专利名称：重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、产物制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组超氧化物歧化酶(SOD)基因序列以及工程菌的制备和产物的纯化方法。
自丝状兰藻-鱼腥藻(Anabaena sP.PCC7120)中获得一种超氧化物歧化酶，它是属于Fe-SOD类型，Fe-SOD在其199个氨基酸组成的肽链中与一个铁原子结合，由于铁的价态变化，能与超氧化物作用，从而减少超氧化物(O2·-，·OH和H2O2)对生物体内含有的双键物质的破坏，如对不饱的脂肪酸、核酸、碱基等。因此，SOD是生物体内维持各种代谢正常运转、抗衰老、抗氧化的重要参与物质，它催化的反应有
H2O2在体内过氧化氢酶或过氧化物酶的作用下产生水。因此，如用在皮肤表面可防止超氧化物对皮肤细胞的破坏，也防止对一些细胞中的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等的氧化产生黑色素，而使皮肤着色。皮肤或其它组织不正常地着色是黑色素类物质积累所致，名为黑变(melanism)。从而，SOD可用于化装品中起抗氧化作用，强光和紫外光可产生超氧化物。
也有些报道，在生物体中由于SOD减少或突变后可使肿瘤发生；微生物实验也表明它可延长微生物的寿命，抗衰老，在高的氧浓度下可起保护作用；也有报道SOD可保护神经细胞不受损伤。有些国家除外用外，还做成内服制剂来提高人的抗衰老作用。因此，这一蛋白将在医药上和农业上有潜在的应用前景。目前，SOD多从牛血中提取，由于含量少，提取制备产物属于劳动力密集型产品。
本发明目的是提供一种重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、产物制备方法。本方法系生物工程方法，简便、产量高用人少、价廉。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案重组超氧化物歧化酶的工程菌和产物制备方法包括以下几个步骤①制备鱼腥藻总DNA；②依纯化SOD蛋白的N端序列设计了5′端简并引物，又依其它来源的SOD蛋白保守区，设计了3′端引物；引物序列为xbaI
引物1.5′TCTAGA(AG) CA(AG) TA(TC) GG(AGCT) ATG AA 3′Bgl II引物2.3′AGATCTA (AG)TA (AGCT)GC (AG)TG (CT)TC CCA 5′③以总DNA为模板，以上述引物PCR扩增得SOD基因部分片段；④以SOD基因部分片段为探针与pSE380 DNA杂交，获得蛋白基因全序列；⑤从SOD全序列cDNA中，依成熟SOD蛋白基因序列设计引物，引物序列为NcoI引物35′TCA CCATGG CA TTT GTA CAG GAA C 3′BamHI引物43′CT GCATCC TA AGC TTT AGC ATA AT 5′以总DNA的SOD基因为模板，PCR扩增，获得成熟SOD基因序列和相应的氨基酸序列；扩增产物连接在NcoI/BamHI酶切后的pET3d上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即SOD的工程菌；⑥将工程菌在高密度培养基中培养，IPTG化学诱导表达，收集菌体，高压细胞破璧，破包含体。
以下结合实施例及附图对本发明作详细说明
图1.PCR扩增的成熟Fe-SOD基因及其在pET3d克隆后的酶切鉴定图2.SOD基因的pET3d表达载体的构建图谱图3.SOD基因在大肠杆菌BL21(DE3)的表达产物及纯化产物的电泳鉴定图谱。
图1中，1.标准DNA(入DNA/EcoRI+Hind III)，2.PCR扩增产物。3.克隆在pET3d后的酶切鉴定(NcoI+BamHI酶切)。
图3中，4.标准蛋白，5.空载pET3d的大肠杆菌全蛋白(对照)，6.含有SOD基因表达的大肠杆菌全蛋白，7.表达并破璧后的上清液，8.包含体蛋白，9.复性后的包含体蛋白，10、11纯化的SOD蛋白。
实施例1.
1.Fe-SOD基因的获得(1).制备鱼腥藻的总DNA100ml对数生长期的鱼腥藻，10000xg下收集藻体，在裂解缓冲液中(50mmol/L，Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)中用液氮冻融，再加入5mg/ml溶菌酶，37℃保温1小时，再用常规的抽提DNA方法获得总DNA。
(2).依纯化SOD蛋白的N端序列设计了5′端简并引物，又依其它来源的SOD蛋白保守区，设计了3′端引物；引物序列为xbaI引物1.5′TCTAGA(AG) CA(AG) TA(TC) GG(AGCT) ATG AA 3′Bgl II引物2.3′AGATCTA (AG)TA (AGCT)GC (AG)TG (CT)TC CCA 5′(3).以总DNA为模板，以上述引物PCR扩增得SOD基因部分片段。
(4).以SOD基因部分片段为探针与pSE380的DNA杂交，获得蛋白基因全序列。
(5).从SOD全序列cDNA中，依成熟SOD蛋白基因序列设计引物，引物序列为NcoI引物35′TCA CCATGG CA TTT GTA CAG GAA C 3′BamHI引物43′CT GCATCC TA AGC TTT AGC ATA AT 5′以总DNA的SOD基因为模板，PCR扩增结果见图1，获得成熟SOD基因序列和相应的氨基酸序列为5′ ATG GCA TTT GTA CAG GAA CCA CTA CCC TAC GAC TTT AAT GCT TTA GAG CAG TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Ala Phe Val Gln Glu Pro Leu Pro Tyr Asp Phe Asn Ala Leu Glu Gln TyrGGC ATG AAA GGT GAA ACC TTC GAG TAT CAC TAC GGC AAA CAT CAC AAA GCT TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Met Lys Gly Glu Thr Phe Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His Lys Ala TyrGTA GAT AAC CTG AAC AAG CTC ACC GAT GGT ACA GAA TTG GCT GAT AAA TCC TTA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Asp Gly Thr Glu Leu Ala Asp Lys Ser LeuGAA GAA GTC ATC CAA ATT GCC TTT AAG GAT GCC TAT AAA GCT GGA ATC TTT AAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Glu Glu Val Ile Gln Ile Ala Phe Lys Asp Ala Tyr Lys Ala Gly Ile Phe AsnAAC GCT GCT CAA GTG TGG AAC CAC ACC TTC TTC TGG AAT TCT TTA AAG CCC GCA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp Asn Ser Leu Lys Pro AlaGGT GGC GGC GCG CCT ACA GGT GAA TTC GCA GCC AAA ATT AAC CAA GAC TTT GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Glu Phe Ala Ala Lys Ile Asn Gln Asp Phe GlyAGC TTC GAC AAA TTG AAA GAA GAA TTT TCC AAC GCT GCT GCA ACT CAG TTC GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Phe Asp Lys Leu Lys Glu Glu Phe Ser Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe GlyAGC GGA TGG GCT TGG CTA ATT GAT GAT GGC GGT ACA CTG AAA GTC ACT AAA ACT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Gly Trp Ala Trp Leu Ile Asp Asp Gly Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys ThrCCA AAC GCC GAA AAT CCC CTG GCT CAT GGA CAA AAA GCA CTC TTA ACC TTG GAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Asn Ala Glu Asn Pro Leu Ala His Gly Gln Lys Ala Leu Leu Thr Leu AspGTC TGG GAA CAC GCC TAC TAC ATC GAC TTC AGA AAT GCT CGC CCA GCT TTT ATC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Ile Asp Phe Arg Asn Ala Arg Pro Ala Phe IleAAG AAC TAC TTA GAT AAC TTG GTT AAC TGG GAC TTT GCT GCT GCG AAT TAT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Lys Asn Tyr Leu Asp Asn Leu Val Asn Trp Asp Phe Ala Ala Ala Asn Tyr AlaAAA GCT TAG 3′--- --- ---Lys Ala***2.Fe-SOD基因克隆和表达回收产物连接在经NcoI/BamHI酶切的PET3d表达载体上，可以用T4接连酶连接到pET3d的相应位点上(见图2)。制备大肠杆菌BL21感受态细胞，进行转化，进行阳性克隆筛选。将工程菌三级培养，一、二级用LB培养基，三级用高密度培养基，工程菌高密度的培养基配方为硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升；磷酸二氢钾3.0克/升，柠檬酸钠0.5克/升；硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升；胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物2.0-10.0克/升；葡萄糖80.0-100.0克/升；微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)各10-5-10-4克分子/升。
在含有Amp的LB液体培养基上37℃振荡培养，菌体达对数生长期时加入IPTG达0.5mmol/L，再培养2-4小时，收集菌体。表达量用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，鉴定结果见图3。产物已被大量表达，表达量约占菌体蛋白40％以上。
3.产物纯化表达后的湿菌体悬浮于20mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)中，内含0.1mmol/L EDTA，用高压细胞破碎仪破细胞璧，离心去细胞碎片，收集包含体，包含体用含有8mol/L尿素的磷酸缓冲液悬浮，离心去不溶物，透析，复性后经DEAE-Sephadex A-50柱层析，柱用20mmol/L-200mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8，内含0.1mmol/L EDTA)梯度洗脱，收集有SOD活性部分(第三峰)，进行纯度鉴定(见图3)。
4.活性测定依Steward和Bewleyz(1980)方法，在3ml反应混合液中含有13mmol/L蛋氨酸，75μmol/L氮兰四唑，2μmol/L核黄素，100nmol/LEDTA和适量酶液，照光(30W)30℃下保温25分钟，测定560nm的OD值，以不照光的混合液为对照，以照光不加酸的混合液为100％，加酶后反应抑制50％的酶量为一个活性单位。依上方法纯化的SOD比活性为2500单位/mg蛋白。
本发明优点①首次从丝状兰藻中获得Fe-SOD基因。
②由于使用高密度培养基，菌体产量高，每升培养基可产湿菌体60-70克。
③载体构建合理，工程菌的产物表达量高，约占菌体可溶蛋白的40％，有利于工业化生产。
④纯化工艺简单，一步纯化即可达到电泳纯产品。
本基因序列已在Gen Bank注册。
权利要求
1.一种重组超氧化物歧化酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为5′ ATG GCA TTT GTA CAG GAA CCA CTA CCC TAC GAC TTT AAT GCT TTA GAG CAG TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Ala Phe Val Gln Glu Pro Leu Pro Tyr Asp Phe Asn Ala Leu Glu Gln TyrGGC ATG AAA GGT GAA ACC TTC GAG TAT CAC TAC GGC AAA CAT CAC AAA GCT TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Met Lys Gly Glu Thr Phe Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His Lys Ala TyrGTA GAT AAC CTG AAC AAG CTC ACC GAT GGT ACA GAA TTG GCT GAT AAA TCC TTA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Asp Gly Thr Glu Leu Ala Asp Lys Ser LeuGAA GAA GTC ATC CAA ATT GCC TTT AAG GAT GCC TAT AAA GCT GGA ATC TTT AAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Glu Glu Val Ile Gln Ile Ala Phe Lys Asp Ala Tyr Lys Ala Gly Ile Phe AsnAAC GCT GCT CAA GTG TGG AAC CAC ACC TTC TTC TGG AAT TCT TTA AAG CCC GCA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp Asn Ser Leu Lys Pro AlaGGT GGC GGC GCG CCT ACA GGT GAA TTC GCA GCC AAA ATT AAC CAA GAC TTT GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Glu Phe Ala Ala Lys Ile Asn Gln Asp Phe GlyAGC TTC GAC AAA TTG AAA GAA GAA TTT TCC AAC GCT GCT GCA ACT CAG TTC GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Phe Asp Lys Leu Lys Glu Glu Phe Ser Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe GlyAGC GGA TGG GCT TGG CTA ATT GAT GAT GGC GGT ACA CTG AAA GTC ACT AAA ACT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Gly Trp Ala Trp Leu Ile Asp Asp Gly Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys ThrCCA AAC GCC GAA AAT CCC CTG GCT CAT GGA CAA AAA GCA CTC TTA ACC TTG GAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Asn Ala Glu Asn Pro Leu Ala His Gly Gln Lys Ala Leu Leu Thr Leu AspGTC TGG GAA CAC GCC TAC TAC ATC GAC TTC AGA AAT GCT CGC CCA GCT TTT ATC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Ile Asp Phe Arg Asn Ala Arg Pro Ala Phe IleAAG AAC TAC TTA GAT AAC TTG GTT AAC TGG GAC TTT GCT GCT GCG AAT TAT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Lys Asn Tyr Leu Asp Asn Leu Val Asn Trp Asp phe Ala Ala Ala Asn Tyr AlaAAA GCT TAG 3′--- --- ---Lys Ala***
2.一种重组超氧化物歧化酶基因序列、工程菌及其产物制备方法，其特征在于它包括以下几个步骤①制备鱼腥藻总DNA；②依纯化SOD蛋白的N端序列设计了5′端简并引物，又依其它来源的SOD蛋白保守区，设计了3′端引物；引物序列为xbaI引物1.5′TCTAGA(AG) CA(AG) TA(TC) GG(AGCT) ATG AA3′Bgl II引物2.3′AGATCTA (AG)TA (AGCT)GC (AG)TG (CT)TC CCA 5′③以总DNA为模板，以上述引物PCR扩增得SOD基因部分片段；④以SOD基因部分片段为探针与pSE380 DNA杂交，获得蛋白基因全序列；⑤从SOD全序列cDNA中，依成熟SOD蛋白基因序列设计引物，引物序列为NcoI引物35′TCA CCATGG CA TTT GTA CAG GAA C 3′BamHI引物43′CT GCATCC TA AGC TTT AGC ATA AT 5′以总DNA的SOD基因为模板，PCR扩增，获得成熟SOD基因序列和相应的氨基酸序列；扩增产物连接在NcoI/BamHI酶切后的pET3d上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即SOD的工程菌；⑥将工程菌在高密度培养基中培养，IPTG化学诱导表达，收集菌体，高压细胞破璧，破包含体。
3.按权利要求2所述的重组SOD工程菌及其产物的制备方法，其特征在于所述的产物经透析后在DEAE-Sephadex A-50柱层析，产品被纯化。
4.按权利要求2所述的重组SOD工程菌及其产物的制备方法，其特征在于所述工程菌高密度的培养基配方为硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升；磷酸二氢钾3.0克/升，柠檬酸钠0.5克/升；硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升；胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物2.0-10.0克/升；葡萄糖80.0-100.0克/升；微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)各10-5-10-4克分子/升。
全文摘要
一种重组超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌产物制备方法。其基因自丝状兰藻—鱼腥藻的总DNA中获得,克隆到pET3d载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)上,得工程菌。将工程菌高密度培养,用IPTG诱导后,基因大量表面。产物经DEAE－SephadexA－50柱层析,产物一种重组超氧化物歧化酶被纯化。采用本发明的方法,准确获得含有199个氨基酸残基的成熟蛋白序列,该酶具有抗氧化、抗衰老作用,在医药和农业上有潜在的应用前景。本方法菌体产量高,表达量高,产物表达量占菌体可溶蛋白的40%,占包含体约为60%,纯化容易,酶活性高。
文档编号C12P21/02GK1263158SQ9910072
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月11日 优先权日1999年2月11日
发明者赵进东, 吴光耀, 刘迎芳 申请人:吴光耀