专利名称：免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鉴定、生产和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性降低的新葡激酶衍生物，它们能通过连续输注或单次静脉内大剂量注射施用，涉及它们的鉴定、生产和在治疗动脉血栓形成中的应用，涉及用于治疗动脉血栓形成的药用组合物的制备。本发明更特别地涉及基因工程葡激酶衍生物在制备治疗心肌梗塞的药用组合物中的应用。
葡激酶，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的某些株产生的一种蛋白质，在超过40年前就证明其具有纤维蛋白溶解特性(1，2)，似乎成为急性心肌梗塞患者中的强溶栓剂(3，4)。已经从噬菌体sakΦC(5)和sak42D(6)中以及从溶原性金黄色葡萄球菌株的基因组DNA(sakSTAR)中(7)克隆了葡激酶基因。葡激酶基因编码一种163个氨基酸的蛋白质，氨基酸28对应于全长成熟葡激酶的NH2端残基(6，8，9)。
图1显示了野生型变体SakSTAR的成熟蛋白质序列(9)。在sakΦC、sak42D和sakSTAR基因的编码区中只发现了四个核苷酸差异，其中之一构成沉默突变(6，8，9)。在血浆环境中，葡激酶能够溶解纤维蛋白凝块而没有相关的纤维蛋白原降解(10-12)。葡激酶的这种纤维蛋白特异性是α2-抗纤溶酶对与纤维蛋白结合的纤溶酶。葡激酶复合物抑制降低、α2-抗纤溶酶抑制后葡激酶从纤溶酶。葡激酶复合物中的再循环、以及α2-抗纤溶酶防止循环纤溶酶原。葡激酶转化为纤溶酶。葡激酶的结果(13-15)。另外，葡激酶对循环纤溶酶原具有弱亲和力，但对纤维蛋白原结合的纤溶酶原具有高亲和力(16)，葡激酶需要纤溶酶的NH2端加工来显示其纤溶酶原激活能力(17)。在几种实验动物模型中，葡激酶在全血或血浆凝块的溶解方面与链激酶似乎是同等的，但在富含血小板或回缩的血栓溶解方面明显强于后者(18，19)。葡激酶是一种异源蛋白质，在人中是有免疫原性的。葡激酶的固有的免疫原性，象链激酶一样，显然阻碍了其非限制性应用。不仅先前存在高抗体效价的患者难以用这些药剂的溶栓作用治疗，而且可能发生变应性副作用和偶然的危及生命的过敏反应(20)。因为链激酶和葡激酶都是异源蛋白质，所以显然它们的免疫原性不能通过蛋白质工程降低。实际上，未曾报道过从链激酶产生活性低分子量片段的成功尝试。对于葡激酶，NH2端17个氨基酸或COOH端2个氨基酸的缺失使分子失活，另外它对位点专一诱变灭活是极敏感的(21)。
因此，本发明的目的在于提供优选地具有较高比活和／或较低血浆清除率和／或增强的溶栓能力的葡激酶的低免疫原性变体。
在最终导致本发明的研究中，已经发现野生型葡激酶变体SakSTAR(9)含有三个非重叠的优势免疫表位，其中至少两个可被特殊定点诱变消除，而不灭活分子。这已在EP-95200023．0中公开(22)。正如在兔和狒狒模型中和在外周动脉阻塞患者中所证明的，这些工程化葡激酶变体与用野生型葡激酶治疗的患者中产生的抗体是低反应性的，并且比野生型葡激酶有明显低的免疫原性(22)。
本发明涉及用于鉴定、生产和应用与野生型葡激酶相比显示降低的抗原性和免疫原性的葡激酶衍生物，及用于用聚乙二醇选择性衍生的变体的总方法。这些衍生物优选地具有较高的比活和／或较低的血浆清除率和／或增强的溶栓能力。这些衍生物基本上具有野生型葡激酶或其修饰形式的氨基酸序列和基本上完全的生物活性，但与一系列鼠单克隆抗体和／或与用野生型SakSTAR治疗在患者中诱导的抗体的反应性降低。聚乙二醇取代(“PEG 化”)的变体具有降低的血浆清除率，使其特别适用于单次静脉内大剂量施用。也能使用其它药学可接受的大分子代替PEG。
更特别地，本发明提供葡激酶衍生物SakSTAR(K35X，G36X，E65X，K74X，E80X，D82X，K102X，E108X，K109X，K121X，K130X，K135X，K136X，+137X)，其具有如图1所示的氨基酸序列，其中位点35的Lys、位点36的Gly、位点65的Glu、位点74的Lys、位点80的Glu、位点82的Asp、位点102的Lys、位点108的Glu、位点109的Lys、位点121的Lys、位点130的Lys、位点135的Lys和／或位点136的Lys中的氨基酸被替换为其它氨基酸，和／或其中在COOH端添加一个氨基酸，从而改变了向患者施用后的免疫原性，而不明显降低比活。
本发明进一步优选的实施方案是表1、3、4、5、6、7、8、B、19和20中列出的葡激酶衍生物，其具有如图1所示的氨基酸序列，其中指定的氨基酸被替换为其它氨基酸，从而降低了用葡激酶治疗的患者血浆中SakSTAR特异性抗体的吸附，而不降低比活。
比活升高而免疫原性降低的衍生物是下列衍生物SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(K35A)、saksTAR(E8OA)、SakSTAR(D82A，S84A)、SakSTAR(T90A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(K130A)、SakSTAR(V132A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(G36R)、SakSTAR(H43R)、SakSTAR(G36R，K74R)、SakSTAR(K35E)、SakSTAR(K74Q)、SakSTAR(K130T)、SakSTAR(V132L)、SakSTAR(V132T)、SakSTAR(V132N)、SakSTAR(V132R)、SakSTAR(K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，K13OT，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，H43R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K86A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，T71S，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，V132R，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，T90A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K109A，K130，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E108A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K121A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，+137K)、SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65S，K74R E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(S34G，G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65N，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K57A，E58A，E61A，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，S103A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R，K136A)、SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
其中，编码为SY19的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和编码为SY161的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)是特别优选的。
除了上述置换衍生物之外，本发明还涉及另外氨基酸被Cys置换的衍生物。这类置换可导致二聚化和／或增高的比活和／或降低的清除率和／或增强的溶栓能力。当用聚乙二醇取代衍生物时特别获得降低的血浆清除率。
这些葡激酶衍生物的优选实施方案是其中Cys被分子量可达20kDa的聚乙二醇化学修饰的衍生物。在特别的实施方案中，NH2端区10个氨基酸中选择的氨基酸被置换为用分子量可达20kDa的聚乙二醇化学修饰的Cys。这些衍生物的特征在于以降低的剂量单次静脉内大剂量施用后明显降低的血浆清除率和保持的溶栓能力。
更特别地，位点2或3的丝氨酸被置换为半胱氨酸，而该半胱氨酸已用分子量5、10或20kDa的聚乙二醇化学修饰。这些衍生物的优选实施方案是如表20所示的SY161(S3C-MP5)、SY161(S3C-P10)、SY161(S3C-P20)、SY19(S3C-MP5)、SY19(S3C-SP5)、SY19(S2C-SP5，S3C-SP5)、SY19(S3C-P20)、SY19(S3C-P10)。
半胱氨酸的存在使得能形成本发明的两种葡激酶衍生物的二聚体。
本发明也涉及一种生产本发明的衍生物的方法，包括制备至少包含提供生物活性的葡激酶编码序列部分的DNA片段；对该DNA片段进行体外定点诱变，将野生型氨基酸的一种或多种密码子替换为另一种氨基酸的密码子；在适当的载体中克隆突变的DNA片段；用该载体转化或转染适当的宿主细胞；在适于表达该DNA片段的条件下培养该宿主细胞；将表达的葡激酶衍生物纯化为均一的，和用聚乙二醇衍生该变体。
该DNA片段优选地是质粒pMEX602sakB(22，23)的453bpEcoRI-HindⅢ片段，体外定点诱变优选地通过剪接重叠延伸聚合酶链反应进行。这种重叠延伸PCR优选地用可获得的或产生的野生型SakSTAR或SakSTAR变体作为模板，用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)或Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)进行(24)。
本发明也涉及包含至少一种根据本发明的葡激酶衍生物与适当赋形剂的药用组合物，其用于动脉血栓形成的治疗。含有低免疫原性葡激酶变体或“PEG 化”的葡激酶变体作为有效成分，用于治疗人的动脉血栓形成或兽医实践的药用组合物，可以采用粉末或溶液的形式，并可用于静脉内、动脉内或肠胃外施用。这些组合物的制备可通过将活性化合物与药学可接受的中性赋形剂(如水性或非水性溶剂、稳定剂、乳化剂、去污剂、添加剂)结合(例如混合、溶解等)，另外，必要时与染料结合。
此外，本发明还涉及葡激酶衍生物治疗动脉血栓形成尤其是心肌梗塞的用途，涉及葡激酶衍生物制备用于治疗动脉血栓形成尤其是心肌梗塞的药用组合物的用途。在上文和下文中，术语“衍生物”、“突变体”和“变体”可交换使用。
根据本发明，其它变体和改进对于本领域的技术人员是显然的。因此随机诱变可能产生免疫原性降低和功能活性可能升高的其它变体，而缺失或置换为其它氨基酸可产生具有降低的免疫原性的其它变体。
本发明将在下列实施例中更详细地证明，然而这不是意在限制本发明的范围。在实施例中，参照下列附图图1．野生型葡激酶SakSTAR的蛋白质序列。编号从成熟全长葡激酶的NH2端氨基酸开始。
图2．对外周动脉阻塞患者动脉内输注SakSTAR(空心圆，n=9)、SakSTAR(K74A)(实心圆，n=11)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(空心正方形，n=6)后，中和活性(左图)和抗施用试剂的特异IgG(右图)的时程。数据表示中值和四分位数间距，单位为μg／ml。
图3．野生型葡激酶、具有指定的氨基酸置换的SakSTAR的蛋白质序列。
正方形单氨基酸置换；圆形组合的(2-3个)氨基酸向Ala的置换。
图4．SakSTAR，(A)；SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)，(B)；SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，(C)；和SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)，(D)的温度稳定性。(○)4℃；(●)20℃；(_)37℃；(_)56℃；(□)70℃。
图5．对外周动脉阻塞患者动脉内输注SakSTAR(圆形，n=6)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)(正方形，n=6)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(三角形，n=6)后，中和活性(左图)和抗施用试剂的特异IgG(右图)的时程。数据表示中值和15-85百分范围，单位为μg／ml。
实施例实施例1野生型葡激酶的表位作图用BIAcore仪器(Pharmacia，Biosensor AB，Uppsala，瑞典)，经实时生物特异性相互作用分析(BIA)，测定抗野生型SakSTAR的一系列15种鼠MAb(22)的表位特异性。如厂商推荐，用胺偶联试剂盒(Pharmacia，Biosensor AB)如厂商推荐将这些MAb固定于Sencor Chip CM5的表面(25)。在6分钟内，以5μL／分钟的流速，以在pH5．0的10mmol／L乙酸钠中20μg／mL的浓度，从蛋白质溶液中进行固定。这导致5000-10000共振单位(RU)的抗体(相当于0．035-0．07pmol／mm2)的共价连接。SakSTAR溶液在20℃下连续流动通过传感器表面。溶于10mmol／LHEPES、3．4mmol／L EDTA、0．15mol／L NaCl和0．005％表面活性剂P20，pH7．2中的至少四个浓度的每种分析物(范围，50nmol／L-50mol／L)在6分钟内以5μL／分钟的流速注射到缔合相中。然后将样品替换为缓冲液，同样是在6分钟内以5μL／分钟的流速。每一循环后，传感器芯片表面通过注射5μL 15mol／L HCl再生。表观缔合(kass)和表观解离(kdiss)速率常数如另文(26)详述由sensorgram得出，缔合平衡常数(KA)计算为其比率。
野生型和变体SakSTAR与固定化的(insolubilized)MAb结合的平衡缔合常数的测定(表1)得出107-108(mol／L)-1的表观缔合常数，这比以前对这些MAb与固定野生型SakSTAR结合获得的表观缔合常数(22)低一到两个数量级。如果固定MAb而非SakSTAR变体是固定化的，则可避免二价MAb的亲合作用。该值确实极好地符合MAb的已知缔合常数，因此在本发明中使用其“相反”过程。
在表中，标明“变体”的列说明多种葡激酶衍生物，它们的识别方法是在括号中以单字母符号列出被置换的氨基酸，随后是其在成熟葡激酶序列的位置号，再之后是单字母符号的替换氨基酸；列“Exp．”表明表达水平，单位为mg／L，列“比活”表明如实施例2所述的内部单位(HomeUnit)的比活。标识“17G11”、“26A2”等是指如参考文献22所述可与指定的表位Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ结合的单克隆抗体。表位I可被抗体簇17G11、26A2、30A2、2B12和3G10识别，而表位Ⅱ可被抗体簇18F12、14H5、28H4、32B2和7F10识别，表位Ⅲ可被抗体簇7H11、25E1、40C8、24C4和1A10识别。人血浆“库”表明最初16名和随后10名通过SakSTAR治疗免疫的患者的血浆库，“亚库B”表明吸附少于50％的用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)诱导抗体的三名患者的血浆库，“亚库C”表明吸附＞90％的用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)诱导抗体的三名患者的血浆库(22)。
在表6、7和8中，也使用通过SakSTAR治疗免疫的40名患者血浆的另一种库(库40)。实施例2葡激酶“带电簇-丙氨酸”突变体的“丙氨酸-野生型”回复变体的构建、用鼠单克隆抗体的表位作图和免疫患者合并血浆的吸附1．引言如上所述，野生型葡激酶(SakSTAR变体(9))含有三个非重叠的优势免疫表位，其中的两个能通过两个(K35A，E38A或E80A，D82A)或三个(K74A，E75A，R77A)带电氨基酸簇被替换为Ala的特殊定点置换消除(22)。组合突变体SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)，其中Lys35、Glu38、Lys74、Glu75和Arg77被替换为Ala，和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)，其中Lys74、Glu75、Arg77、Glu80和Asp82被替换为Ala(以前分别称为SakSTAR．M3．8和SakSTAR．M8．9(22))，发现它们与抗三个优势免疫表位之中两个的鼠单克隆抗体的反应性降低，并且平均仅吸附用野生型SakSTAR治疗的16名患者中产生的2／3的中和抗体(22)。在兔和狒狒的实验血栓溶解模型中和在外周动脉阻塞患者中，这些突变体也诱导比野生型SakSTAR更少的抗体形成(22)。然而，它们的比活降低为野生型SakSTAR的大约50％，这将在这些化合物的临床应用方面受到一定程度的关注。
在提高活性和稳定性而不丧失降低的抗体识别的尝试中，研究了这些置换氨基酸中的一种或多种向野生型残基系统回复的影响。构建、纯化并在比活、与一系列鼠单克隆抗体的反应性、用野生型SakSTAR治疗的患者血浆中抗体的吸附等方面表征了14个新突变体(表1)，本实施例因此集中于丙氨酸向以上所列SakSTAR的7种氨基酸即K35、E38、K74、E75、R77、E80和D82中的一个或多个野生型残基的回复。2．试剂与方法本研究中使用的所有试剂的来源以前已报道(22)。限制酶购自Pharmacia(Uppsala，瑞典)或Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)。T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和碱性磷酸酶从Boehringer Mannheim获得。酶促反应用供应商建议的条件进行。质粒DNA用QIAGEN纯化方案(Westburg，Leusden，荷兰提供)分离。pMEX．602sakB(即pMEX．SakSTAR)如另文所述(23)构建。SakSTAR、SakSTAR(K35A，E38A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)如另文所述(22)产生并纯化。大肠杆菌的转化用磷酸钙法进行。DNA测序用双脱氧链终止反应法和自动激光荧光A．L．F．TM(Pharmacia)进行。显色底物(S2403)L-焦谷氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-赖氨酸-对硝基苯胺盐酸盐购自Chromogenix(比利时)。125I标记的纤维蛋白原购自Amersham(UK)。本实施例中使用的其它所有方法都曾在以前描述(22，27)。3．表达质粒的构建以可获得的或产生的SakSTAR变体作为模板，用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Leusden，荷兰)，通过剪接重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)(24)构建编码SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(E75A)的质粒。PCR扩增两个片段，第一个用引物5’-CAGGAAACAGAATTCAGGAG-3’从葡激酶基因的5’端开始到待诱变区(正向引物)，第二个用引物5’-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3’从相同区(反向引物)到葡激酶基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重叠区(引物未显示)。然后用Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)以新的无引物PCR将两个纯化片段装配在一起。7个循环(94℃1分钟，70℃1分钟)后，通过向PCR反应液中加入5’和3’末端引物(见上)并循环25次(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟)再扩增延伸产物。纯化终产物，用EcoRI和HindⅢ消化，并克隆到pMEX602sakB的相应位点。编码SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)的质粒的装配方法包括，用BpmI消化pMEX602sakB和pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)，该酶在SakSTAR的K35和E38密码子之间切开，并连接所需的片段。编码SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)的质粒的构建方法包括，用BpmI消化pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和pMEX．SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，并再连接所需的片段。编码SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)的质粒的构建方法是，用pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)作为模板进行两个PCR，随后是限制连接和向pMEX602sakB的再克隆。4．SakSTAR变体的表达和纯化如下所述，从在LB培养基中[SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K74A)、SakSTAR(E75A)和SakSTAR(E75A，D82A)或在优质肉汤(TB)(28)培养基中[SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E80A)和SakSTAR(D82A)]生长的转化大肠杆菌WK6中表达并纯化SakSTAR变体。
对于LB培养基中产生的衍生物，用20mL等份过夜饱和培养物接种2L体积的含100μg／mL氨苄青霉素的LB培养基。37℃温育3小时后，加入IPTG(200μmol／L)诱导从tac启动子开始的表达。生产阶段可进行4小时，之后以4000转每分离心20分钟沉淀细胞，重悬浮于1／20体积(100mL)的0．01mol／L pH6．5磷酸缓冲液中，并通过在0℃超声处理破碎。20000转每分离心20分钟除去细胞碎片，将含有胞质可溶蛋白质部分的上清液贮存于-20℃直到纯化。
对于TB培养基中产生的衍生物，用4mL等份过夜饱和LB培养基培养物接种2L含100μg／mL氨苄青霉素的优质肉汤培养液。在30℃剧烈通气下培养该培养物20小时。离心沉淀细胞，重悬浮于1／10体积(200mL)的0．01mol／L pH6．5磷酸缓冲液中，并通过在0℃超声处理破碎。然后以20000转每分离心悬液20分钟，将上清液贮存于-20℃直到纯化。含有SakSTAR变体的澄清细胞裂解液在1．6×6cm SP-Sephadex柱上进行层析，随后在1．6×5cm Q-Sepharose柱上层析[变体SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)]，或在1．6×6cm苯基-Sepharose柱上层析[变体SakSTAR(K35A，E38A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(K74A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)和SakSTAR(E75A，D82A)]。合并经SDS凝胶电泳定位、含有SakSTAR的级分用于进一步分析。5．物理化学和生物化学分析根据Bradford(29)测定蛋白质浓度。SakSTAR溶液的比活用显色底物试验测定，该试验用80μL SakSTAR溶液和如另文所述(30)制备的100μL Glu-纤溶酶原溶液的混合物(终浓度0．5μmol／L)在微量滴定板中进行。37℃温育30分钟后，通过加入20μL S2403(终浓度1mmol／L)并测定405nm的吸光度定量产生的纤溶酶。活性以内部单位(HU)表示，比较根据氨基酸组成测定(7)，每mg蛋白质推定100，000HU(100kHU)活性的内部标准(lot STAN5)。使用10-15％梯度凝胶和考马斯亮蓝染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)进行SDS-PAGE。通过在1％ SDS和1％二硫苏糖醇存在下于100℃加热3分钟进行样品的还原。用显色底物试验测定的不同SakSTAR突变体的比活总结于表1中。6．与鼠单克隆抗体的结合与以前的发现(22)一致，SakSTAR(K74A，E75A，R77A)不与识别表位Ⅰ的5种MAb中的4种反应，而SakSTAR(K35A，E38A)不与识别表位Ⅲ的5种MAb中的3种反应，SakSTAR(E80A，D82A)不与这5种中的4种反应。这些降低的反应性在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)中累加。SakSTAR(K74A，E75A，R77A)的降低的反应性在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)和SakSTAR(K35A，E75A，R77A)中完全保留，在SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)和SakSTAR(E75A)中大部分保留，但在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)和SakSTAR(K74A)中保留很少，表明E75是识别SakSTAR表位I的4种MAb结合的主要贡献者。然而，令人吃惊地，表位Ⅰ抗体与SakSTAR(E75A，D82A)的结合在由具有确定DNA序列的表达质粒的两种独立制备中正常。表位Ⅲ的3种MAb与SakSTAR(K35A，E38A)的降低的反应性需要K35和E38两者，这用SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)，用SakSTAR(E38A，E75A)和SakSTAR(K35A，E75A)，用SakSTAR(E38A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E75A，R77A)得到证明。簇Ⅲ的4种MAb与SakSTAR(E80A，D82A)的降低的反应性在SakSTAR(D82A)中保留，但在SakSTAR(E80A)中不保留。7．通过用野生型SakSTAR治疗在患者中产生的抗体的吸附使用用SakSTAR治疗(4，31)数周后获得的16名急性心肌梗塞患者的血浆样品。这些样品的葡激酶中和活性如下测定。向300μL柠檬酸盐人血浆和50μL缓冲液或待测血浆的混合液中加入渐增浓度的野生型或变体SakSTAR(50μL体积，含有0．2-1000μg／mL)，随后立即加入100μL含有凝血酶(50NIH单位／mL)和CaCl2，(25mmol／L)的混合液。测定血浆凝块溶解时间，并对SakSTAR部分的浓度作图。从该曲线确定20分钟后引起完全凝块溶解的葡激酶部分的浓度。中和活性效价确定为待测血浆与缓冲液值之间的差，并以μg每mL待测血浆表示。另文(22)曾报道了个体患者的结果。对于本发明，制备三种血浆库，一种来自于可获得充足残余血浆的10名患者，一种来自于用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附少于50％抗体的三名患者(亚库B)，一种来自于用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞90％抗体的三名患者(亚库C)。稀释这些血浆库(1／30-1／200)直到它们在BIAcore仪器中与SakSTAR置换芯片的结合总计达大约2000RU。用另外一系列两倍稀释液从该稀释液中构建抗体结合的校准曲线。这些血浆库用100nmol／L SakSTAR变体吸附10分钟，测定与固定化SakSTAR的残余结合。用校准曲线以未吸附血浆的百分数表示残余结合。
结果总结于表1中。野生型SakSTAR吸附10名患者合并血浆中超过95％的结合抗体，用SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)观察到不完全的吸附(＜60％)，但用SakSTAR(K35A，E38A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)和SakSTAR(E75A，D82A)吸附几乎是完全的。这些结果令人惊奇地证明，由于用野生型SakSTAR治疗在患者中产生的抗体的大约40％在结合方面依赖于K74(表1)。用3名患者的合并血浆-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＜50％的抗体(亚库B)-的吸附证实了K74对于抗体识别的重要作用。如预期的，对于所有待测变体，用3名患者的合并血浆-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞90％的抗体(亚库C)-的吸附几乎是完全的。实施例3SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A)与SakSTAR在外周动脉阻塞患者中的溶栓能力和免疫原性比较1．体内应用的SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A)的纯化如上所述，变体SakSTAR(K74A，E75A，R77A)或SakSTAR(K74A)的12-24L培养液(2L每批)在补加有100μg／mL氨苄青霉素的LB培养基中培养并IPTG诱导，沉淀，重悬浮，超声处理破碎并澄清。通过用另文(22，23)所述的缓冲系统在5×20cm SP-Sephadex柱、5×10cm Q-Sepharose柱和／或5×13cm苯基-Sepharose柱上层析纯化这些化合物。然后在无菌Superdex 75上凝胶过滤该物质，进一步降低其内毒素含量。合并含SakSTAR变体的级分，将蛋白质浓度调节为1mg／mL，并将该物质通过0．22μm Millipore滤器过滤除菌。用来测定体内应用所需最终物质的生物性质的方法在以上和另文(22)中有描述。2．材料与方法如上所述测定血浆中的葡激酶中和活性。抗原特异性IgG和IgM抗体的定量基本如前所述(22)，用酶联免疫吸附测定法在聚苯乙烯微量滴定板中进行。在IgG测定中，每板包括亲和特异性抗SakSTAR IgG抗体的稀释曲线。这些抗体分离自从3名患者中获得的血浆，方法是在用野生型SakSTAR溶栓治疗后，在蛋白A-Sepharose和固定化的SakSTAR上层析，并用0．1mol／L甘氨酸-HCl，pH2．8洗脱结合的抗体。IgG制品的纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定。在IgM测定中，测定效价，效价被定义为492nm的吸光率等于1／640稀释的合并血浆吸光率时的血浆稀释度，并将其与治疗前基线样品的效价相比较(中值1／410，四分位数间距1／120-1／700)。3．溶栓能力在闭塞性血栓近端处或之中以2mg大剂量动脉内施用野生型SakSTAR或变体SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，随后对每组6-12名血管造影证实为外周动脉阻塞或少于120天持续时间的旁路移植患者以1mg／小时输注(在某些患者中过夜降至0．5mg／小时)。给予书面承诺后研究患者，方案由Leuven大学的人类研究委员会批准。包含和排除标准、联合抗血栓治疗(包括连续静脉内肝素)和研究方案基本如前所述(22)。
表2显示了个体患者的有关基线特征。大多数PAO在股骨腘水平。包括两个髂支架和8个移植物阻塞。8名患者显示致残性跛足，5名显示慢性缺血性静止痛，7名显示亚急性缺血，7名显示急性缺血。一名两年前用SakSTAR治疗的患者(POE)包括于SakSTAR(K74A)组中。该患者不包括于统计分析中。
表2也总结了各治疗和结果。剂量6．0-25mg、持续时间4．0-23小时的动脉内输注在24名患者中诱导完全的再通，在3名患者中诱导部分再通。在17名患者中进行补充的血管内方法(主要是PTA)，在3名患者中在血栓溶解后进行补充的重建血管手术。没有患者者进行重大的截肢术。在4名患者中发生了血管造影术结束后血栓形成的早期复发。除了5名需要输血的患者之外(数据未显示)，没有出血并发症，或者仅限于血管造影穿刺部位的轻度到中度血肿形成。未观察到颅内或内脏出血。循环纤维蛋白原、纤溶酶原和α2-抗纤溶酶水平在SakSTAR部分输注期间基本保持不变(数据未显示)，证实葡激酶在使用剂量时的绝对纤维蛋白特异性。纤维蛋白片段D-二聚体水平的升高证明发生了明显的体内纤维蛋白消化。动脉内肝素治疗使aPPT水平延伸到可变范围(数据未显示)。4．抗体诱导抗体相关的SakSTAR、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)中和活性和抗SakSTAR、抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgG在基线时和在输注后第一周内较低(图2)。从第二周开始，中和活性水平升高，在3-4周时达到中值，在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治疗的患者中分别为每mL血浆中和20μg SakSTAR(K74A)和2．4μg SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，这显著低于用SakSTAR治疗的患者中每mL中和93μg野生型SakSTAR的中值(根据Kruskal-Wallis分析，三组之间的差异为p=0．024，根据Mann-Whitney秩和检验，变体与野生型的差异分别为p=0．01和p=0．036)。抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgG的水平在3-4周时升高到中值，在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治疗的患者中分别为270和82μg／mL血浆，这显著低于用SakSTAR治疗的患者中每mL血浆1800μg抗SakSTAR的中值(根据Kruskal-Wallis分析，三组之间的差异为p=0．024，根据Mann-Whitney秩和检验，变体与野生型的差异分别为p=0．07和p=0．05)。
抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgM的效价在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治疗的患者中分别从1／460和1／410的中值基线值升高到1周时1／510和1／450的中值，这显著不同于用SakSTAR治疗的患者中基线时1／320的中值和1周时1／640的中值。在施用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)的患者中，2周时的相应值为1／590和1／550，与使用SakSTAR的1／930没有显著性差异(数据未显示)。用SakSTAR治疗诱导的抗体被SakSTAR完全吸附，但被SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)不完全吸附，这证实了K74、E75、R77表位的免疫原性和K74在抗该表位抗体结合中的显性作用。用SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治疗诱导的抗体被SakSTAR、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)完全吸附，表明免疫不是由于Lys74置换为Ala产生的新表位，而是由于不同于K74、E75、R77表位的表位。
因此，本实施例说明，能产生具有降低的抗体诱导但有完整溶栓能力的葡激酶变体。用SakSTAR(n=9)、SakSTAR(K74A)(n=11)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(n=6)治疗的26名患者的经验，加上以前用SakSTAR(n=7)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)(n=7)(31)治疗的14名患者的经验，和用SakSTAR治疗的24名患者的经验(32)，以及随后在用SakSTAR(n=30)、SakSTAR(K74A)(n=12)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(n=7)治疗的患者中的非随机化经验(数据未显示)，使得能最初估计用SakSTAR或具有改变的K74、E75、R77表位的变体[SakSTAR(K74A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)]动脉内治疗引起的免疫普遍性。在由动脉内施用SakSTAR的70名外周动脉阻塞患者获得的2-4周后的中和活性数据显示，56名患者(80％)具有中和＞5μg化合物／mL血浆的水平。在施用SakSTAR(K74A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)或SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)的患者中，43名中的27名(63％)具有＞5μg化合物每mL血浆的中和活性水平。此差异在统计学上是显著的(根据Fisher精确检验，p=0．05)，表明K74、E75、R77表位是抗体诱导的主要决定簇。实施例4葡激酶的丙氨酸置换突变体的构建、用鼠单克隆抗体的表位作图和用免疫患者合并血浆的吸附1．引言定点诱变适用于除“带电氨基酸”之外的残基，用来鉴定ⅰ)用一系列鼠Mab鉴定的属于表位Ⅰ和Ⅲ的其它残基，ⅱ)决定免疫患者抗血清吸附的氨基酸。由于功能表位通常包含多于一个的抗体结合所必需的氨基酸，所以这些表位中其它残基的鉴定能导致显示较低抗原性而保持野生型葡激酶的比活和温度稳定性的新组合衍生物的构建，在本实施例中，描述了一个或至多两个氨基酸(相邻或紧接)被替换为丙氨酸的SakSTAR变体的构建和表征。表3中列出了本实施例中描述的突变体。这些变体在大肠杆菌中表达、纯化并对比活、与一系列鼠单克隆抗体的反应性和野生型SakSTAR治疗的患者血浆中抗体的吸附等方面进行表征。2．试剂与方法本研究中使用的所有试剂的来源以前已报道(22)，或在以下详述。诱变模板载体pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修饰酶购自New England Biolabs(Leusden，荷兰)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反应按照供应商建议进行。诱变寡核苷酸和引物从Eurogentec(Seraing，比利时)获得。质粒DNA如建议用Qiagen的纯化试剂盒(Hilden，德国)或BIO 101 RPM试剂盒(Vista，CA)分离。转化感受态大肠杆菌细胞用众所周知的磷酸钙法制备。核苷酸序列测定用T7测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以双脱氧链终止法对双链质粒DNA进行。聚合酶链反应用Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)的Taq聚合酶或Vent聚合酶(New England Biolabs，Leusden，荷兰)进行。构建本实施例所述变体所需的重组DNA方法已经很好地建立(22，27)。3．表达质粒的构建用pMEX．SakSTAR载体作为模板，按照厂商说明书，用Stratagene(La Jolla．美国)的Chameleon双链定点诱变试剂盒，构建变体SakSTAR(Y17A，F18A)、SakSTAR(F104A)、SakSTAR(F111A)、SakSTAR(Y9A)、SakSTAR(Y91A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(I87A)、SakSTAR(I106A)和SakSTAR(I120A)。诱变寡核苷酸(未显示)与选择引物LY34 5’CAAAACAGCCGAGCTTCATTCATTCAGC一起使用，后者破坏位于pMEX．SakSTAR中葡激酶编码基因3’的唯一HindⅢ位点，并使得能通过HindⅢ消化反选择未突变的子代。HindⅢ位点的缺失在大多数情况中与存在用诱变寡核苷酸引入的希望突变有关。变体SakSTAR(I133A)的构建方法是用位于sakSTAR基因5’端的引物818A(5’CAGGAAACAGAATTCAGGAG)和诱变引物LY58(5’TTCAGCATGCTGCAGTTATTTCTTTTCTGCAACAACCTTGG)对pMEX．SakSTAR质粒进行聚合酶链反应。纯化扩增产物(30循环94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒)，用EcoRI和PstI消化，并连接于pMEXSakSTAR的相应位点。变体SakSTAR(I128A)、SakSTAR(L127A)和SakSTAR(N126V)的构建方法是用位于sakSTAR基因5’端的引物818A和诱变引物(未显示)进行聚合酶链反应。纯化扩增产物(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)，用EcoRI和StyI消化，并连接于pMEXSakSTAR的相应位点。
通过进行两个连续PCR反应(30循环94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒)构建变体SakSTAR(F125A)。在第一个反应中，用引物818A和诱变引物扩增pMEX．SakSTAR的片段。然后在第二个PCR反应中用该扩增片段作为模板，用一种诱变引物进一步延伸sakSTAR基因中存在的StyI位点下游的片段(对应于SakSTAR的氨基酸130-131)。用EcoRI和StyI消化得到的产物，并将其连接于pMEX．SakSTAR的相应位点。
编码表3列出的其它所有变体的质粒是用pMEX．SakSTAR或可获得的编码SakSTAR变体的质粒作为模板，通过直接PCR或剪接重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)(22)构建的。PCR扩增两个片段(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)，第一个从葡激酶基因的5’端开始(引物818A)到待诱变区(正向引物)，第二个用引物818D(5’CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)从该相同区(反向引物)到基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重叠区(引物未显示)。然后用外部引物818A和818D在第二个PCR反应中将两个纯化片段装配在一起(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。从该终反应物中纯化扩增产物，用EcoRI和HindⅢ消化，连接于pMEX．SakSTAR的相应位点。对于每一构建，通过对完整SakSTAR编码区测序证实变体的序列。4．SakSTAR变体的表达和纯化如下所述，从在优质肉汤(TB)培养基(28)中生长的转化大肠杆菌中表达并纯化SakSTAR变体。用2-4mL等份LB培养基的过夜饱和培养物接种1-2L补加有100μg／mL氨苄青霉素的优质肉汤培养物。在30℃剧烈通气下温育该培养物。温育大约16小时后，向培养物中加入IPTG(200μmol／L)诱导从tac启动子开始的表达。诱导3小时后，以4000转每分离心20分钟沉淀细胞，重悬浮于1／10体积的0．01mol／L pH6-6．5磷酸缓冲液中，并通过在0℃超声处理破碎。将悬液以20000转每分离心20分钟，上清液贮存于4℃或-20℃直到纯化。基本如上所述(实施例2)纯化该物质含有SakSTAR变体的澄清细胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上进行层析，随后在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上层析。合并经SDS凝胶电泳定位、含有SakSTAR的级分用于进一步分析。5．物理化学和生物化学分析根据Bradford(29)测定蛋白质浓度。使用10-15％梯度凝胶和考马斯亮蓝染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)进行SDS-PAGE，用在微量滴定板中进行的显色底物试验测定SakSTAR溶液的比活(如实施例2所述)。不同SakSTAR变体的比活总结于表3中。6．SakSTAR变体与一系列鼠单克隆抗体的反应性用来测定SakSTAR变体与一系列鼠单克隆抗体的反应性的方法已在上文实施例1中描述。结果总结于表3中(该表的格式对应于如实施例1所述的表1的格式)。比野生型葡激酶至少低10倍的表观缔合常数被认为是显著的，并在表中以黑体标出。
为了获得SakSTAR分子Ala置换变体性质的全面情况，构建、表达并纯化了67个编码一个或两个相邻氨基酸被Ala替换的变体的质粒。与以前描述(22和实施例2)的35个带电残基-Ala置换变体一起，该分析覆盖了SakSTAR中除Gly、Ala和Pro之外的所有残基，如图3所示。8种变体不能以纯化形式获得，主要是由于表达水平低，11种变体是无活性的，56种比活降低，27种具有保持的或升高的比活(≥100 KHU／mg)。从表达质粒的培养中产生纯化物质的产量为16mg／L(中值，10-90百分范围为4-41mg／L)。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳一致显示一条Mr≈16000的主带，通常代表总蛋白质的95％(未显示)。
K35、N95、S103或K135替换为Ala产生比活≥200 kU／mg的变体。W66、Y73或E75替换为Ala降低了变体与表位簇I的≥3种抗体的反应性，H43或V45替换为Ala降低了变体与表位簇II的3种抗体的反应性，V32、K35、D82和K130替换为Ala降低了变体与表位簇III的≥3种抗体的反应性。7．SakSTAR治疗在患者中产生的抗体的吸附对于本实施例，使用如实施例2所述的三种血浆库。用来评估野生型葡激酶和SakSTAR变体吸附SakSTAR治疗患者中产生的抗体的方法在实施例2详细描述。结果总结于表3中。野生型SakSTAR和本实施例中分析的大多数变体吸附10名患者合并血浆中超过95％的结合抗体，用SakSTAR(Y73A)和SakSTAR(K74A)观察到不完全吸附(＜60％)，前文已经证明了Lys74对于抗体识别的重要作用(见实施例2)。该结果表明，Tyr73参与与Lys74相同的主要表位，或者另外，Tyr73的置换可间接诱导“K74表位”的结构修饰。对于大多数待测变体，用3名患者的合并血浆-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞95％的抗体(亚库C，见实施例2)一的吸附几乎是完全的。实施例5具有S34、G36和／或H43置换的葡激酶变体的构建、用鼠单克隆抗体的表位作图和免疫患者合并血浆的吸附天然变体Sak42D在三个氨基酸处不同于SakSTAR，相当于SakSTAR(S34G，G36R，H43R)。Sak42D的特征在于与表位簇Ⅱ和Ⅲ的某些鼠抗体的反应性降低，SakSTAR治疗患者血浆中抗体的吸附略微降低(表4)。SakSTAR中这些残基的诱变表明，与表位簇Ⅲ和免疫患者血浆的降低的反应性可能是由于G36R置换、H43R置换介导与表位簇Ⅱ的降低的反应性，但对与免疫患者血浆的反应性无影响，而S34A置换没有影响。G36R置换能与K74R结合，但不能与K74A置换结合，而不明显降低比活(表4)。实施例6具有K35、E65、Y73、K74、E80+D82、N95、K130、V132和／或K135置换的葡激酶变体的构建、用鼠单克隆抗体的表位作图和免疫患者合并血浆的吸附根据实施例4中丙氨酸置换分析的结果，选择K35、N95和K135进行进一步的分析，因为SakSTAR(K35A)、SakSTAR(N95A)和SakSTAR(K135A)具有增高两倍的比活，选择Y73和K74，因为SakSTAR(Y73A)和SakSTAR(K74A)与表位簇I抗体的反应性明显降低，并且降低了通过SakSTAR治疗而免疫的患者血浆抗体的吸附，选择K35、E80+D82、K130和V132，因为SakSTAR(K35A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTkR(K130A)和SakSTAR(V132A)与表位簇Ⅲ抗体的反应性降低。
在使活性／抗原性比成为最大的尝试中，将这些氨基酸替换为Ala之外的氨基酸。如表5所总结的，K35置换为A、E或Q表明，SakSTAR(K35A)具有最值得关注的特性，Y73被F、H、L、S或W的置换不能挽回比活的明显降低，K74证实了它在免疫患者血浆抗体结合中的重要作用，用SakSTAR(K74Q)和SakSTAR(K74R)获得最佳比活／抗原性比。SakSTAR(E80A，D82A)优于单残基变体SakSTAR(E80A)或SakSTAR(D82A)，因为它与免疫患者血浆的反应性略有降低。用E、G、K或R替换N95不能进一步改进SakSTAR(N95A)，它不能将升高的比活赋予含有K74A或K135R的变体。最后，SakSTAR(K130T)在比活方面优于SakSTAR(K130A)，SakSTAR(V132R)优于SakSTAR(V132A)。实施例7SakSTAR(K130T，K135R)和SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)与K35A、G36R、E65X、K74X和所选其它氨基酸的组合变体的构建、用鼠单克隆抗体的表位作图和免疫患者合并血浆的吸附在本实施例和下列实施例中，从SakSTAR治疗几周后的40名患者中制备另一种血浆库(库40)。来源于10名患者的原始库进一步被确定为库10。如上及另文(22)所述定量葡激酶特异抗体的吸附。
SakSTAR(K130T，K135R)变体作为添加诱变的模板，因为它具有高比活，与表位簇Ⅲ抗体的结合和免疫患者血浆抗体的吸附适度降低(表6)。向模板中添加G36R、K74R或K74Q或两者，不能明显降低比活，降低与表位簇Ⅲ的单克隆抗体的反应性(G36R置换)，降低免疫患者血浆抗体的吸附(K74R或K74Q置换)。SakSTAR(K130T，K135R)模板中E65A或E65Q与K74Q的组合使库10和库40抗体的吸附分别降低为50-60％左右，而不明显降低比活。在SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)模板中选择的氨基酸的添加置换不能再进一步降低库10和库40的抗体吸附。令人惊讶地，用显色底物试验测定，K136被置换为A和在位点137中加入K导致比活明显增高。
SakSTAR(E80A，D82A)和SakSTAR(K130T，K135R)模板的组合不影响比活，与表位簇III抗体的反应性降低(表7)。因此，选择SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)模板进一步诱变。K74R以至K74Q的添加大大降低了与免疫患者血浆的反应性。最后，向SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)模板中添加E65D或K35A或E65S产生具有完全比活的变体，它们只结合免疫患者合并血浆中≤45％的抗体，和超过50％与K74、E75、R77表位反应的亚库不到15％。实施例8选择的葡激酶变体的表征，其具有完整的比活和用野生型SakSTAR治疗在患者中产生的SakSTAR特异性合并人抗体的低于50％的吸附1．引言在上述实施例中构建并表征的23种变体具有以下两种特性≥100kHU／mg的残余比活，和从野生型SakSTAR治疗的10名患者中获得的抗血清库的≤50％的吸附。结果总结于表8中。包括用亚库B和亚库C和用野生型SakSTAR治疗的40名患者的库获得的结果。选择SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，_137K)进一步表征。2．SakSTAR变体在人血浆中的体外纤维蛋白溶解性质如前所述测定SakSTAR变体的纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解性质。使用选择的变体获得浸于人血浆中的125I-纤维蛋白标记的人血浆凝块的剂量依赖与时间依赖溶解(表9)。实验期间自发的凝块溶解≤5％(未显示)。从2小时凝块溶解对纤溶酶原激活剂浓度的曲线图(未显示)图表确定，试验化合物的等效浓度(2小时后使50％凝块溶解；C50)为0．11+0．01至0．24+0．04g／mL，此时残余纤维蛋白原水平为基线的92±30％和97+30％(表9)。由剂量反应曲线(未显示)图表确定无纤维蛋白时在2小时后使人血浆中50％纤维蛋白原降解的化合物浓度。这些值(3个独立实验的平均值±SD)为14+3．2-29+3．1μg／mL(表9)。令人惊讶地，SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，_137K)在显色测定中的极高比活与血浆环境中增强的溶栓能力无关。3．选择的SakSTAR变体的温度稳定性图4显示了在不同温度下，在0．15mol／L NaCl、0．01mol／L磷酸盐缓冲液，pH7．5中溶解为1．0mg／mL浓度的SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)制剂的温度稳定性。在高达37℃的温度下，所有化合物都可保留完全活性至少三天。然而在56℃和70℃下，三种变体比野生型SakSTAR更不稳定。4．在仓鼠中大剂量注射后SakSTAR变体的药物动力学特性静脉内大剂量注射100μg／kg SakSTAR变体后，在4只一组的仓鼠中评估血液处理SakSTAR变体的药物动力学参数。用另文描述的ELISA测定SakSTAR相关抗原。对欲定量的每一种SakSTAR变体校准该ELISA。药物动力学参数包括初始半衰期(分钟)，t1／2α=In2／α；终止半衰期(分钟)，t1／2β=In2／β；中央(血浆)室体积(mL)，Vc=剂量／(A+B)；曲线下面积(μg·分钟·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血浆清除率(mL·分钟-1)，Clp=剂量／AUC(33)。
在每组4只仓鼠中大剂量注射100μg／kg选择的SakSTAR变体后，血液对葡激酶相关抗原的处置率，可通过图形曲线剥脱法由总共两个指数项充分描述(结果未显示)，由此得出表10中所总结的药物动力学参数。突变体的药物动力学参数与野生型SakSTAR没有显著性差异。初始半衰期(t1／2(α))为2．0-3．2分钟，血浆清除率(Clp)为1．6-4．1mL／分钟。实施例9SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)与SakSTAR在外周动脉阻塞患者中溶栓能力和免疫原性比较1．为了体内应用的纯化变体SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)的18升培养物(2L每批)在补加有100μg／mL氨苄青霉素的优质肉汤培养基(28)中培养20小时，在最后3小时中用IPTG诱导。沉淀细胞，重悬浮于1／10体积的0．01mol／L磷酸盐缓冲液，pH6．0中，超声处理破碎，离心使其澄清。通过在10×7cm的SP-Sepharose柱上层析纯化化合物，该柱用0．01mol／L磷酸盐缓冲液，pH6．0平衡，用1mol／L NaCl梯度(3倍柱体积)洗脱。合并含有SakSTAR变体的级分，加入固体NaCl至2．5mol／L的浓度，在10×20cm的苯基-Sepharose柱上层析该物质，随后用0．01mol／L磷酸盐缓冲液，pH6．0分步洗脱。该物质在10×45cm的Sephadex G25柱上脱盐，加到5×10cm的SP-Sepharose柱上并用1．0mol／L NaCl分步洗脱浓缩，最后在0．15M NaCl、0．01mol／L磷酸盐缓冲液，pH7．5平衡的6×60cmSuperdex 75柱上凝胶过滤，进一步降低内毒素含量。合并含有SakSTAR变体的级分，将蛋白质浓度调节为1mg／mL，并将该物质通过0．22μmMillipore滤器过滤除菌。用来测定比活、内毒素污染、细菌无菌和在小鼠中毒性的方法在上文或另文(22)中有描述。通过在加样40g化合物的10％凝胶上进行SDS凝胶电泳来估计制品的纯度。
从18升培养体积的SakSTAR变体中，纯化出840mg比活为140kHU／mg的SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和800mg比活为150kHU／mg的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。内毒素含量为＜0．1IU／mg和0．26IU／mg。HPLC凝胶过滤显示，在柱层析范围中有一个主要的对称峰，代表＞98％的洗脱物质(曲线下的总面积)(未显示)。40g样品的SDS凝胶电泳显示一种主要成分(未显示)。在如另文(22)所述的3天检验中，证明过滤除菌的制品是无菌的。与施用等量盐水的小鼠(未显示)相比，在每组5只小鼠中静脉内大剂量注射SakSTAR变体(3mg／kg体重)不能引起任何急性反应，也不能在8天内降低体重增加。2．溶栓能力在闭塞性血栓近端处或之中以2mg大剂量动脉内施用野生型SakSTAR或变体SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，随后分别对15、6、6名一组的血管造影证实为外周动脉阻塞或少于120天持续时间的旁路移植患者以1mg／小时输注(在某些患者中过夜降至0．5mg／小时)。给予书面承诺后研究患者，方案由Leuven大学的人类研究委员会批准。包含和排除标准、联合抗血栓治疗(包括连续静脉内肝素)和研究方案基本如前所述(22)。
表11显示了个体患者的有关基线特征和治疗结果和后果。剂量3．5-27mg、持续时间2-44小时的动脉内输注在22名患者中诱导完全的再通，在5名患者中诱导部分再通。在13名患者中进行补充的血管内方法(主要是PTA)，在5名患者中在血栓溶解后进行补充的重建血管手术。一名患者者进行重大的截肢术。通常没有出血并发症，或者仅限于血管造影穿刺部位的轻度到中度的血肿形成(数据未显示)。施用野生型SakSTAR的一名患者有非致死性颅内出血，一名(BUE)有腹膜后血肿，两名(MAN和STRO)有胃肠道出血。
循环纤维蛋白原、纤溶酶原和α2-抗纤溶酶水平在SakSTAR部分输注期间保持不变(数据未显示)，反映这此药剂在使用剂量时的绝对纤维蛋白特异性(数据未显示)。纤维蛋白片段D-二聚体水平的升高证明发生了明显的体内纤维蛋白消化。动脉内肝素治疗使aPPT水平延伸到可变范围(数据未显示)。4．抗体诱导基本如上文和另文(22)所述定量血浆的葡激酶中和活性和抗原特异性IgG抗体。抗体相关的SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)中和活性和抗SakSTAR、抗SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和抗SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)IgG在基线时和在输注后第一周内较低(图5)。从第二周开始，中和活性水平升高，在3-4周时达到中值，在用相应部分治疗的患者中分别为每mL血浆中和9μg SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和0．5μg SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，与之相比，用SakSTAR治疗的15名患者中中值为每mL中和24μg野生型SakSTAR。抗SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和抗SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)IgG的水平在3-4周时升高到中值，在用相应部分治疗的患者中分别为420和30μg／mL血浆，与之相比，用SakSTAR治疗的患者中中值为每mL血浆590μg抗SakSTAR(图5)。以2-4周后血浆中和活性超过5g／ml定义的免疫普遍性为，与用SakSTAR的70名患者中的56名(80％)相比，用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)的6名患者中有3名(50％)，用SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)的6名患者中有1名(17％)。此差异在统计学上是非常显著的(根据2×3卡方分析，p=0．01)。
用SakSTAR治疗诱导的抗体被SakSTAR完全吸附，但被SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)不完全吸附(表12)。用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)治疗诱导的抗体，在6名患者中的4名中可检测到，被SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)完全吸附(≥90％)，表明免疫不是由于野生型氨基酸置换产生的新表位。用SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)治疗诱导的抗体，在一名患者(URB)中可检测到，可用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)完全吸附，但用野生型SakSTAR不完全吸附(85％)，提示诱导抗体的小部分可能针对输注用变体中的新表位。实施例10SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)与所选其它氨基酸的组合变体的构建、用免疫患者合并血浆的吸附1．引言在添加置换诱变的最后一轮，将SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)变体作为模板，因为它显示高比活，合并的免疫患者血浆(库40)抗体的吸附明显降低(为65％)。与最终选择的变体组合物有关的中间变体总结于表13中。K35、D82和S84A的添加，T90A、E99D和T101S的添加，E108A和K109A的添加，使抗体吸附降低为50％左右，而D82A、S84A和E108A、K109A的组合添加使之降低为41％。K136A的置换与COOH端Lys的添加(-137K)结合，在纯化系统中，而不是在血浆环境或仓鼠肺栓塞模型(未显示)中提高了比活，并且进一步使患者合并血浆抗体的吸附降低为30％。最后，向该模板中添加K35A和T90A、E99D、T101S置换产生了一种具有完全溶栓能力的突变体，它只能结合免疫患者合并血浆中24％的抗体。
根据该分析，选择SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)进一步表征。另外，构建并评价在位点74含Lys的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)。2．在仓鼠中大剂量注射后SakSTAR变体的药物动力学特性在每组4只仓鼠中大剂量注射100μg／kg选择的SakSTAR变体后，血液对葡激酶相关抗原的处置率，可通过图形曲线剥脱法由总共两个指数项充分描述(结果未显示)。从这些血浆消失曲线中得出突变体的药物动力学参数，与野生型SakSTAR没有明显差异(结果极其类似于表10，数据未显示)。实施例11由SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)产生的选择变体的表征1．选择的SakSTAR变体对人血浆的体外纤维蛋白溶解特性使用选择的三种变体获得浸于人血浆中的125I-纤维蛋白标记的人血浆凝块的剂量依赖与时间依赖溶解(表14)。实验期间的自发凝块溶解≤5％(未显示)。从2小时凝块溶解对纤溶酶原激活剂浓度的曲线图(未显示)图表确定，试验化合物的等效浓度(在2小时后使50％凝块溶解；C50)为0．15±0．2至0．19±0．01μg／mL，此时不发生明显的纤维蛋白原降解。由剂量反应曲线(未显示)图表确定无纤维蛋白时在2小时后使人血浆中50％纤维蛋白原降解的化合物浓度。这些值(3个独立实验的平均值±SD)为7．0±0．6至24±3．6μg／mL(表14)。2．选择的SakSTAR变体的温度稳定性在不同温度下，在0．15M NaCl、0．01M磷酸盐缓冲液，pH7．5中溶解为1．0mg／ml浓度的SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)制剂的温度稳定性。在高达37℃的温度下，所有化合物都可保留完全活性至少三天。在56℃和70℃下，变体一般比野生型SakSTAR更不稳定(结果极其类似于图4，数据未显示)。实施例12SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，V_137K)(SY141)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)在外周动脉阻塞患者中的溶栓能力和免疫原性比较1．体内应用的SakSTAR变体的大规模纯化和条件从18升培养体积中，将物质纯化为均匀的。内毒素含量低于2IU／mg。HPLC凝胶过滤显示，在柱层析范围中有一个主要的对称峰，代表＞98％的洗脱物质(曲线下的总面积)(未显示)。30μg样品的SDS凝胶电泳显示一种主要成分。在3天检验中证明过滤除菌的制品是无菌的。与施用等量盐水的小鼠(未显示)相比，在每组5只小鼠中静脉内大剂量注射SakSTAR变体(3mg／kg体重)不能引起任何急性反应，8天内也不能降低体重增加。
研究了血管造影术证明为外周动脉阻塞(PAO)的每组6名患者。个体患者的有关基线特征显示于表15中。表16总结了各治疗和结果。剂量6-24mg、持续时间4-29小时的动脉内输注在大多数患者中诱导完全的再通。循环纤维蛋白原、纤溶酶原和α2-抗纤溶酶水平在SakSTAR变体输注期间基本保持不变(数据未显示)，反映了这些药剂在使用剂量时的绝对纤维蛋白特异性。抗体相关的SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E650，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)中和活性在基线时和在输注后第一周内较低(图17)。从第二周开始，中和活性水平升高，在3-4周时达到中值，在用各自化合物治疗的患者中为每mL血浆中和19μg SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)、0．7μg SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)和4．3μg SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)，对于SY141和SY145而不是SY118，低于用野生型SakSTAR治疗的69名患者中每mL中和12μg野生型SakSTAR的中值。
在用SakSTAR治疗的70名患者中的56名中，在接触SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)的6名患者中的5名中，只在施用SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)的6名患者中的2名中，在施用SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)的3名患者中的1名中，观察到明显的免疫(3-4周时中和活性为每ml血浆5g化合物)。
有关研究的主要变体在患者中的免疫原性的结果总结于表18中。显然，与野生型蛋白质相比，变体SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)具有明显降低的免疫原性。实施例13葡激酶的半胱氨酸置换突变体的构建、纯化和表征1．引言进行定点诱变，用单半胱氨酸残基替代暴露的氨基酸，以构建ⅰ)在分子间二硫键形成之后，葡激酶的同型二聚体形式，和ⅱ)聚乙二醇偶联的分子(PEG-衍生物)。本实施例的目的在于两点第一，增加注射分子的大小(通过二聚化或与大分子如PEG的偶联)能降低清除率，第二，PEG-衍生物也显示在动物模型中诱导降低的免疫反应性(综述见参考文献34)。在这两种情况中，延长的体内半衰期有助于降低患者中葡激酶的药理学剂量。这种降低可能伴随有对溶栓剂的降低的免疫原性反应，从而增强其作为一种溶栓剂的药理活性。
在本实施例中，描述了其中单氨基酸被替换为半胱氨酸的两种SakSTAR变体的构建和表征。本实施例描述的突变体列于表19中。这些变体在大肠杆菌中表达、纯化，并对比活、在人血浆中的体外纤维蛋白溶解和在仓鼠中大剂量注射后的药物动力学特性等方面进行表征。2．试剂与方法本研究中使用的所有试剂的来源以前已报道(22)，或在以下详述。诱变模板载体pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修饰酶购自New England Biolabs(Leusden，荷兰)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反应按照供应商建议进行。诱变寡核苷酸和引物从Eurogentec(Seraing，比利时)获得。质粒DNA如建议用Qiagen的纯化试剂盒(Hilden，德国)分离。转化感受态大肠杆菌细胞用众所周知的磷酸钙法制备。核苷酸序列测定用T7测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以双脱氧链终止法对双链质粒DNA进行。聚合酶链反应(PCR)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)的Taq聚合酶进行。构建本实施例所述变体所需的重组DNA方法已经很好地建立(22，27)。3．表达质粒的构建用编码SakSTAR的pMEX．SakSTAR作为模板，通过剪接重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)(24)构建变体SakSTAR(K102C)和SakSTAR(K109C)。PCR(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)扩增两个片段，第一个从葡激酶基因的5’端(引物818A)开始到待诱变区(正向引物)，第二个用引物818D(5’CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)从该相同区(反向引物)到该基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重叠区(对于K102C的构建TAT GAT AAG AAT TGC AAA AAA GAA GAA(反向)和TTC TTC TTT TTT GCA ATT CTT ATC ATA(正向)，对于K109C的构建AAA AAG AAG AAA CGT GCT CTT TCC CTA(反向)和TAG GGA AAG AGC ACG TTT CTT CTT TTT(正向))。然后用外部引物818A和818D在第二个PCR反应中将两个纯化片段装配在一起(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。从该终反应物中纯化扩增产物，用EcoRI和HindⅢ消化，并连接于pMEX．SakSTAR的相应位点。对于每一构建，通过对完整编码区测序证实变体的序列。4．SakSTAR变体的表达和纯化如下所述，从在优质肉汤(TB)培养基(28)中生长的转化大肠杆菌中表达并纯化SakSTAR变体。用2-4mL等份LB培养基的过夜饱和培养物接种1-2L补加有100μg／mL氨苄青霉素的优质肉汤培养物。在30℃剧烈通气下温育该培养物。温育大约16小时后，向培养物中加入IPTG(200μmol／L)诱导从tac启动子开始的表达。诱导3小时后，以4000转每分离心20分钟沉淀细胞，重悬浮于1／10体积的0．01mol／L pH6-6．5磷酸缓冲液中，并通过在0℃超声处理破碎。将悬液以20000转每分离心20分钟，上清液贮存于4℃或-20℃直到纯化。基本如上所述(实施例2)纯化该物质含有SakSTAR变体的澄清细胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上进行层析，随后在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上层析。合并经SDS凝胶电泳定位、含有SakSTAR的级分用于进一步分析。5．生物化学分析根据Bradford(29)测定蛋白质浓度。使用10-15％梯度凝胶和考马斯亮蓝染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)进行SDS-PAGE，用在微量滴定板中进行的显色底物试验测定SakSTAR溶液的比活(如实施例2所述)。不同SakSTAR变体的比活总结于表19中。
经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示，变体SakSTAR(K102C)基本上是单体的。其比活相当于野生型葡激酶。相反，SakSTAR(K109C)显示形成二聚体的倾向(＞60％)。这导致在纤溶酶原偶联的显色底物试验中比活明显增高(见表19)。在用二硫苏糖醇(DTT)还原(20倍摩尔过量，37℃，1．5小时)，并用碘乙酰胺烷化(100倍摩尔过量，37℃，1小时)后，K109C二聚体转化为稳定的单体，其最终比活在野生型葡激酶的希望的范围之内(表19)。该结果证实，同型二聚体的形成是比活大大增加的唯一决定因素。通过在Source S(Pharmacia)(5×50mm)上层析将二聚体SakSTAR(K109C)与单体SakSTAR(K109C)分开。加样缓冲液为10mM磷酸盐缓冲液，pH6．0，二聚体SakSTAR(K109C)用相同缓冲液中的盐梯度(可达1M)洗脱。合并经SDS凝胶电泳定位、含有二聚体SakSTAR(K109C)的级分(纯度＞95％)用于进一步分析。6．SakSTAR的半胱氨酸突变体与聚乙二醇的化学交联半胱氨酸突变体SakSTAR(K102C)的硫醇基用于与活化的聚乙二醇OPSS-PEG(Shearwater Polymers Europe，Enschede，荷兰)偶联。OPSS-PEG是一种5kDa的PEG分子，在一端带有一个活化的硫醇基，在弱碱性pH时可与游离硫醇特异反应。SakSTAR(K102C)的修饰通过使该分子(100μM)与三倍过量的溶于5mM磷酸盐，pH7．9溶液的SS-PEG在室温下温育而完成。通过测定412nm处2-巯基吡啶酮从OPSS-PEG的释放监测反应的程度。反应后(约15分钟)，如上所述(见实施例2)通过在1．6×5cm SP-Sephadex柱上纯化衍生的SakSTAR(K102C-PEG)除去过量的OPSS-PEG。合并根据280nm的光密度定位、含有SakSTAR(K102C-PEG)的级分用于进一步分析。SDS-PAGE分析和考马斯亮蓝染色证实PEG在SakSTAR(K102C)上的交联是定量的。如表19所示，与野生型葡激酶相比，PEG衍生物的比活只是略受影响。7．SakSTAR变体在人血浆中的体外纤维蛋白溶解特性如前所述测定SakSTAR变体的纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解性质。使用下列四种分子获得浸于人血浆中的125I-纤维蛋白标记的人血浆凝块的剂量依赖与时间依赖溶解作为二聚体和单体的SakSTAR(K109C)(还原并用碘乙酰胺烷化后)、单体SakSTAR(K102C)和PEG衍生的SakSTAR(K102C)。实验期间的自发凝块溶解≤5％(未显示)。从2小时凝块溶解对纤溶酶原激活剂浓度的曲线图(未显示)图表确定，试验化合物的等效浓度(在2小时后使50％凝块溶解；C50)，单体SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C)与SakSTAR相当(表19)。然而，观察到，二聚体SakSTAR(K109C)凝块溶解的C50仅为0．12μg／mL，这比野生型葡激酶大约低三倍。相反，对于SakSTAR(K102C-PEG)测量到0．60μg／mL的C50，这只比野生型葡激酶高两倍。因此，SakSTAR通过二硫键的二聚化或者通过PEG衍生提高分子大小不妨碍葡激酶的纤维蛋白溶解活性。尽管PEG-分子似乎降低扩散，并因此降低衍生葡激酶对纤维蛋白凝块内的纤维蛋白溶解能力，但葡激酶的二聚化导致对人纤维蛋白凝块的协同纤维蛋白溶解作用。8．在仓鼠中大剂量注射后二聚体SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的药物动力学特性在静脉内大剂量注射100μg／kg SakSTAR变体后，在4只一组的仓鼠中评估血液处理二聚体SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的药物动力学参数。用另文所述的ELISA测定SakSTAR相关抗原。对欲定量的每一种SakSTAR变体校准该ELISA。药物动力学参数包括初始半衰期(分钟)，t1／2α=In2／α；终止半衰期(分钟)，t1／2β=In2／β；中央(血浆)室体积(mL)，Vc=剂量／(A+B)；曲线下面积(μg·分钟·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血浆清除率(mL·分钟-1)，Clp=剂量／AUC(32)。
在每组4只仓鼠中大剂量注射100μg／kg选择的SakSTAR变体后，血液对葡激酶相关抗原的处理率，可通过图形曲线剥脱法由总共两个指数项充分描述(结果未显示)，由此得出表19中总结的药物动力学参数t1／2α和Clp。二聚体SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的药物动力学参数与野生型SakSTAR明显不同。对于二聚体SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)，初始血浆半衰期(t1／2(α))分别为3．6和3．0分钟，血浆清除率(Clp)分别为0．52和0．32mL／分钟。这些结果可能是由于二聚化或与PEG交联引起的SakSTAR斯托克斯(Stokes)半径的增加。根据通过HPLC在Superdex50上的大小排阻层析，二聚体SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)分别具有33kDa和40kDa的表观分子量。实施例14免疫原性降低的葡激酶变体半胱氨酸置换突变体的构建、纯化和表征1．引言根据实施例13的结果，构建、纯化并表征SakSTAR变体的其它聚乙二醇衍生物。免疫原性最低的变体SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)用作模板，条件是后者的COOH端回复为野生型序列，S84A替换为E80，K74Q替换为K74R，产生SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY161)。引入的半胱氨酸，作为聚乙二醇分子的受体，位于氨基端区(优选地，但不是排他地，成熟葡激酶变体的位置号3处的Ser)，以在葡激酶激活后释放(10个NH2端氨基酸的释放)；最后使用不同分子量的聚乙二醇分子(Mr=5000-20000)，用OPSS或马来酰亚胺置换。
本实施例描述的突变体列于表20中。这些变体在大肠杆菌中表达、纯化，并对比活、在人血浆中的体外纤维蛋白溶解特性、在仓鼠中大剂量注射后的药物动力学特性、在仓鼠肺栓塞模型中大剂量注射后的溶栓特性、免疫患者合并血浆(库40)抗体的吸附等方面进行表征。2．试剂与方法本研究中使用的所有试剂的来源以前已报道(22)，或在以下详述。诱变的模板载体pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修饰酶购自New England Biolabs(Leusden，荷兰)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反应按照供应商建议进行。诱变寡核苷酸和引物从Eurogentec(Seraing，比利时)获得。质粒DNA如建议用Qiagen的纯化试剂盒(Hilden，德国)分离。转化感受态大肠杆菌细胞用众所周知的磷酸钙法制备。核苷酸序列测定用T7测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以双脱氧链终止法对双链质粒DNA进行。聚合酶链反应(PCR)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)的Taq聚合酶进行。构建本实施例所述变体所需的重组DNA方法已经很好地建立(22，27)。3．表达质粒的构建用编码SakSTAR的pMEX．SakSTAR作为模板，通过剪接重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)(24)构建变体SakSTAR(S3C，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(S3C))、SakSTAR(S2C，S3C，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(2SC，3SC))、SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141(S3C))、SakSTAR(S2C，S3C，K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141(S2C，S3C))、SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74Q，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY160(S3C))和SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY161(S3C))，PCR(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)扩增两个片段，第一个从葡激酶基因的5’端(引物818A)开始到待诱变区(正向引物)，第二个用引物818D(5’CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)从该相同区(反向引物)到该基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重叠区。然后用外部引物818A和818D在第二个PCR反应中将两个纯化片段装配在一起(30循环94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。从该终反应物中纯化扩增产物，用EcoRI和HindⅢ消化，并连接于pMEX．SakSTAR的相应位点。对于每一构建，通过对完整编码区测序证实变体的序列。4．SakSTAR变体的表达和纯化如下所述，从在优质肉汤(TB)培养基(28)中生长的转化大肠杆菌中表达并纯化SakSTAR变体。用2-4mL等份LB培养基的过夜饱和培养物接种1-2L补加有100μg／mL氨苄青霉素的优质肉汤培养物。在30℃剧烈通气下温育该培养物。温育大约16小时后，向培养物中加入IPTG(200μmol／L)诱导从tac启动子开始的表达。诱导3小时后，以4000转每分离心20分钟沉淀细胞，重悬浮于1／10体积的0．01mol／L pH6-6．5磷酸缓冲液中，并通过在0℃超声处理破碎。将悬液以20000转每分离心20分钟，上清液贮存于4℃或-20℃直到纯化。基本如上所述(实施例2)纯化该物质含有SakSTAR变体的澄清细胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上进行层析，随后在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上层析。合并经SDS凝胶电泳定位、含有SakSTAR的级分用于进一步分析。5．生物化学分析根据Bradford(29)测定蛋白质浓度。使用10-15％梯度凝胶和考马斯亮蓝染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)进行SDS-PAGE，用在微量滴定板中进行的显色底物试验测定SakSTAR溶液的比活(如实施例2所述)。6．SakSTAR的半胱氨酸突变体与聚乙二醇的化学交联半胱氨酸突变体的硫醇基用于与活化的聚乙二醇OPSS-PEG或MAL-PEG(Shearwater Polymers Europe，Enschede，荷兰)偶联。OPSS-PEG是一种5kDa的PEG分子，在一端带有一个活化的硫醇基，在弱碱性pH时可与游离硫醇特异反应。MAL-PEG是一种5kDa、10kDa或20kDa的分子，带有一个马来酰亚胺基，在其它官能团的存在下在温和条件下可与硫醇基特异反应。变体的修饰通过使该分子(100μM)与三倍过量的溶于5mM磷酸盐，pH7．9溶液的OPSS-PEG或MAL-PEG在室温下温育而完成。反应后(约15分钟)，如上所述(见实施例2)在1．6×5cmSP-Sephadex柱上纯化衍生的SakSTAR变体除去过量的OPSS-PEG或MAL-PEG。合并根据280nm的光密度定位、含有“PEG化”的SakSTAR变体的级分用于进一步分析。SDS-PAGE分析和考马斯亮蓝染色证实PEG交联是定量的。如表20所示，与野生型葡激酶相比，PEG衍生物的比活只是略受影响。7．SakSTAR变体在人血浆中的体外纤维蛋白溶解特性如前所述测定SakSTAR变体的纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解特性。使用所有待测分子获得浸于人血浆中的125I-纤维蛋白标记的人血浆凝块的剂量依赖与时间依赖溶解。从2小时凝块溶解对纤溶酶原激活剂浓度的曲线图(未显示)图表确定，试验化合物的等效浓度(在2小时后使50％凝块溶解；C50)，相当于或者只是略微低于SakSTAR(表20)。P20(Mr为20kDa的PEG)衍生变体的凝块溶解的C50大约两倍于未衍生的变体。因此，通过PEG衍生提高分子大小不能显著影响葡激酶的纤维蛋白溶解活性。PEG-分子似乎降低扩散并因此降低衍生葡激酶对纤维蛋白凝块的纤维蛋白溶解能力，但在NH2端区域-它在葡激酶加工过程中释放-置换的变体似乎比在分子核心置换的变体更不明显(参见表19、20)。8．在仓鼠中大剂量注射后聚乙二醇化学修饰的SakSTAR变体的药物动力学特性在静脉内大剂量注射100μg／kg SakSTAR变体后，在4只一组的仓鼠中评估血液处理PEG化变体的药物动力学参数。用另文描述的ELISA测定SakSTAR相关抗原。对欲定量的每一种SakSTAR变体校准该ELISA。药物动力学参数包括初始半衰期(分钟)，t1／2α=In2／α；终止半衰期(分钟)，t1／2β=In2／β；中央(血浆)室体积(mL)，Vc剂量／(A+B)；曲线下面积(μg·分钟·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血浆清除率(mL·分钟=-1)，Clp=剂量／AUC(32)。
在每组4只仓鼠中大剂量注射100μg／kg选择的SakSTAR变体后，血液对葡激酶相关抗原的处理率，可通过图形曲线剥脱法由总共两个指数项充分描述(结果未显示)，由此得出表20中总结的血浆清除率Clp。PEG化变体的清除率明显不同于野生型SakSTAR，并且与PEG分子的分子量成反比，PEG 5kDa平均降低5倍，PEG 10kDa平均降低10倍，PEG 20kDa平均降低30倍。这些结果可能是由于与PEG交联引起的SakSTAR斯托克斯半径的增加。实施例15SakSTAR(S3C-P20，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(S3C-P20))在两名急性心肌梗塞患者中的溶栓能力和清除率比较体内应用的SakSTAR变体的大规模纯化和条件从18升培养体积中，将物质纯化为均匀的。内毒素含量低于1IU／mg。HPLC凝胶过滤显示，在柱层析范围中有一个主要的对称峰，代表＞98％的洗脱物质(曲线下的总面积)(未显示)。30μg样品的SDS凝胶电泳显示一种主要成分。在方法中所述的3天检验中证明过滤除菌的制品是无菌的。与施用等量盐水的小鼠(未显示)相比，在5只小鼠中静脉内大剂量注射SakSTAR变体(3mg／kg体重)不能引起任何急性反应，8天内也不能降低体重增加。
对两名急性心肌梗塞患者大剂量注射5mg SY19(S3C-P20)。根据冠状血管造影术确定，在大剂量注射90分钟后，这些患者的闭塞的梗塞相关动脉完全再通。物质以3-4小时的初始半衰期从血浆中清除，与之相比，野生型SakSTAR为4-6分钟。这些数据证实，SakSTAR的PEG化变体可通过以降低剂量单次大剂量注射用于溶栓治疗。结论总之，本发明表明，能产生抗体诱导明显降低但有完全溶栓能力的葡激酶变体。这一结果构成了第一种情况，其中利用蛋白质工程技术，使异源蛋白质在人中的免疫原性明显降低，而不降低其生物活性。另外，本发明表明，用不同分子量的聚乙二醇对葡激酶或其变体的选择的化学修饰是可行的，导致与分子量成比例的血浆清除率的降低。在优选实施方案中，葡激酶NH2端区域-通过加工去除的部分-中的氨基酸被替换为Cys，并用OPSS或MAL-PEG化学修饰引入的硫醇基。这产生均一的产物，它在实验动物和患者中单次静脉内大剂量注射后，明显降低的剂量即具有保持的溶栓能力。表1SakSTAR“带电簇-丙氨酸”突变体的“丙氨酸-野生型”回复变体与固定鼠单克隆抗体(Mab)结合的缔合常数(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血浆抗体的吸附(％)
表观缔合常数比野生型SakSTAR低≥10倍以黑体表示；比活≥100000HU／mg以黑体表示；≤60％吸附以黑体表示。表2用SakSTAR、SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77)治疗的外周动脉阻塞患者的基线特征和治疗结果化合物 性别 年龄 临床缺血 阻塞部位 阻塞时间 阻塞长度 血栓溶解引 溶栓剂总剂 输注总持续 其它治疗患者身份 (岁) (天)(cm) 起的再通 量(mg) 时间(小时)SakSTARMEE F67静止痛 左SFA 308 完全 7.0 5.0 PTAFOR M68 跛足左IA(支架) 14 18 完全 6.5 4.5PTA+支架DAN M73 跛足 右SFA 306 完全 7.5 5.5 PTABER F63静止痛 左FT移植物 18 55 完全 18 28 PTADAM F43 急性 左臂和桡动脉 27 完全 19 17PTA+支架TOR M68 跛足 右SFA(腘动脉瘤)50 12 完全 6.0 4.0 PTA+腿腘旁路移植CLA M74 急性 左PA 1.5 20 完全 9.0 7.0-MAN M65 急性左EIA(支架) 4 20 完全 6.5 4.5 (左趾V截肢术)MAT M64亚急性 右FP移植物3 45 完全 8.0 6.0 (-)平均值±SEM 65±3.017±5.6 21±5.8 9.7±1.79.1±2.7SakSTAR(K74A)LIE M70亚急性 右FF移植物 10 48 完全 11 9.0 PTAENG M50 跛足 右SFA 28 10 完全 12 10 PTACOX F48 跛足右PA移植物 257 部分 15 15 PTAMAN F68 跛足 右SFA≥120 9 完全 9.0 7.0 PTAVHE M47 急性右IF移植物 10 54 完全 18 16 手术移植矫正MUL F51 急性 右IF和FP移植物 1 63 完全 16 20 PTABUR F67静止痛 右TF干9.0 38 部分 18 21-NIJ F60静止痛 左AF移植物 23 78 完全 15 21-POE*M49亚急性 右TF干 230 部分 6.0 4.0rt-PA,手术移植延长VBE M39亚急性右BA(栓塞) 20 28 完全 18 23 右SC动脉支架,第一肋切除SME F50亚急性 TF干 18 32 完全 21 19无WOL M67亚急性 右PA 4 25 完全 16 22-平均值±SEM 56±3.0 23±9.2 35±6.4 15±1.2 16±1.9SakSTAR(K74A,E75A,R77A)JAC F65 急性 右BA和UA 0.3 5 完全 14 12-MAE M74静止痛 左SFA10 50 完全 9.0 7.0 PTACRA F52 跛足右IA和FA动脉 14 28 完全 25 23 PTA+支架VDB M68 跛足左SFA90 12 完全 9.07.0 PTADUN M71亚急性 左SFA14 6 完全 9.07.0 PTADEL M59 急性 右FT移植物 3 42 完全 9.07.0 PTA平均值±SEM 65±3.3 22±14 24±7.813±2.611±2.6AF股主动脉；BA肱动脉；CIA髂总动脉；FF股腓；FP股腘；FT股胫；IA髂动脉；IF髂股；PA腘动脉；PTA经皮腔内血管成形术；SFA浅股动脉；TF胫腓；UA尺动脉。*1994年用SakSTAR治疗。表3SakSTA的丙氨酸置换变体与固定鼠单克隆抗体(Mab)结合的缔合常数(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血浆抗体的吸附(％)
表3(续)
表3(续)
表3(续)
表4S34、G36和H43的诱变与固定鼠单克隆抗体(Mab)结合的缔合常数(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血浆抗体的吸附(％)
表5K35、Y73、K74、E80／D82、N95、K130、V132和K135的诱变与固定鼠单克隆抗体(Mab)结合的缔合常数(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血浆抗体的吸附(％)
表5(续)
表6SakSTAR(K130T，K135R)与K35A、G36R、E65X、K74X和所选其它氨基酸的组合突变体
表6(续)
表6(续)
缔合常数低≥10倍及抗体吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑体表示；≥100000HU／mg以黑体表示。NT未检测。表7SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)与K35A、G36R、E65X、K74X和所选其它氨基酸的组合突变体
表7(续)
缔合常数低≥10倍及抗体吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑体表示；≥100000HU／mg以黑体表示。NT未检测。表8具有完全比活(≥100kHU／mg)和≤50％的野生型SakSTAR治疗引起的人抗体的吸附的SakSTAR变体
抗体吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑体表示≥100000HU／mg以黑体表示。表9选择的SakSTAR变体在人血浆中的体外纤维蛋白溶解特性
表11用SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)治疗的外周动脉阻塞患者的基线特征和治疗结果
表12SakSTAR变体对外周动脉阻塞患者中SakSTAR变体引起的抗体的吸附
表13
表15用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)治疗的外周动脉阻塞患者的特征
表16用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)治疗的外周动脉阻塞患者的治疗和结果
PTA经皮腔内血管成形术；IF髂股；FT股胫；FP股腘。表17对外周动脉阻塞患者施用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)之前和之后的中和抗体活性
表18SakSTAR变体存外周动脉阻塞患者中的免疫原性
数据表示中值和15-85百分范围。表19SakSTAR的半胱氨酸置换变体
表20用马来酰亚胺-聚乙二醇置换、免疫原性降低的SakSTAR的半胱氨酸置换变体
*SP5OPSS-PEG 5kDa；MP5MAL-PEG 5kDa；P10MAL-PEG 10kDa；P20MAL-PEG 20kDa。
参考文献1．Lack CH葡激酶血浆蛋白酶的一种激活剂。自然(Nature)161559，1948。
2．Lewis JH，Ferguson JH血液的一种蛋白水解酶系统．Ⅲ．葡激酶对狗血清纤溶酶原的激活。美国生理学杂志(Am J Physiol)166594，1951。
3．US5336495(94．08．09公开)。
4．Vanderschueren S，Barrios L，Kerdsinchai P，Van den Heuvel P，Hermans L，Vrolix M，De Man F，Benit E，Muyldermans L，Collen D，Vande Werf F重组葡激酶与阿太普酶用于急性心肌梗塞中冠状动脉开放的随机试验。循环(Circulation)922044-2049，1995。
5．Sako T，Sawaki S，Sakurai T，Ito S，Yoshizawa Y，Kondo I金黄色葡萄球菌的葡激酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达。分子普通遗传学(Molec Gen Genet)190271-277，1983。
6．Behnke D，Gerlach D葡激酶-一种细菌纤溶酶原激活剂-的基因在大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和血链球菌(Streptococcussanguis)中的克隆与表达。分子普通遗传学210，528-534，1987。
7．Collen D，Silence K，Demarsin E，De Mol M，Lijnen HR天然及重组葡激酶的分离与表征。纤维蛋白溶解(Fibrinolysis)6203-213，1992。
8．Sako T，Tsuchida N金黄色葡萄球菌葡激酶基因的核苷酸序列。核酸研究(Nucleic Acids Res)117679-7693，1983。
9．Collen D，Zhao ZA，Holvoet P，Marynen P葡激酶的一级结构和基因结构。纤维蛋白溶解6226-231，1992。
10．Sakai M，Watanuki M，Matsuo O葡激酶的纤维蛋白特异的纤维蛋白溶解机理α2-纤溶酶抑制剂的参与。生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Comm)162830-837，1989。
11．Matsuo O，Okada K，Fukao H，Tomioka Y，Ueshima S，WatanukiM，Sakai M葡激酶的溶栓特性。血液(Blood)76925-929，1990。
12．Lijnen HR，Van Hoef B，De Cock F，Okada K，Ueshima S，Matsuo O，Collen D葡激酶的纤维蛋白特异的纤溶酶原激活机理。生物化学杂志(J Biol Chem)26611826-11832，1991。
13．Lijnen HR，Van Hoef B，Matsuo O，Cllen D纤溶酶原-葡激酶、α2-抗纤溶酶和纤维蛋白之间的分子相互作用。生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)1118144-148，1992。
14．Silence K，Collen D，Lijnen HR．葡激酶、纤溶酶(原)和α2-抗纤溶酶之间的相互作用。α2-抗纤溶酶中和纤溶酶-葡激酶复合物后葡激酶的循环。生物化学杂志2689811-9816，1993。
15．Silence K，Collen D，Lijnen HRα2-抗纤溶酶和纤维蛋白对血浆中重组葡激酶激活纤溶酶原的调节。血液821175-1183，1993。
16．Sakharov DV，Lijnen HR，Rijken DC．葡激酶、纤溶酶(原)和纤维蛋白之间的相互作用。生物化学杂志27127912-27918，1996。
17．Schlott B，Ghrs KH，Hartmann M，Rcker A，Collen D．葡激酶需要NH2端蛋白酶解进行纤溶酶原激活。生物化学杂志(待出版)。
18．Collen D，De Cock F，Vanlinthout I，Declerck PJ，Lijnen HR，Stassen JM．葡激酶与链激酶的溶栓特性和免疫原性比较。纤维蛋白溶解6232-242，1992。
19．Collen D，De Cock F，Stassen JM．狒狒中链激酶与重组葡激酶对动脉和静脉血栓的免疫原性和溶栓特性比较。循环87996-1006，1993。
20．White H对复发心肌梗塞的溶栓治疗。英国医学杂志(Br MedJ)302429-430，1991。
21．Gase A，Hartmann M，Ghrs KH，Rcker A，Collen D，Behnke D，schlott B葡激酶的NH2端和COOH端区在纤溶酶原激活中的功能重要性。血栓与止血(Thromb Haemost)76755-760，1996。
22．EP 95200023．0(1995年1月6日)和US 08／499，092(1995年7月6日)。
23．Schlott B，Hartmann M，Ghrs KH，Birch-Hirschfeid E，Pohl HD，Vanderschueren S，Van de Werf F，Michoel A，Collen D，Behnke D用于溶栓治疗的重组葡激酶的高产量生产和纯化。生物技术(Bio／technology)12185-189，1994。
24．Horton RM，Hunt HD，Ho SN，Pullen JK，Pease LR．不应用限制酶的工程杂种基因通过重叠延伸的基因剪接。基因(Gene)7761-68，1989。
25．BIAcore系统手册，5-2，Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典。
26．Karlsson R，Michaelsson A，Mattsson L用一种基于生物传感器的新型分析系统对单克隆抗体-抗原相互作用的动力学分析。免疫学方法杂志(JImmunol Methods)145229-240，1991。
27．Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T《分子克隆实验室手册》，第二版，冷泉港，NY．冷泉港实验室出版社，1989。
28．Tartof KD，Hobbs CA用于培养质粒和粘粒克隆的改良培养基。Bethesda研究实验室焦点(Bethesda Res Lab Focus)912，198729．Bradford MM一种利用蛋白质-染料结合原理定量微克级蛋白质的快速、敏感的方法。分析生物化学(Anal Biochem)72248，1976。
30．Deutsch DG，Mertz ET纤溶酶原用亲和层析法从人血浆中的纯化。科学(Science)1701095-1096，1970。
31．Collen D，Moreau H，Stockx L，Vanderschueren S．具有改变的免疫反应性的重组葡激酶变体。Ⅱ．溶栓特性和抗体诱导。循环94207-216，1996。
32．Vanderschueren S，Stockx L，Wilms G，Lacroix H，Verhaeghe R，Vermylen J，Collen D用重组葡激酶对外周动脉阻塞的溶栓治疗。循环922050-2057，1995。
33．Gibaldi M，Perrier D．《药物动力学》(Pharmacokinetics)，Marcel Dekker，纽约，N．Y．，1983，45-111。
34．Inada Y，Furukawa M，Sasaki H，Kodera Y，Hiroto M，Nishimura H，Matsushima A．PEG及PM修饰的蛋白质的生物医学及生物技术应用。TIBTECH 1386-91，1995。
35．Collen D，Bernaerts R，Declerck P，De Cock F，Demarsin E，JennS，Laroche Y，Lijnen HR，Silence K，Verstreken M．具有改变的免疫反应性的重组葡激酶变体。I．构建和表征。循环94197-206，1996。
36．Rabijns A，De Bondt HL，De Ranter C．一种具有治疗潜能的纤溶酶原激活剂-葡激酶的三维结构。天然结构生物学(Nature Struct Biol)4357-360，1997。
权利要求
1．与野生型葡激酶相比在向动脉血栓形成患者施用后显示降低的免疫原性的葡激酶衍生物。
2．权利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如图1所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换为另一种氨基酸，从而降低了与一系列鼠单克隆抗体的反应性。
3．权利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如图1所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换为另一种氨基酸，从而降低了用葡激酶治疗的患者血浆中SakSTAR特异性抗体吸附。
4．权利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如图1所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被替换为其它氨基酸，而不使比活降低超过50％。
5．具有如图1所示氨基酸序列的葡激酶衍生物SakSTAR(K35X，G36X，E65X，K74X，E80X，D82X，K102X，E108X，K109X，K121X，K130X，K135X，K136X，+137X)，其中位点35的Lys、位点36的Gly、位点65的Glu、位点74的Lys、位点80的Glu、位点82的Asp、位点102的Lys、位点108的Glu、位点109的Lys、位点121的Lys、位点130的Lys、位点135的Lys和／或位点136的Lys中的一个或多个氨基酸被替换为其它氨基酸，和／或其中在COOH端添加了一个氨基酸，从而改变了向患者施用后的免疫原性，而不明显降低比活。
6．表1、3、4、5、6、7、8、13、19和20中所列的葡激酶衍生物，其具有如图1所示的氨基酸序列，其中指定的氨基酸被替换为其它氨基酸，从而降低了用葡激酶治疗的患者血浆中SakSTAR特异性抗体的吸附，而不降低比活。
7．权利要求1-6的葡激酶衍生物，其选自SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(K35A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(D82A，S84A)、SakSTAR(T90A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(K130A)、SakSTAR(V132A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(G36R)、SakSTAR(H43R)、SakSTAR(G36R，K74R)、SakSTAR(K35E)、SakSTAR(K74Q)、SakSTAR(K130T)、SakSTAR(V132L)、SakSTAR(V132T)、SakSTAR(V132N)、SakSTAR(V132R)、SakSTAR(K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，H43R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K86A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，T71S，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，V132R，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，T90A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K109A，K130，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E108A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K121A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，+137K)、SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65S，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(S34G，G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65N，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K57A，E58A，E61A，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，S103A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R，K136A)、SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
8．编码为SY19的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
9．编码为SY161的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)。
10．权利要求1-9的葡激酶衍生物，其含有一个替换为Cys的氨基酸，导致二聚化和／或增高的比活和／或降低的清除率和／或增强的溶栓能力。
11．具有聚乙二醇取代的权利要求1-10的葡激酶衍生物，其特征在于保持的比活和明显降低的血浆清除率。
12．权利要求10的葡激酶衍生物，其中Cys用分子量可达20kDa的聚乙二醇化学修饰。
13．权利要求12的葡激酶衍生物，其中NH2端区10个氨基酸中的所选氨基酸被替换为用分子量可达20kDa的聚乙二醇化学修饰的Cys，该衍生物的特征在于在以降低剂量单次静脉内大剂量施用后明显降低的血浆清除率和保持的溶栓能力。
14．权利要求13的葡激酶衍生物，其中位点2或3的丝氨酸被替换为半胱氨酸，而该半胱氨酸用分子量5、10或20kDa的聚乙二醇化学修饰。
15．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY161(S3C-MP5)。
16．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY161(S3C-P10)。
17．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY161(S3C-P20)。
18．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY19(S3C-MP5)。
19．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY19(S3C-SP5)。
20．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY19(S2C-SP5，S3C-SP5)。
21．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY19(S3C-P20)。
22．权利要求14的葡激酶衍生物，该衍生物是表20所示的SY19(S3C-P10)。
23．权利要求10的两个葡激酶衍生物的二聚体。
24．生产权利要求1-10的葡激酶衍生物的方法，包括下列步骤a．制备至少包含提供生物活性的葡激酶编码序列部分的DNA片段；b．对该DNA片段进行体外定点诱变，将野生型氨基酸的一个或多个密码子替换为另一种氨基酸的密码子；c．在适当的载体中克隆突变的DNA片段；d．用该载体转化或转染适当的宿主细胞；和e．在适于表达该DNA片段的条件下培养该宿主细胞。
25．权利要求24的方法，其中所述DNA片段是质粒pMEX602sakB的453bp EcoRI-HindⅢ片段，进行体外定点诱变，并在大肠杆菌中表达突变的DNA片段。
26．包含至少一种权利要求1-23的葡激酶衍生物与适当赋形剂的药用组合物。
27．用于治疗动脉血栓形成的权利要求26的药用组合物。
全文摘要
鉴定、生产和应用葡激酶衍生物的方法,其特征在于在对患者施用后免疫原性降低,并且能通过单次静脉内大剂量注射施用。本发明的衍生物的获得方法包括,制备至少包含提供生物活性的葡激酶编码序列部分的DNA片段;对该DNA片段进行体外定点诱变,以将野生型氨基酸的一个或多个密码子替换为另一种氨基酸的密码子;在适当的载体中克隆突变的DNA片段;用该载体转化或转染适当的宿主细胞;在适于表达该DNA片段的条件下培养该宿主细胞。将表达的葡激酶衍生物纯化为均一的,并用硫醇基定点的聚乙二醇化学修饰置换的Cys;该DNA片段优选地是质粒pMEX602sakB(pMEX.sakSTAR)的453bp EcoRI－HindIII片段,通过剪接重叠延伸聚合酶链反应进行体外定点诱变,并在大肠杆菌株TG1或WK6中表达突变的DNA片段。本发明也涉及包含至少一种根据本发明的葡激酶衍生物与适当赋形剂的药用组合物,用于动脉血栓形成的治疗。
文档编号C12N9/12GK1293712SQ99804195
公开日2001年5月2日 申请日期1999年2月4日 优先权日1998年2月4日
发明者德西雷·何塞·科伦 申请人:思罗姆-X股份有限公司, 德西雷·何塞·科伦