剂被固定于固体支持物上；(c)检测该多肽是否结合固定化的试剂。22.一种检测结合青霉素结合蛋白转糖基酶结构域的化合物的方法，其包括(a)将固定于固体支持物上的根据权利要求1或7的多肽的转糖基酶结构域接触可能的青霉素结合蛋白转糖基酶活性抑制物；(b)将一种已知结合青霉素结合蛋白的转糖基酶结构域的试剂接触固定化的多肽；(c)除去该试剂中未结合的部分；(d)检测该试剂是否结合固定化的多肽。23.一种检测结合青霉素结合蛋白转糖基酶结构域的化合物的方法，其包括(a)将根据权利要求1或7的多肽的转糖基酶结构域接触可能的青霉素结合蛋白抑制物；(b)将该多肽接触一种固定于固体支持物上的，已知结合青霉素结合蛋白的转糖基酶结构域的试剂；(c)检测该多肽是否结合固定化的试剂。24.根据权利要求19至23中任一权项的方法，其中已知结合青霉素结合蛋白的试剂是单克隆抗体。25.根据权利要求19至23中任一权项的方法，其中已知结合青霉素结合蛋白的试剂是被标记的抗生素化合物。26.一种确定青霉素结合蛋白的蛋白结构的方法，其特征在于，根据权利要求1或3的多肽被用于X射线晶体学。全文摘要本发明涉及青霉素结合蛋白(PBP)的变异体,这些蛋白与细菌肽聚糖的生物合成有关。本发明还公开了编码PBP变异体的DNA分子,以及携载这些DNA分子的载体和细胞。本发明还涉及治疗用化合物的检测和设计方法,所述化合物对PBP有高亲和性,所述方法用到了PBP变异体。文档编号C12Q1/18GK1173182SQ9519744公开日1998年2月11日申请日期1995年6月21日优先权日1994年11月24日发明者T·布尔根尼彻,C·M·汤申请人:阿斯特拉公司