专利名称：表达含有多个基因的dna构建体具有抗病毒抗性的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传工程和运用编码多个基因如外壳蛋白基因、蛋白酶基因或复制酶基因的载体赋予植物多种性状(包括抗病毒)的方式和方法。
背景技术：
计多重要的农业作物易于被植物病毒侵害，所述病毒可使作物受到严重的损害、使种植者的经济收入下降并使消费者的花费增高。已经做了努力，以控制或预防植物病毒对作物的侵害，但病毒性病原体仍是农业的一个重大的难题。
最近科学家运用遗传工程技术已建立了使植物产生抗病毒抗性的方法。该进步非常有利，因为使植物具有保护作用的遗传物质被掺入到植物本身的基因组内，并能传递给其后代。如果宿主植物具有抑制或阻碍病毒增殖的能力或者是具有防止致病症状发生的能力，那么该植物则是有抗性的。“有抗性的”是“敏感的”反义词，并依据其效果可划分为(1)高抗性、(2)中度抗性或(3)低抗性。重要的是，抗性植物的病症表现减少或根本没有，并且其体内病毒的繁殖减少或可忽略不计。已认识到数种不同的抗病毒的宿主抗性。宿主可以抗(1)侵害的发生，(2)病毒的繁殖或(3)病毒的活动。
马铃薯Y病毒组是一群使多种作物致病的植物病毒，并证明它们在不同科的植物成员之间引起交叉感染。马铃薯Y病毒组包括西瓜花叶病毒-2(WMV-2)、木瓜环斑病毒的木瓜环斑和西瓜花叶I病毒(PRV-p和PRV-w)品系、夏南瓜黄色花叶病毒(ZYMV)、马铃薯病毒Y、烟草蚀刻病毒以及其它许多病毒；其中PRV-p和PRV-w是植物马铃薯Y病毒组群中关系极为密切的两个成员，它们曾一时被划分为不同的病毒类型，但最近将它俩划分为同一病毒的不同的品系。例如，请参见已公开的欧洲专利申请No.578,627中的表I。
这些病毒由直径约为780×12nm的锯齿状丝状的颗粒组成。病毒颗粒含有单链的RNA基因组，该基因组含有大约10,000个阳性(+，编码有义的)核苷酸。马铃薯Y病毒组的RNA基因组的翻译表明该RNA编码一条大约330kD的巨大的多聚蛋白质。该多聚蛋白质包含数个蛋白质，其中之一是49kD的蛋白酶，该蛋白酶特异性地将多聚蛋白质切割成至少6个其它的肽。这些蛋白质可在受侵染的植物细胞中找到，并且是病毒复制的必需成分，包含在该多聚蛋白质之内的一个蛋白质是35kD的衣壳或外壳蛋白，它包被着并保护着病毒RNA，使RNA免遭降解。另一种蛋白质是核内包涵体蛋白，亦被称作复制酶，相信在病毒RNA的复制过程中发挥着作用。在马铃薯Y病毒组侵染的过程中，复制酶(60kD，亦被称为核内包涵体B蛋白)和蛋白酶(50kD，亦被称为核内包涵体I或核内包涵体A蛋白)在转译后被运输，在病毒侵染的后期穿过核膜进入植物的细胞核，并积累达到较高的含量。
外壳蛋白基因通常位于RNA的3′末端，就在一串末端腺苷酸残基(200-300个碱基)之前。在这些病毒中，49kD的蛋白酶基因的位置看来是保守的。在烟草蚀刻病毒中，已确定的蛋白酶的切割位点是二肽Gln-Ser、Gln-Gly或Gln-Ala。从上面所列的马铃薯Y病毒组的序列看，在这些病毒多聚蛋白质中作为切割位点的这些二肽的保守性是显然的。
来自烟草花叶病毒、木瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒X以及其它病毒的外壳蛋白基因在转基因植物中的表达使植物对相应病毒的侵染产生了抗性。已有一些异源保护证据的报道。例如，据Namba等Phytopathology(植物病理学)，82，940(1992)报道，来自西瓜花叶病毒-2或夏南瓜黄叶花叶病毒的外壳蛋白基因在转基因烟草植物中的表达使植物获得了抗其它6种马铃薯Y病毒组(菜豆黄色花叶病毒、马铃薯病毒Y、蜿豆花叶病毒、三叶草黄色叶脉病毒、胡椒斑驳病毒和烟草蚀刻病毒)的保护。据Stark等Biotechnologg(生物技术)，1，1257(1989)报道，马铃薯Y病毒组大豆花叶病毒在转基因植物中的表达使植物获得了抗血清学上不相关的两种马铃薯Y病毒组(烟草蚀刻病毒和马铃薯病毒Y)的保护作用。
然而，预先选择的外壳蛋白基因的表达不能可靠地使植物获得异源保护。例如，含有CMV-C外壳蛋白基因并显示对CMV-C已有抗性的转基因南瓜植物并不能抵抗CMV的几个强毒力品系(包括CMV-V-27和CARNA-5)的侵染。因此，需要一种改进的方法，使植物获得抗马铃薯Y病毒组的抗性。
本发明概述本发明提供了包含多个DNA序列的重组嵌合DNA分子，各DNA序列中含有可与编码病毒相关蛋白质如外壳蛋白(CP)、蛋白酶或复制酶的DNA序列相连的启动子，其中所述的DNA序列在被所述的重组DNA分子转化的对病毒敏感的植物细胞中表达，从而赋予植物抵抗各所述病毒侵染的抗性。DNA序列优选以串联方式相连，即一个序列的头接另一个序列的尾。而且，优选在被所述的多个DNA序列转化的植物细胞中存在基本上等量的抗各所述病毒侵染的抗性。
各DNA序列还优选与3′非翻译DNA序列相连，3′非翻译DNA序列在植物细胞中发挥着作用，它引起转录的终止并将多聚腺苷酸加到转录出的mRNA序列的3′末端。所述病毒优选为植物相关病毒如马铃薯Y病毒组。
因此，本发明的DNA分子可用作嵌合的重组“表达构建体”或“表达盒”(expression cassette)以进行转基因植物的制备，该转基因植物抗至少两种植物病毒如马铃薯Y病毒组的抗性增加了。所述的表达盒还优选含有至少一个可选择标记基因或报告基因，标记基因或报告基因与病毒基因一起被稳定地整合到转化植物细胞的基因组中。所述的可选择标记和/或报告基因使被转化的植物细胞和植物易于识别。在病毒基因的侧翼优选排列着两个或多个可选择标记基因、报告基因或其组合。本发明的另一方面在于提供制备抗病毒植物如双子叶植物的方法，包括(a)用含有多个DNA序列的嵌合重组DNA分子转化植物细胞，各DNA序列含有在所述植物细胞中发挥作用的启动子，所述启动子与编码病毒相关蛋白质的DNA序列相连，所述的病毒能侵染所述的植物；(b)使所述的植物细胞再生以获得分化的植株；和(c)鉴定出表达该DNA序列赋予植物抗所述病毒侵染抗性的转化植株，优选该植株抗各病毒侵染的抗性基本上相等。
本发明的另一目的在于提供赋予对病毒敏感的葫芦科植物抗病毒侵染抗性的方法，该方法包括(a)用编码病毒的多个蛋白质的DNA分子转化葫芦植物细胞，所述的病毒能侵染所述的葫芦科植物；(b)使所述的植物细胞再生以得到分化的植株；(c)选择表达病毒蛋白质的水平足以使植物对所述病毒的侵染产生抗性的被转化的葫芦科植物。
本发明的再一目的在于提供具有多种病毒抗性的转化植物，所述的被转化植物含有被稳定整合的编码病毒蛋白质的DNA序列。
本发明的又一目的在于提供抗病毒的转化植物细胞，该转化植物细胞含有多个(即2-7个或更多的)病毒基因，该基因表达成同一病毒品系的病毒蛋白质或者表达成来自不同病毒品系的病毒蛋白质，就如同来自病毒群(如马铃薯Y病毒组群)的不同成员一样。
通过将多个病毒外壳蛋白表达盒插入到二分质粒中并随后测定所得的质粒的特征，对本发明进行了初步的说明。CMV、ZYMV、WMV-2、SQMV和PRV外壳蛋白表达盒的组合被置于二分质粒pPRBN中。随后，将含有多个外壳蛋白表达盒的二分质粒移入土壤杆菌(Agrobacterium)，以备在植物转化程序中使用。用含有多个表达盒的二分质粒将两个或多个病毒外壳蛋白转化易感基因与有关的可选择标记和/或报告基因一起转入植物如葫芦科的植物中。
因此，本发明提供了遗传工程的方法，通过该方法多种性状可做为单个的基因插入片段(即，其行为象单个基因作为单个孟德尔位点分离的构建体)被操纵和跟踪。虽然用病毒抗性基因对本发明做了示例性的说明，实际上，任何基因的组合均可被连琐。因此，通过简单地跟踪被连琐的可选择标记或报告基因，人们就可跟踪一串表现性状如疾病抗性、加除草剂抗性增强、加贮藏寿命延长等等性状的基因，所述的可选择标记或报告基因已被插入到转化的载体中。
还发现当多个串联的基因被插入的时候，它们的效力优选基本上一致，更优选它们的效力基本上相等；其中术语“基本上”在指病毒抗性时，参见下文实施例中所描述的定义。例如，如果人们在检查含有完整的ZYMV和WMV-2外壳蛋白插入片段的多个转基因品系时，人们会发现如果一个品系对ZYMV的侵染免疫，它对WMV-2的侵染也会免疫。类似地，如果一个品系表现出发生ZYMV的病症延迟，它表现出发生WMV2的病症也延迟。最后，如果一个品系易被ZYMV侵染，它也易被WMV-2侵染。这一现象是不曾预料到的。如果在这些多基因构建体中各基因的功效之间不存在相关的话，那么作为植物育种工具的这一创举有可能难于运用。即使对于单基因构建体，人们也必须对多个转基因植物品系进行测验，以找到一个表现出适当效力水平的品系。依赖于所用的物种，找到表达水平有用的品系的概率在10-50％的范围内。
如果含有多个基因的Ti质粒上的各个基因的效力是互不相干的话，找到抗各靶病毒的转基因品系的概率将急剧下降。例如，如果一物种采用单基因插入片段，鉴定出抗性品系的概率为10％，用三基因构建体CZW对该物种进行转化并且各基因的效力水平互不相干，那么找到抗CMV、抗ZYMV并抗WMV-2的品系的概率将为0.1×0.1×0.1＝0.001或0.1％。然而，尽管多价基因的效力彼此之间互不相干，找到抗CMV、ZYMV和WMV-2的品系的概率仍然是10％，而是0.1％。当被使用的构建体含有4个或更多的基因时，很显然这一优越性会变得更加显著。
附图的简要说明
图1显示了二分载体pPRBoriGN的结构。
图2显示了二分载体pPRBN的结构。
图3显示了pPRCPW的结构。
图4显示了二分质粒pEPG321的结构。
图5显示了二分质粒pEPG106的结构。
图6显示了二分质粒pEPG111的结构。
图7显示了二分质粒pEPG109的结构。
图8显示了二分质粒pEPG115的结构。
图9显示了二分质粒pEPG212的结构。
图10显示了二分质粒pEPG113的结构。
图11显示了二分质粒pGA482GG的结构。
图12显示了二分质粒pEPG382的结构。
本发明的详细描述通过在植物中表达分离的DNA序列，所述的DNA序列包含编码多个(即，2-7个)病毒蛋白质如外壳蛋白质、蛋白酶和/或复制酶的核苷酸，使本发明的植物被赋予了抗病毒的抗性。
可从中分离出这些DNA序列的有代表性的病毒包括(但不限于)马铃薯病毒X(PVX)、马铃薯Y病毒组如马铃薯病毒Y(PVY)、黄瓜病毒(CMV)、烟草叶脉斑驳病毒、西瓜花叶病毒(WMV)、夏南瓜黄叶花叶病毒(ZYMV)、普通菜豆花叶病毒、菜豆黄叶花叶病毒、大豆花叶病毒、花生斑驳病毒、甜菜花叶病毒、小麦条斑花叶病毒、玉米矮小花叶病毒、高梁花叶病毒、甘庶花叶病毒、石茅高梁花叶病毒、洋李痘病毒、烟草蚀刻病毒、白薯羽状斑驳病毒、薯蓣花叶病毒和木瓜环斑病毒(PRV)、包括CMA和comovirus的黄瓜病毒。
总之，马铃薯Y病毒组是单链的RNA病毒，它被包围在重复蛋白质单体之内，所述单体被称为外壳蛋白(cp)。被包被的病毒具有弯曲的杆状形态。绝大多数的马铃薯Y病毒组被蚜虫以非持续的方式传递。可被马铃薯Y病毒组侵染的作物的范围很广，从中可以看出，宿主的范围包括多科植物，但不限于茄科、藜科、禾木科、菊科、豆科、薯蓣科、葫芦科和蕃木瓜科。
谈及DNA序列或基因，本文所用的术语“分离的”意指用化学方法将序列从病毒的基因组提取出来，并将之纯化和或修饰，其程度为可以使其以适当的方向(即，有义或反义)插入本发明的载体中。本文所用的术语“嵌合的”是指两个或多个DNA序列连琐在一起，该DNA序列来自不同的来源、品系或种(即，来自细菌或植物)，或者指来自同一物种的两个或两个以上的DNA序列的连接方式不曾在天然基因组中出现过。因此，可用于本发明的DNA序列可以是天然存在的、半合成的或者是完全人工合成的DNA。该DNA序列可以是线状的或环状的，即可以位于完整的或线状的质粒如下文所述的二分质粒中。本文所用的术语“异源的”是指不相同，例如在核苷酸和/或氨基酸序列、表型或独立的分离型方面不同。本文所用的术语“表达”是指转录或在特定DNA分子翻译前的转录。
实践本发明所用的多数的重组DNA的方法均是标准方法，为本领域的技术人员所熟知，这些方法被详细描述于(例如)1986年11月29日公开的
发明者戴维·M·特里克里, 基姆·J·卡尼, 保罗·F·拉塞尔, 赫克托·D·奎马达, J·拉塞尔·麦克马斯特, 约翰·F·雷诺, 罗沙琳·Z·邓 申请人:赛迷尼思蔬菜种子公司