专利名称：牛白血病发病的可能性及抗性的定判定方法
技术领域：
本发明涉及对牛白血病病毒BLV所引发的白血病发病的可能性及抗性进行评价的方法。
背景技术：
主要组织相容性复合体(MHC)是在机体防御感染的机构中与识别自体-非自体成分相关的分子，它包括由α链和β2M构成的Ⅰ类分子和由α链、β链构成的Ⅱ类分子，在各自的α1、α2结构域和α1、β1功能存在与抗原肽结合的沟。并且有这样的特征T细胞受体只识别该结构才结合的肽片段，识别Ⅰ类分子的CD8+细胞可诱导细胞死亡(细胞免疫)、识别Ⅱ类分子的CD4+细胞主要诱导抗体产物(体液免疫)。
MHC是最具多态的基因群，其单元型(haplotyre)决定了肽容纳沟中这一空位的位置、形态、大小和性状的不同，与之相伴，嵌入的肽片段的结合状态亦变化，由此决定了每个个体的免疫应答和疾病的敏感性。谈到MHC单元型与疾病抗性(抗病性)或发病可能性(易病性)的相互关系，如有关于人类免疫缺陷病毒(HIV)，成人T细胞白血病病毒(HTLV)和疟疾的报告。
另一方面，对于牛MHC(BoLA)Ⅱ类基因，到目前为止，人们推测存在DQA、DQB、DRA、DRB、DNA、DOB、DYA和DYB基因。在DRB基因座中所鉴定出的3个基因(DRB1-B3)，已知DRB3能够编码功能性蛋白质，到目前为止，已明了存在73种等位基因。但是，尚无牛感染性疾病与牛MHC(BoLA)单元型相关性的报道。
特别是对于具有与人免疫缺陷病毒(HIV)同样的病毒增殖调节基因PD、与HTLV-1最近似的逆转录病毒牛白血病病毒(BLV)，有这样的报道，与牛MHC(BoLA)单元型相关，美国是抗病性的中心，而无与白血病发病可能性相关的报道。由该病毒所感染的牛的比例(日本的感染率)为10-20％，其中有1-2％，在10-15年的慢长潜伏期后发生极度恶性的地方性牛白血病，直至死亡，因此，该病毒给畜牧农民家带来很严重的经济损失。若能通过对牛MHC(MoLA)单元型进行分析，简单判定BLV感染后牛的发病可能性，就可能期待预选具有抗病性的牛进行饲养，从而能极安全地继续牛的饲养。
因此，本发明的目标是解析牛白血病病毒(BLV)与牛MHC(BoLA)单元型的相关性，提供用基因步骤学方法简单判定牛个体对牛白血病病毒(BLV)的白血病发病可能性及发病抗性的方法。另外，本发明的其它目标是提供对上述判定方法有用的引物对。
发明的公开本发明人首先解析了牛MHC(BoLA)Ⅱ类基因中DRB基因座的构造，阐明了DRB3基因(BoLA-DRB3)和该基因产物的构造(Biochem.Biophys.Res.Commun.,209。pp.981-988,1995)。本发明人再对该基因功能进行研究的过程中发现，在白血病发病牛和未发病牛中，在BoLA-DRB3中，尤其是在具有多态性的第二外显子(β1结构域)的基因产物中见到明确不用存在氨基酸序列的不同部分。另外，置换该氨基酸可见到对BLV的发病可能性及发病抗性直接相关。本发明基本完成了这些见解。
也就是说本发明提供了对牛白血病病毒BLV的白血病发病可能性的判定方法，即牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的75-78号氨基酸为特定Val-Asp-Thr-Tyr氨基酸序列的牛个体具有白血病的发病可能性。本发明的优选状态对感染了牛白血病病毒BLV的牛进行上述方法；并提供上述判定方法，两个等位基因和牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的75-78号氨基酸为特定氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的牛个体具有发病危险性。
此外，据本发明的其它状态，提供了判定牛对牛白血病病毒BLV的白血病发病可能性的方法，包括如下步骤(1)通过聚合酶链式反应(PCR)对从牛中分离出的基因组DNA进行扩增，制备出包含编码部分或全部牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的DNA的PCR产物的步骤；及(2)判定由包含上述PCR产物的DNA所编码的氨基酸序列中，相当于牛MHCⅡDRβ链β1结构域的75-78号氨基酸序列的氨基酸序列为Val-Asp-Thr-Tyr的牛具有白血病发病可能性的步骤。该方法的优选状态是包括用PstⅠ消化PCR产物的方法。
本发明的其它观点提供了判定牛对牛白血病病毒BLV的白血病发病抗性的方法，即提供这样的判定方法牛个体的牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val的牛具有白血病发病抗性。据本发明的优选状态，提供了对感染了牛白血病病毒BLV的牛实施上述方法；判定至少一方的等位基因中牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val的牛具有发病抗性的上述方法；并提供判定双方等位基因的牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val的牛发病抗性高的上述方法。
此外，据本发明的其它状态，可提供判定牛对牛白血病病毒BLV白血病发病抵抗的方法，包括如下步骤(1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从牛分离出的基因组DNA，制备包含编码牛MHCⅡDRβ链的β1结构域部分或全部的DNA的PCR产物的步骤；以及(2)判定由包含上述PCR产物的DNA所编码的氨基酸序列中，相当于牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸的氨基酸为Val的牛具有白血病抗性的步骤。该方法的优选状态是包括用PstⅠ消化PCR产物的步骤。
这些发明的优选状态，提供下述引物对和应用它们的上述方法，优选对各个感染了牛白血病病毒BLV的牛实施上述方法。此外本发明可提供判定牛对牛白血病病毒BLV白血病发病可能性时应用的系列引物，包含下面引物A和引物B的系列引物(1)-(3)。引物对(1)A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引的5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′引物对(2)A引物5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′引物对(3)A引物5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′及从 5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′构成的引物群中选择的引物。
B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
附图简述
图1是MHCⅡDRβ链的结构图。图中，(A)表示牛MHCⅡDRβ链mRNA的构造，(B)表示编码牛MHCⅡDRβ链cDNA全长及该基因产物的氨基酸序列，β1结构域是1-94号氨基酸序列形成的特定部分。
图2(A)-(C)是感染了牛白血病病毒BLV的未发病牛(A)为淋巴细胞增多症牛7头(B)和(C)是比较抗体阳性健康未发病牛24头，来源的牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的氨基酸(9-86号的特定氨基酸序列)的结果示意图。左侧的数字为牛的识别序号，图中氨基酸用单字符表示。
图3(A)和(B)是比较白血病发病牛(24头)来源的牛MHCⅡDRβ链β1结构域的氨基酸(9-86号特定的氨基酸序列)的结果图。左侧的数字为牛的识别序号，图中氨基酸用单字符表示。
发明的最佳实施方式本发明的方法是针对感染了牛白血病病毒BLV的牛或感染BLV的牛判定其白血病发病可能性的方法。另外本发明的其它方法是针对感染了牛白血病病毒BLV的牛或未感染BLV的牛判定其白血病发病抗性的方法。
本发明的优选状态是从牛分离出基因组DNA后，通过PCR特异性扩增编码部分或全部牛MHCⅡDRβ链β1结构域(DRB3基因的第二外显子)的基因，对所得PCR产物进行测序，推测β1结构域75-78号氨基酸的特定氨基酸序列。该氨基酸序列(氨基酸序号75-78)为Val-Asp-Thr-Tyr(用单字符表示为VDTY)的牛，无论其已经感染了牛白血病病毒BLV或是正感染牛白血病病毒BLV，该个体具有发生白血病的可能性。牛是否感染白血病病毒BLV，可用抗牛白血病病毒BLV抗体进行试验很容易地进行确认。
为了让上述判定更具准确性，优选对等位基因(单元型)进行上述氨基酸序列的比较。双方等位基因的氨基酸序列(氨基酸序号75-78)为Val-Asp-Thr-Tyr的时候(即VDTY纯合分子)无论该牛已感染了牛白血病病毒BLV或感染白血病病毒BLV的情况下，其白血病发病的危险性高。另一方面，当一方等位基因中氨基酸序列为Val-Asp-Thr-Tyr(VDTY)和Val-Asp-Thr-Val(VDTV)杂合；Val-Asp-Thr-Tyr(VDTY)和Val-Asp-Trg-Val(VDRV)杂合；Val-Asp-Thr-Val纯合；Val-Asp-Ang-Val(VDRV)纯合；或Val-Asp-Arg-Val(VDRV)和Val-Asp-Thr-Val(VDTV)杂合的时候，无论牛已感染了牛白血病病毒BLV还是感染BLV的情况下，其白血病的发病可能性非常低。
再从白血病发病抗性的观点来看，可推测β1结构域的氨基酸序号78为特定的氨基酸。该氨基酸(氨基酸序号78)为Val(用单字符表示为V)的牛无论其已经感染了牛白血病病毒BLV或是感染着BLV，该牛对白血病的发病具有抗性。判定抗性的过程中也最好比较等位基因中(单元型)的上述氨基酸，若等位基因中至少一个的β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val，该牛具有白血病发病抗性，若两个等位基因均有上述氨基酸Val，则该牛对白血病发病有高抗性。
间等(Aida,Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun,209,pp.981-988,1995)对牛MHCⅡDRβ链β1结构域的氨基酸序列有所报道。图1中显示了牛MHCⅡDRβ链mRNA的构造(A)和cDNA全长基因产物的氨基酸序列(B)。图中，β1结构域是1-94号氨基酸序列所形成的特定部分，该核苷酸序列及氨基酸序列表示的是75-78号氨基酸的肽序列为“Val-Asp-Thr-Tyr”时的序列。
本发明对作为判定对象的牛无特定限制，既有感染牛白血病病毒BLV的可能性，又有因感染BLV而发生白血病的可能性，乳肉种、乳肉兼用种、肉用种、役田种及役肉兼用种，无论哪一种均可。具体而言，如可列举黑毛日本种、日本短角等日本牛、荷斯坦牛、ジセジ-、福海特牛、安格斯牛、フリ-シセン等品种，但并不只限于这些品种。
从牛制备基因组DNA的样品可用未梢血和脏器等。脏器如可用淋巴结等的组织片。从上述样品中制备基因组DNA的方法，只要是本领域的人员可利用的方法无论哪一种均可。若用末梢血白细胞或末梢血淋巴细胞作样品的时候，如可用Hughes等的方法(Hughes,S.H.等，Cell,Is,pp.1397-1410,1978)。用脏器的时候，如可用刀片将冰冻的组织片切薄之后，通过十二烷基硫酸钠、酚-氯仿法(Mcknight,G.S.,Cell,14,pp.403-413,1978)进行制备。另外，也可用简便方法从细胞中提取基因组DNA，具体方法在实施例中有所描述。
用PCR扩增制备的基因组织DNA时所使用的引物，只要是能扩增包含编码牛MHCⅡDRβ链β1结构域75-78号部分氨基酸序列的基因或包含编码β1结构域全长的基因的DNA，无论哪种均可应用。
作为特别适用于本发明方法的引物对，可列举适用于循环测序法及Dynabeadl DNA直接测序等直接测序法的下述引物对(1)A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′；及B引物5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。另外，作为附加了限制性酶切位点的引物可用从引物对(2)A引物5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′及B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′或引物对(3)A引物5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′、5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′及5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′所形成的引物群中筛选出的引物；和B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。特别是用PstⅠ消化用引物对(3)所扩增的PCR等位基因，通过判定酶切方式的不同而简单判定牛是具有白血病抗性还是具有白血病发病的可能性。但本发明方法中所可能利用的引物和引物对并不限于此。
PCR法中所应用的DNA量可作适宜选择，如用末梢血白细胞或末梢血淋巴细胞时，可用到0.1～0.5μg。另外作为上面扩增的DNA(PCR产物)的测序法，可利用该领域内的工作者可能应用的任一种方法，如优选应用直接测序法。其具体例在实施例中有详细记录。但多数的牛为杂合体(heterozygote)，从父亲或母亲而来的等位基因的碱基序列不同，用直接测序法无论确定是哪一个等位基因的。这种情况下，可用限制性酶EcoRⅠ和SalⅠ消化用上述引物对(2)所扩增的PCR产物，之后在载体内进行亚克隆，通过只测定单方等位基因的碱基序列，进行比较，来确切测定另一个等位基因的碱基序列。为了更准确地获得基因情报，可用PCR产物对双方的等位基因进行亚克隆，分别测定其碱基序列。其具体方法及可能利用的引物在下面的实施例中有详细记载。
实施例以下通过本发明的实施例进行具体说明，但本发明的范围并不限定于下面的实施例。例1白血病发病可能性的讨论用加入了抗凝剂的注射器从作为样品的牛中抽取末梢血，4℃,3000rpm条件下离心20分钟，得到白细胞层，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤所分离的白细胞层，离心，所得细胞团作为末梢血白细胞样品。另外可用宫坂等的方法(Miyaaska,M.和Tmka.Z.,ImmunologicalMethods,Vol.3,pp.403-423,1085,Academic Press,NY)从与上面同样采取的末梢血中获得末梢血淋巴细胞，得到与上面同样的团块，从而制备出末梢血淋巴细胞的样品。另外，在4℃、1100 rpm条件下将BLV感染的悬浮细胞液离心5分钟，弃培养液，从PBS洗细胞，洗净后离心得到团块样品。由从发病的牛淋巴结和肿瘤组织分离出制备组织切片用的BLV感染淋巴肉瘤，无固定的情况下在液氮内速冻，-80℃保存，作为组织切片的样品。
在1.5ml的微离心管中，用PBS将上述各样品细胞洗2次，用旋涡振荡器将沉淀细胞悬浮到PBS中。在1×106个细胞中加入200μl 1×PCR缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,2.5mMMgCl2,0.5％Tween-20〕和1μl蛋白酶K(20mg/ml)，用旋涡振荡器再悬浮，56℃培养45-60分钟。由在95℃处理10分钟后，冰浴5分钟以上，用大约5-10μl，在PCR法中进行扩增。
在包含200μM的各种dNTR、0.2-0.4μM引物、2.5单位的Taq聚合酶(Gene Amp Kit；Perkin-Elmer Cetus)的50μl 1×PCR缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mMMgCl2,0.001％(w/v)明胶〕中溶解基因组DNA，以94℃1分、61℃1分、72℃1分为1个循环进行扩增，扩增25个循环，再在72℃处理5分钟。引物可用通过PCR法能对牛MHCⅡDRβ链β1结构域(BoLA β的βl结构域DRB3基因的第2外显子)进行特异扩增的以下引物，在B引物的5′末端进行特异的生物素化。该引物亦适用于循环测序法。
A引物A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引物5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′用100μl的2×结合-洗净用缓冲液(B&W缓冲液10mM Tris-HCl(pH7.5),1.0 mM EDTA,2M NaCl,0.1％Tween-20)洗净20μl的DYNAEADS M-280链霉亲合素(Dynal A.S,N-0212,Oslo,Nolway)，将上述PCR产物(50μl)加到该磁珠悬浮液中，用滴管缓缓滴入后，用旋转慢慢边搅拌边在室温培育15分钟。将含有固化的PCR产物的试管置于磁石上(Dynal MPC)，用吸管移去上清石，加入100μl的2×B&W缓冲液洗净磁珠。应用磁石再次将上清去除后，再悬浮到临时配制的0.1M NaOH 50μl中。
用磁石将固化了的磁珠聚集到试管壁上，除去上清，用50μl的0.1MNaOH洗涤磁珠1次，用100μl的1×B&W缓冲液洗3次，用50μl的TE缓冲液洗1次，得到生物素化的链。全部操作中，平稳的敲击进行再悬浮。再用100μl的蒸馏水洗净后除去上清，加入蒸馏水，调整容量用于测序。用BcaBEST双脱氧测序试剂盒(タカテ·バィォメディカルズ制)，按照附加的说明书中的条件进行测序。再者，作为测序引物应用以下引物。正向引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′反向引物5′-CAGGAAACACAGCTATGACC-3′结果如图2及图3所示(图中，牛MHCⅡDRβ链βl结构域的氨基酸序号为9-86，左侧的数字为牛的识别序号)。感染牛白血病病毒BLV后，将来源于白血病发病牛〔淋巴细胞增多症牛(癌前状态)7头、未发病牛(抗体阳性健康未发病牛)24头分别为图2的上段和下段〕和白血病发病牛(24头，图3)的牛MHCⅡDRβ链的βl结构域的氨基酸进行比较，结果发现白血病发病的双方等位基因中氨基酸序号75-78的序列有Val-Asp-Thr-Tyr(VDTY)突变这一极显著特征。相当于氨基酸序号75-78的部位，相当于βl结构域的α螺旋上有可能引起T细胞识别部位的作用。另外计算机分析的结果表明，该突变在牛白血病病毒BLV中仅存在于pol蛋白。
以上结果如表1所示。表中基因型VDTY/VDTY等表示方法是用一文字来表示两等位基因中的氨基酸序列(牛MHCⅡDRβ链βl结构域的75-78号氨基酸)。另外，BLV感染牛的感染状态是根据Levy等(Levy,D.,等，Int.J.Cancer,19,pp.822-827,1977)和间等(Aida,Y.等，Cancer Res.,52.pp.6463-6470,1992)的标准进行分类的。
表1BLV感染状态(阳性率)基因型 白血病发病 淋巴细胞增多症健康VDTY/VDTY 19/24 5/7 4/24VDTY/VDTY 2/24 2/7 2/24VDTY/VDRV 2/24 0/7 14/24VDRV/VDRV 0/24 0/7 1/24VDTV/VDTV 1/24 0/7 0/24VDTV/VDRV 0/24 0/7 3/24例2白血病发病抵抗的讨论与例1同样，对白血病发病牛(24头)、白血病未发病牛(淋巴细胞增多症和健康牛，其31头)的牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸的种类进行检测，结果如下面表2所示。另外，同样检测71号和74号氨基酸的种类(表中氨基酸用一文字表示。Y:Tyr,V:Val,R:Ang,E:Gllu,K:Lgs；N:Asn)。该结果表明，78号氨基酸为缬氨酸和酪氨酸杂分子的个体和78号氨基酸为缬氨酸纯分子的个体对白血病发病具有抗性，尤其是，78号氨基酸为缬氨酸纯分子的个体对白血病发病高抗性。另外还表明，白血病未发病牛的74号氨基酸均为Gln或Asn,71号氨基酸残基为Lys或Arg所以具有71号氨基酸为赖氨酸或精氨酸，74号氨基酸为谷氨酸或天冬酰胺且78号氨基酸为缬氨酸这样的个体对白血病发病具有高抗性。
表2基因型 BLV感染状态 阳性率Y78/Y78白血病发病牛 19/24V78/Y78白血病发病牛 4/24(R71-E74-V78/Y78: 3/24)(K71-E74-V78/Y78: 1/24)(K71-N74-V78/Y78: 0/24)V78/V78白血病发病牛 1/24(R71-E74-V78/R71-E74-V78: 1/24)(K71-E74-V78/K7M-E74-V78: 0/24)(K71-N74-V78/K71-N74-V78: 0/24)Y78/Y78白血病发病牛 9/31V78/Y78白血病发病牛 18/31(R71-E74-V78/Y78: 11/31)(K71-E74-V78/Y78: 4/31)(K71-N74-V78/Y78: 3/31)V78/V78白血病发病牛 4/31(R71-E74-V78/R71-E74-V78: 3/31)(K71-E74-V78/K71-E74-V78: 1/31)(K71-N74-V78/K71-N74-V78: 0/31)例3迅速判定发病可能性和抗性的方法如上，具有牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为Val这样基因的个体，对由牛白血病病毒引起的白血病具有抗性，而两个等位基因的78号氨基酸为Tyr的个体有发生白血病的可能性。因此可利用78号的等位基因为Val的基因中存在限制性酶PstⅠ酶切位点，而78号为Tyr的等位基因不存在PstⅠ酶切位点这一特点，用PstⅠ消化扩增了的PCR等位基因，根据切断方式的差异来简便判定牛个体是具有白血病抗性还是有白血病发病的可能性。
用以下引物作为PCR引物。
A引物DRB40:5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′DRB100: 5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′ERB3: 5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引物SRB3: 5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′PCR条件按例1的条件进行。具体而言，根据引物的不同组合，以下面的循环作一个循环扩增35个循环再在72℃处理10分钟。针对PCR10μl的体系，基因组DNA应用100ng。
DRB40/SRB3: 94℃1分，63℃2分，72℃2分DRB100/SRB3: 94℃1分，66℃2分，72℃2分ERB3/SRB3: 94℃1分，61℃2分，72℃2分经2％琼脂糖凝胶电泳确认上述PCR产物后，用限制性酶PstⅠ切断(12μl中，10×限制性酶用缓冲液1.2μl，扩增后DNA 6-7μl，限制性酶PstⅠ2单位，和H2O)。限制性酶反应终止后，将各待检的进行3％琼脂糖凝胶电泳，从而进行判定。结果如表3所示。
表3引物-PCR产物 PstⅠ片段的大小(bp)(bp)Y的等位基因 V的等位基因Y/YY/VDRB40/SRB3 247 199,48247 199,48247,199,48DRB100/SRB3187 139,48187 139,48139,187,48DRB100/SRB3*292 226,48274 226,48226,247,48*因为ERB3引物中存在PstⅠ酶切部位，所以每种情况下均包含18bp的片段。
产业上利用的可能性根据本发明的判定方法，可确实预知牛个体对牛白血病病毒BLV引发的白血病发病的可能性和抗性，可以进行安全饲养，从而可预防牧农家的经济损失。
权利要求
1．针对牛白血病病毒BLV判定牛白血病发病可能性的方法，其中判定牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的75-78号氨基酸为特定氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的牛个体有白血病发病可能性。
2．权利要求1的方法，其中判定两个等位基因的牛MHCⅡDRβ链β1结构域的75-78号氨基酸都为特定氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的牛有发病危险性。
3．针对牛白血病病毒BLV，判定牛的白血病发病可能性的方法，包含下面的步骤(1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从牛中分离出的基因组DNA，制备出包含编码牛MHCⅡDRβ链β1结构域一部分或全部的DNA的PCR产物的步骤；及(2)判定由上述PCR产物所包含DNA编码的氨基酸序列中，牛MHCⅡDRβ链β1结构域的75-78号氨基酸序列为Val-Asp-Thr-Tyr的牛有白血病发病可能性的步骤。
4．权利要求3的方法，包括用PstⅠ消化PCR产物的步骤。
5．针对牛白血病病毒BLV判定牛白血病发病抗性的方法，其中牛的牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val的个体判定为具有白血病发病抗性。
6．权利要求5的方法，判定至少一个等位基因中牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val的牛个体具有发病抗性。
7．权利要求5的方法，判定两个等位基因中牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为特定氨基酸Val的牛个体发病抗性高。
8．针对牛白血病病毒BLV判定牛对白血病发病的抗性的方法，包括下面的步骤(1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从牛中分离出的基因组DNA，从而制备出包含编码部分或全部牛MHCⅡDRβ链β1结构域的DNA的PCR产物的步骤；及(2)判定由上述PCR产物所包含的DNA所编码的氨基酸序列中，牛MHCⅡDRβ链β1结构域的78号氨基酸为Val的牛个体具有白血病发病抗性的步骤。
9．权利要求8的方法，包括用PstⅠ消化PCR产物的步骤。
10．判定牛对牛白血病病毒BLV所引发的白血病发病的可能性或抗性时所应用的引物对，包括(a)A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′(b)B引物5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
11．针对牛白血病病毒BLV判定牛的白血病发病可能性或抗性时所应用的引物对，包括(a)A引物5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′(b)B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
12．针对牛白血病病毒BLV，判定牛的白血病发病可能性或抗性时所应用的引物对，包括(a)从A引物5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′及5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′所组成的引物组中选择的引物；及(b)B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
全文摘要
针对牛白血病病毒BLV,判定牛的白血病发病可能性的方法,即判定牛的牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的75—78号氨基酸表示的为氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的个体,具有白血病发病可能性;以及针对牛白血病病毒BLV,判定牛的白血病发病抵抗的方法,即牛的牛MHCⅡDRβ链的β1结构域的78号氨基酸为氨基酸Val的个体,判定具有白血病发病抗性。
文档编号C12Q1/68GK1230228SQ9719780
公开日1999年9月29日 申请日期1997年7月17日 优先权日1996年7月19日
发明者间阳子 申请人:理化学研究所 被以下专利引用 (1),