突变型单加氧酶细胞色素p－450的制作方法

专利名称：突变型单加氧酶细胞色素p－450的制作方法
技术领域：
本发明涉及单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体以及用该突变体氧化某些有机化合物的方法。
单加氧酶催化非功能基化的碳水化合物用氧的氧化1，因此在有机合成上具有重要潜在应用价值。然而，由于在分离足够量的酶和相关的电子传递蛋白上的困难，这方面的发展受到阻碍。尽管可得到多于150种不同细胞色素P-450单加氧酶的氨基酸序列，但至今仅有三种的结构资料是可获得的2，3，4，并且很少在细菌系统内被成功地超量表达5。
一种可溶并能以足够数量地被表达的细胞色素P-450单加氧酶是来自P.putida的高度专一的P-450cam，它催化樟脑(1)区域和立体选择性的羟基化成5-外-羟基樟脑6。已测定了P-450cam的高解析晶体结构2，由于认为此细菌酶的作用机制与其哺乳动物相应物的作用机制非常相似，它已被用作框架，哺乳动物酶的模型就基于此框架。
P-450cam的核苷酸序列和相应的氨基酸序列已被描述5。知道酶的活性位点的位置并研究了结构-功能关系13，14。P-450cam在101和185和247位15以及87位16的突变体已被描述。已描述了96位酪氨酸变成96位苯丙氨酸的突变体12，17，18。但是在所有这些事例中，文章报道了突变对已知氧化反应的机制的影响。没有教导或建议来说明突变可以对不同底物的氧化提供生物催化剂。
在尝试发现新的生物催化剂中，我们开始了一个计划，其目的在于重新设计P-450cam的活性位点，以使其能够对不能作为野生型蛋白底物的有机分子进行特定的氧化。我们初始目的是在P-450cam的活性位点掺入一“芳香性口袋”，它会增加含有芳香侧链的底物的结合。
另外，鉴定了(半胱氨酸-334)远离活性位点的表面残基对蛋白处理和稳定性的影响。此半胱氨酸对蛋白纯化时不期望的二聚化负有责任，因此为了改善这两方面的性质用丙氨酸取代了半胱氨酸。
如

图1.所示，P-450cam的三维结构显示活性位点提供与樟脑的疏水性基团近范德华作用。三个芳香残基(Y96，F87和F98)组合一起并排成底物结合口袋，在96位酪氨酸和樟脑酰基氧之间有一个氢键保持底物处于正确的方向以保证反应的区域和立体选择性。用较小的疏水性非芳香性侧链取代这些芳香性残基中任一个能提供期望的“芳香性口袋”。
用分子模型研究点突变对三个芳香性残基的可能影响。用程序GRID7计算芳香性探针和细胞色素P-450cam可能的突变体之间的相互作用的能量，其中突变体的这些残基变成了丙氨酸(F87A，Y96A和F98A)。然后用分子模型软件包Quanta8检查以图显示的结果。
突变体F98A在对芳香性探针可进入的活性位点空穴似乎具有最强的结合相互作用，Y96A的结合相互作用少弱，F87A基本上很少。首先确定96位酪氨酸突变为丙氨酸，因为它更接近结合口袋中心，而98位苯丙氨酸在一侧的沟中。而且，由于丢失了结合于底物的氢键，除去96位酪氨酸会降低酶对樟脑的特异性。
根据本发明的一个方面，提供了单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体，其中在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被除苯丙氨酸之外的任意氨基酸残基取代。
根据本发明的另一个方面，提供了单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体，其中在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代，该突变体具有催化以下任一个物质氧化的性质聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括它们的卤代变体的二苯基和联苯基化合物和卤代碳水化合物。
仍根据本发明的另一个方面，提供了一种氧化选自聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括其卤代变体的二苯基和联苯基化合物或卤代碳水化合物的方法，该方法包括在氧化条件下把选择的化合物之一与单加氧酶细胞色素P-450cam接触，其中单加氧酶细胞色素P-450cam在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代。
氨基酸残基优选地选自丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸，除了在96位的酪氨酸残基处的氨基酸不是酪氨酸，以及在334位的半胱氨酸残基处氨基酸不是半胱氨酸。
取代96位酪氨酸的氨基酸常规地是小的疏水性氨基酸之一，如丙氨酸，甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸作为下面的例子。
另外取代96位酪氨酸的氨基酸可以是带电荷氨基酸之一，如带负电荷的酸像氢结合到正电荷底物的天冬氨酸或谷氨酸；或带正电荷的化合物像氢结合到不是樟脑家族成员的负电荷底物的赖氨酸，精氨酸或苏氨酸。
96位的突变被认为是关键，它使突变体酶能够催化相当宽范围的有机底物的氧化。为活性位点的形状和特异性，其它靠近酶活性位点的氨基酸也可以突变。这些其它氨基酸包括在87，98，185，244，247，295和297位的氨基酸。设想在一个或多个这些位置的氨基酸可以被下列取代小的疏水性氨基酸以增加活性位点；或大的疏水性氨基酸以减少活性位点的体积；或被具有芳香环的氨基酸取代以结合到相应底物芳香环上。
关于氧化反应，在加入的参考文献中描述了其条件。除突变体酶之外，酶系统典型地包括假单胞氧还蛋白和假单胞氧还蛋白还原酶连同NADH作为辅因子。观察了各种类的有机化合物-
i)有机化合物是芳香性化合物，或是碳水化合物或是在一定条件使用的化合物，该条件不使酶失活或变性。因为突变作用以产生芳香性结合口袋为目的，此突变体酶能够催化范围广的芳香性化合物的氧化。在下面的实验部分论证实施例芳香性和聚芳香性化合物的氧化，并且令人吃惊的相信野生型酶仅催化樟脑家族的氧化作用。
ii)有机化合物可以是碳水化合物，如带有功能基的脂肪族或脂环族。在氧化反应前芳香性保护基团加入到该功能基上并在氧化反应后从功能基上除去。适宜的芳香性基团是苯基。芳香性保护基团被认为保持底物在适当的位置。所以保护基团用于两个目的首先它使底物更具疏水性并因而增加与疏水性酶口袋结合；其次它保持底物处于活性位点的适当位置。所以，用正确的芳香性保护基团，底物的区域和立体选择性羟基化都可以达到。环己基苯的实施例在下面实验部分描述。单功能基化碳水化合物的实施例有环己基，环戊基和烷基衍生物(示意图1)。这些化合物的氧化产物对有机合成是有价值的起始原料，特别是当以同手性型产生时。观察了序列芳香性保护基团，如苯基或萘基醚和苯甲酰基或萘酰基酯以及酰胺(示意图1)。有兴趣的也有苯并噁唑基团作为羧基保护基团和N-苯基噁唑烷基团作为醛的保护基。酶氧化后两者都能容易地除去并且在先前的醛和酸的微生物氧化文献中已有描述。
iii)有机化合物是C5到C12脂肪族或脂环族碳水化合物。环己烷和线性碳水化合物的氧化在下面实验部分论证，并且再次十分令人吃惊的相信野生型酶仅催化樟脑家族的氧化。
iv)有机化合物是卤代脂肪族或脂环族碳水化合物。高丙体六六六(六氯代环己烷)的氧化下面也有描述。
参照附图，其中图2是二苯基甲烷(A)和用P-450camY96A突变体温育后形成的羟基化产物的气相色谱。
基于以上考虑，构建了突变体蛋白，它包括代替96位(Y96)酪氨酸的丙氨酸，赖氨酸，缬氨酸，或苯丙氨酸。构建了另外的突变体，其中这些活性位点取代与334位半胱氨酸表面突变成丙氨酸相组合。最后几个活性位点突变和表面突变组合在一个蛋白中组成复合的突变体酶。编码细胞色素P-450cam的基因，以及其天然电子传递伙伴假单胞氧还蛋白和假单胞氧还蛋白还原酶，用聚合酶链反应(PCR)从P.Putida的总细胞DNA中扩增。采用的表达载体/大肠杆菌宿主组合对P-450cam为JM109株的pRH10919，对假单胞氧还蛋白为JM109株的pUC118，以及对假单胞氧还蛋白还原酶为DH5oc株的pGLW11。用M13mp19亚克隆通过Zoller和Smith10的方法进行寡核苷酸指导的点特异诱变，采用Kunkel的方法11选择突变体。
类似于报道的突变体Y96F12，突变体Y96A显示催化樟脑(1)的羟基化，尽管与野生型酶相比该反应缺少选择性。这种在选择性上的降低可认为是Y96和樟脑间氢键丢失的结果。用各种结合和活性测定进一步研究了野生型和Y96A蛋白的性质。
用光谱方法研究了可能底物的结合。缺少底物的野生型酶处于6-配位，低自旋形式，带有弱结合的水占据第六个配位点，并在391nm显示特征的Soret最大值。结合底物类似物金刚烷酮(2)，金刚烷(3)和降冰片烷(4)也全部把血红素转变成高自旋形式。然而，二苯基甲烷(5)在吸收波谱中未产生迁移。
对化合物(3)和(4)给出相同结果的Y96A突变体未全部转变成高自旋形式，即使(1)和(2)过量加入。然而最有趣地是，与野生型相反，用二苯基甲烷，Y96A显示部分转变haem到高自旋形式，表明该化合物结合到突变体酶上。
如所期望的，在Y96A中樟脑和金刚烷酮的解离常数(Kapp)增加。在另一方面，疏水性底物金刚烷和降冰片烷的Kapp值减少，表明酶口袋变得对疏水性底物更具选择性。用二苯基甲烷得到了结合上最大的变化，二苯基甲烷弱结合野生型蛋白，而对Y96A突变体显示大大增强的亲和性(表1)。
二苯基甲烷被Y96A蛋白的结合一旦建立，得以研究催化底物翻转。用假单胞氧还蛋白和假单胞氧还蛋白还原酶重新组成突变体蛋白。加入二苯基甲烷(5)，混合物用NADH和氧温育。
在100mM KCl，20mM KH2PO4pH7.4中含有10μM假单胞氧还蛋白，2μM假单胞氧还蛋白还原酶，1μM细胞色素P-450cam单加氧酶(野生型或突变体)和1mM二苯基甲烷的溶液于25℃在摇床中温育5分钟。通过先加入NADH至2mM的总浓度起始酶反应。进而以5分钟的间隔加入四等份的NADH(每次增加NADH浓度1mM)，30分钟后反应通过加入0.5ml氯仿终止。氯仿层用气相色谱分析。
用气相色谱分析粗温育混合物的有机提取物。通过GC检测到只有一个主要新峰(见图2)，它与对-羟基二苯基甲烷(6)的真实样品具有相同的保留时间。其它芳香性羟基化产物，邻位和间位异构体，具有不同的保留时间。产物身份进一步确认为结构(6)是由质谱提供的，质谱在184给出正确的质量峰。
用上面的实验技术，发明者研究了相当数量的有机化合物作为野生型P-450cam酶和突变体变体Y96A两者的底物。进一步的工作包括标明为突变体Y96V；Y96L；Y96F；C334A；联合突变体F87A，Y96G，F193A以及联合活性位点和表面突变体Y96A，C334A；Y96V，C334A；Y96L，C334A；Y96F，C334A；F87A，Y96A，F193A，C334A。
对Y96A的结果陈列于表2，其中结构上相关的分子归为一类。那些其氧化是通过NADH翻转的方法验证的底物用+号标记。
自旋高/低数据显示在200μM测试化合物存在下，在磷酸盐缓冲液(40mM磷酸盐，68mM钾，pH7.4)中P-450(OD4170.2-0.4)从低到高自旋平衡态转变的百分数。自旋态平衡用UV/可见分光光度计鉴定未做在OD417的低自旋和在OD392的高自旋；未做。
Vs DTT数据显示在磷酸缓冲液中DTT通过与测试化合物(200μM)竞争结合到P-450上的取代百分数。DTT结合到P-450导致在OD374和OD461的吸收峰，这样用UV/可见分光光度计测定取代。
对在i)到iv)点鉴定的每一类化合物的实施例包括在表2(a)到2(h)中。
对一些底物化合物的反应产物已用高压液相色谱纯化并用质谱，核磁共振，和/或共洗脱鉴定。表3详述对小的线性，支链和环状碳水化合物被Y96A，C334A氧化的DADH消耗。表4(a)到4(h)详述了突变产物的分布以及现已在此阐明的底物组合物。
示意图1
表1Kapp(μM)aWTY96A
16.312
212 28
38.41.4
433092
5＞1500b73a 数值是用Sligar(S.G.Sligar，Biochenistry，1976，15，5399-5406)方法两次单独测量的平均值。Kapp值强烈依赖K+在缓冲液中的浓度，在[K+]＞150mM，樟脑的kapp对野生型和Y96A0，.6mM。此表中的数据是在[K+]＝70mM的磷酸缓冲液，pH7.4中测定的，这是为了避免高离子浓度时盐析出底物。b 未达到饱和，
(续上表
注表中乙代表乙草胺；扑代表扑草净；异代表异恶草酮以下实施例并不限定本发明的权利保护范围，而用以进一步解释和说明本发明。
实施例配方(重量比)2′-乙基-6′-甲基-N-(乙氧甲基)-2-氯代乙酰替苯胺 1.04，6-双异丙胺基-2-甲硫基-1，3，5三嗪 0.5木质素磺酸盐 0.3聚氧乙烯壬基苯醚 0.5十二烷基硫酸钠 0.1氧化硅 10硅藻土 40将活性组分2′-乙基-6′-甲基-N-(乙氧甲基)-2-氯代乙酰替苯胺、4，6-双异丙胺基-2-甲硫基-1，3，5-三嗪、木质素磺酸盐、聚氧乙烯壬基苯醚、十二烷基硫酸钠、氧<p>表2(b)
表2(c)
表2(d)
表2(e)P450cam-底物相互作用 野生型 突变型Y96A 野生型 突变型Y96A族4，5-环Δ自旋 Δ自旋 NADH NADHVs DTT Vs DTT高/低 高/低 翻转？GC？ 翻转？GC？
 - - --
1，2-苯蒽- - --
荧蒽 - 5 20 10
芘*- - --
苝*- - --
表2(f)P450cam-底物相互作用 野生型突变型Y96A野生型 突变型Y96A族环烷烃 Δ自旋Δ自旋NADH NADHVs DTT Vs DTT高/低 高/低翻转？GC？ 翻转？GC？
顺-十氢化萘 ndndnd nd
反-十氢化萘 201090 70
环己烷 - - 60 60 +
甲基环己烷505010070
表2(g)
表2(h)P450cam-底物相互作用 野生型 突变型Y96A野生型 突变型Y96A族樟脑类似物 Δ自旋 Δ自旋NADH NADHVs DTTVs DTT高/低 高/低 翻转？GC？ 翻转？GC？
(1R)-(-)-樟脑醌80 80 80 80
(1R)-(-)-葑酮 40 70 50 80
双环戊二烯 50 80 90 90
表3小烷烃被P450cam突变体的反转下列所有突变体也含有C334A突变作用.以NADH消耗速率测定的反转速率(nmole NADH/nmole P450cam/S)烷烃底物野生型 Y96A主链长度 名称C4 n-丁烷 - -C4 2-甲基丁烷 本底4.6C4 2，3-二甲基丁烷本底16.8C4 2，2-二甲基丁烷本底14.0C5 n-戊烷 本底5.8C5 2-甲基戊烷 3.8 11.7C5 3-甲基戊烷 1.3 14.2C5 2，4-二甲基戊烷0.2 12.6C5 2，2-二甲基戊烷5.2 12.8C5 2，2，4-三甲基戊烷 0.9 5.3C5 3-乙基戊烷 本底16.2C6 n-己烷 本底6.0C6 2-甲基乙烷 本底10.6C7 n-庚烷 2.7 4.4C7 2-甲基庚烷 本底2.1C7 4-甲基庚烷 1.4 10.2C8 n-辛烷 本底5.8C7 环庚烷 4.4 42.5底物用P450cam活性位点突变体氧化后产物结构和分类.
“本底”-典型本底NADH氧化速率是0.07nmole NADH(nmole P450cam)-1秒-1。
表4(a)底物用P450cam活性位点突变体氧化后的产物结构和分类下列突变体也含有C334A突变体
表4(b)
表4(c)
表4(d)菲产物突变体产量(％)WTY96A Y96F Y96L Y96V F87A-F96G-F193AA 38494135.5 4127B 15233141 3841C 12135 9 113D 35152314.5 1029总产量0.075 7.0 4.5 2.81.6 0.065(面积/106)菲
表4(e)荧蒽产物突变体产量(％)WT Y96A Y96F Y96L Y96V F87A-F96G-F193AA 084 ---0B 016 ---100总产量02.7---0.2(面积/106)
表4(f)芘产物 突变体产量(％)WT Y96A Y96F Y96L Y96V F87A-F96G-F193AA040 43 23 3033B043.6 29 64.5 5540C05 12.5 7.91220D011.4 15.5 4.63 7总产量 01.21.51.5160.02(面积/106)
表4(g)高丙体六六六 突变体产量(％)(六氯代环己烷) WT Y96AA 100 100翻转速率 7.5 43.5nmole NADH(nmole P450)-1S-1
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权利要求
1.单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体，其中96位酪氨酸残基和/或334位半胱氨酸残基被除苯丙氨酸之外的任意氨基酸残基取代。
2.单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体，其中在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代，该突变体具有催化以下任一个物质氧化的性质聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括它们的卤代变体的二苯基和联苯基化合物和卤代碳水化合物。
3.如权利要求1或权利要求2中要求的突变体，其中氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸，除了96位的酪氨酸残基处的氨基酸不是酪氨酸，以及334位的半胱氨酸残基处氨基酸不是半胱氨酸。
4.如权利要求1到权利要求3中要求的任一个突变体，其中在87，98，185，244，295和297的一个或多个位置的氨基酸残基被其它的氨基酸残基取代。
5.氧化选自聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括其卤代变体的二苯基和联苯基化合物或卤代碳水化合物的方法，该方法包括在氧化条件下把选择的化合物之一与单加氧酶细胞色素P-450cam接触，其中单加氧酶细胞色素P-450cam在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代。
6.如权利要求5中要求的方法，其中氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸，除了96位的酪氨酸残基处的氨基酸不是酪氨酸，以及334位的半胱氨酸残基处氨基酸不是半胱氨酸。
7.如权利要求5或权利要求6中要求的任一个突变体，其中在87，98，185，244，295和297的一个或多个位置的氨基酸残基被其它的氨基酸残基取代。
8.基本上如在此之前参考附图和/或实施例描述的单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体。
9.基本上如在此之前参考附图和/或实施例描述的氧化选自聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括其卤代变体的二苯基和联苯基化合物或卤代碳水化合物的方法。
全文摘要
单加氧酶细胞色素P－450
文档编号C12N15/53GK1171818SQ9519721
公开日1998年1月28日 申请日期1995年11月2日 优先权日1994年11月3日
发明者S·L·弗利斯, D·P·尼克森, L·L·王 申请人:Bg公开有限公司