专利名称：影响植物的开花行为的手段和方法
技术领域：
本发明涉及一些使提供表现出开花行为已被改变的植物成为可能的手段和方法，具体地说，通过改造植物的基因使它在与野生型植物(即未作相应的改造但在其它方面类似的植物)比较时表现出早成花或推迟成花。本发明还涉及在根据本发明生产转基因植物的方法中可以使用的组织特有的启动子。
在植物中，成花是有性繁殖的前提条件。所以，它对于繁殖不能无性繁殖的植物，以及形成种子和果实是不可缺少的。植物从仅仅营养生长到成花所经历的时间在农业、园艺和植物繁殖中是非常重要的。在许多情况下，花的数量也是经济利益所关心的，例如，就各种有用的植物(象西红柿、黄瓜、夏南瓜、棉花，…)而言，花的数量越多将可能导致产量增加，或用于采摘的观赏植物和花的生产增加。
在许多应用中，植物较早成花是有利的。例如，在农业中，各种有用的植物早开花可以缩短播种和收获之间的时间，从每年可播种两次。另一种选择，是开花和收获之间的时间可以被延长，而作为结果，产量将有可能增加。另外，在植物的繁殖过程中，早成花可以对大幅度缩短繁殖过程作出贡献，并且因此导致提高经济效益。另外，在园艺和观赏植物生产方面，早开花的经济效益也是明显的。
为了阐明在植物中决定成花时间的机理，迄今做过的尝试不能就其中的决定性因素作出明确的结论。各种因素似乎都被卷入或许非常复杂的生物学系统(Bemier，1988，《植物生理学分子生物学年报》(Ann Rev Plant Phys Plant Mol.Biol)39175-219)。众所周知，环境(例如，光的明暗周期、温度和水的供应)的影响决定许多植物从营养生长到成花的转变过程。虽然人们知道植物是怎样实现感知这些刺激的的(在这方面，光敏色素系统的光线受体蛋白质是起作用的)，但是人们不知道这些刺激是怎样被转化或翻译成在顶端分裂组织中诱发成花的生理信号的。各种理论都被讨论过，而且数量十分可观的潜在因素都被考虑进去了，例如，开花激素(成花激素/抗花激素)、碳水化合物、细胞分裂素、植物生长素、多胺和钙离子都在考虑之列(Bemier等人，1993，《植物细胞》(PlantCell)51147-1155)。
在实践中，通过调节外生的刺激(例如，光线的明暗周期、温度或水的供应)来控制成花时间，可能仅仅被达到有限的程度，例如在温室中。所以，为了在野外条件下实现在植物生长过程中早成花，必不可少的是使用排除外生的刺激仍能够早成花的植物。表现出早开花的植物可以通过诱变程序(但是诱变程序并非对所有的物种都适用)，或者通过非常费时而且必须对每个特定的植物种类分开逐一实施的植物繁殖过程，或者通过遗传工程来生产。
就遗传工程的适用性而言，前提条件是对开花时间有重大影响的基因座(gene loci)已经被识别，以及给相关产品编码的DNA序列是可利用的。现在，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CONSTANS基因的基因产品是已知的。这个基因的表达引起这个物种开始开花。但是，为了影响开花行为，在转基因植物中对这个基因有选择的过度表达，从技术上说将是不可行的，因为该基因的组成型表达将导致转基因植物的营养生长阶段的严重缩短，因此将降低产量。Simon等人(1996，《自然》(Nature)38459-62)描述一种就CONSTANS的表达而言可诱导的系统，该系统从技术上说是不能使用的，因为使用引起诱导作用的类固醇激素在农业上是不能接受的。
就已经作为大多数关于调节开花时间的研究课题的物种拟南芥(Arabidopsis thaliana)而言，已经有人介绍过各种比野生型植物早开花的突变型植物(见参考文献Lee等人，1994，《植物细胞》(Plant Cell)675-83)。但是，目前还不可能描述这些突变体的特征。而且，对导致早成花的生物化学原因的阐述也不成功。
Bell等人[1993，《植物分子化学》(Plant Mol.Biol.)23445-451]，描述一种用来自梨酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的cdc25 cDNA转化的烟草植物，这种植物由于这种诱导有丝分裂的蛋白质的表达表现出早成花和大幅度提高花的数量。但是，这些植物是不利的，因为在这些植物中观察到叶子形态的剧烈变化。具体地说，这些植物的叶片是卷曲的。所以，这种方法似乎不适合产生表现出开花行为被改变的有用植物。
为了产生表现出早成花的理想植物，人们不得不仍然依靠传统的育种过程，或者依靠利用诱变作用的方法。在调节开花行为方面，蔗糖剪切蛋白质的任何功能都尚未被考虑。
确实，蔗糖在顶端分裂组织中作为诱导开花的复杂信号的潜在的组成部分已经被反复地讨论过(Bemier等人，1993，《植物细胞》(Plant Cell)51147-1155；Lejeune等人，1993，《植物》(Planta)19071-74；Lejeune等人，1991，《植物生理学·生物化学》(PlantPhysiol.Biochem.)29153-157)；但是，蔗糖剪切蛋白质对开花行为的任何影响既不是已知的，也不是预期的，因为按照Lejeune等人的发现(1993，《植物》(Planta)19071-74)，在某些物种中，蔗糖浓度在顶点附近增加与开花的诱导作用有关联。
此外，在转基因植物中蔗糖剪切蛋白质的表达，通常对所述植物的生长具有很强的负面影响。就烟草植物而言，来自酿酒酵母的酶转化酶的表达，在组成型启动子的控制下，不管蛋白质是否定位在非质体、细胞质或液泡中都在叶子中引起坏死(Sonnewald等人，1991，《植物杂志》(Plant J.)195-106)。
作为本发明的基础的问题是提供一些手段和方法，这些手段和方法使改变植物的开花行为变成可能，具体地说，就是提供一些基因改造植物，这些植物与未作改造的植物相比，将表现出早成花或推迟成花。
这个问题是借助权利要求书中定义的转基因植物、启动子要素、构建体(constructs)、被转化的宿主细胞、过程和使用得以解决的。
因此，第一方面，本发明涉及改造过基因的转基因植物，其中改造基因的要点是引入某种构建体(constructs)，这种构建体(constructs)在转基因植物中存在，将导致与未作改造的野生型植物相比蔗糖剪切活性在所述植物的顶端分裂组织中被特异增强。
基因改造可以是任何导致蔗糖剪切活性在植物的顶端分裂组织中被特异增加的基因改造。相应的基因改造可以通过引入包含转基因的构建体实现，所述的转基因给具有蔗糖剪切活性的蛋白质编码并且被有选择地表达在顶端的分裂组织中，从而增加存在于顶端分裂组织中的蔗糖剪切蛋白质的数量。除此之外，基因的改造可以导致在植物的顶端分裂组织中蔗糖剪切蛋白质的活性增强。例如，这可以受激活蔗糖剪切蛋白质的效应蛋白质的表达或者使蔗糖剪切蛋白质失去活性的抑制蛋白质失去活性的效应蛋白质的表达的影响。因此，包含在该构建体内的转基因可以给具有激活蔗糖剪切蛋白质活性的效应蛋白质编码。就使抑制蛋白质失去活性而言，该构建体可以包含类似于Faske等人的实验结果(《植物生理学》(PlantPhysiol)115，(1997)705-715)，与转录后的水平或DNA水平有关的被杂交到mRNA上的特定的“反义”核酸或导致杂交现象的特定的“有义”核酸的基因信息，两者都借助与同源性有关的基因沉默导致消除或至少大幅度减少蔗糖剪切蛋白质的抑制蛋白质的翻译。这样的抑制蛋白质的实例，是自烟草的非质体转化酶的转化酶抑制剂(Greiner等人，《植物生理学》(Plant Physiol)116，(1998)，733-742；Krausgrill等人，《植物杂志》(Plant Journal)13，(1998)275-280)和对酸稳定的来自马铃薯块茎的转化酶的抑制剂(DeHostos等人，《植物生理学》(Plant Physiol)147，(1995)，334-340)。
在本说明书中，术语“构建体”意味着覆盖任何可能的基因信息形式，这些基因信息形式把本发明的思路中必不可少的信息提供给特定的靶细胞。因此，术语“构建体”包括任何核酸分子以及它们的任何类似物，包括在相关的细胞系统就特有的识别而言必不可少的空间结构特点的维护下的碱基序列。因此，术语“构建体”、“核酸”和“核酸分子”覆盖DNA、RNA、DNA-RNA-杂化物以及它们的合成类似物，例如PNA，即所谓的肽核酸，其中DNA或RNA的糖-磷酸盐主链已被肽主链取代。在PNA中，碱基序列被结合到所述的肽主链上，同时维持前者的形态(空间排列)与DNA或RNA分子内的形态相对应。在现在的意义上，唯一必不可少的是由构建体(核酸分子)中的碱基序列提供的信息将被靶细胞识别，并且可以被用来复制和/或转录。
在本发明优选的实施例中，改造基因的要点在于把包含转基因的构建体引入植物的基因组，所述的转基因给蔗糖剪切蛋白质编码，尤其是给转化酶(invertase)编码，其中转基因的表达特异地发生在顶端的分裂组织中。
在这个特定的意义上，术语“特异”或“特异地”的意思是，对应增强蔗糖剪切活性的起作用的构建体部分(例如，转基因、“反义的(antisense)”或“有意的(sense)”DNA部分，特别是给具有蔗糖剪切活性的蛋白质编码的转基因)是在植物的顶端分裂组织中而不是在植物的其它部分(例如，成熟的叶子、块茎或种子)中被转录和表达(后者非必选)。
此外，“顶端分裂组织特异的”也是在顶端分裂组织中的转基因的表达远远高于植物其它部分(例如，成熟的叶子和/或块茎和/或种子)的情况下被接受的，例如，至少高2～5倍，优选5～10倍，特别优选高10～100倍。
“转基因”的意思是依据本发明的植物包括至少一个被稳定地结合在基因组中的前面定义的构建体，所述的构建体优选包含给具有蔗糖剪切活性的蛋白质编码的转基因。
在本文中，“转基因”意味着在靶植物中通常观察不到的，或者，换句话说，在不同的基因环境中通常在靶植物范围内被观察到的核酸分子。就后者而言，通常已经存在于靶植物中的基因在不同于自然的即野生型的基因环境中还将被找到。例如，在把转基因引入靶细胞的基因组之后，该转基因将在不同的基因座上找到。优选的是，转基因被结合在某个包含各种要素的构建体中，这些要素通常与所述的转基因无关，或者不在这个特定的等级中。根据本发明通过基因改良的植物也可以包括补充性的基因改造，例如使之具有抗灾害性或植物保护剂的转基因，或者导致提高产量的转基因。
根据本发明的植物，优选包括至少一个转基因，其中后者特别地与为转基因在所述植物的顶端分裂组织中转录准备的调节性核酸序列要素相结合，具体地说，与顶端分裂组织特有的启动子以及转达转基因的翻译产品的非质体定位信息的以蛋白质为目标的信号序列(后者非必选)相结合。
在本发明的优选实施例中，转基因为具有蔗糖剪切活性的蛋白质编码。
可以在本发明中使用的具有蔗糖剪切活性的蛋白质的特征是能够在植物(planta)中催化蔗糖的糖苷键断裂。
在本发明的某个特定实施例中，转基因为优选来源于植物的蔗糖合成酶(E.C.2.4.1.13)编码。给蔗糖合成酶编码的核酸序列已有人描述，例如，Salanoubat和Belliard(Gene60，(1987)，47-56)，并且可以按照登录号X67125在EMBL数据库中找到。进一步的蔗糖合成酶编码序列，可以按照各种各样的登录号(例如，AJ 010639(Anabaenasp.)、AJ 011319(L.esculentum)、AJ012080和AJ001071(两者见P.sativum)、L03366(Oryza sativa)，AJ001117和AJ000153(两者T.aestivum)、AJ132000和AJ131999(两者都来自C.plantagineum)、AJ131964和AJ131943(两者都来自M.truncatula))在NCBI和基因分子库(GenBank)数据库中找到。
在进一步的实施例中，转基因给蔗糖磷酸化酶(E.C.2.4.1.7)编码。相应的序列是在WO96/24679等文献中描述的，或者是可以在NCBI数据库中按照为数众多的登录号(例如，Z22732(A.vitis)、E03420和D90314(两者见L.mesenteroides)、M77351(S.mutans)、AF 158367(P.saccharophila))找到的。
在进一步的实施例中，转基因给可以作为例如细菌、真菌或植物起源的果糖基转移酶编码。给细菌型果糖基转移酶编码的序列可以按照各种登录号，例如，X75079(E.amylovora)，X02730(B.subtilis)，X52988(B.amyloliquefaciens)，L34331(Z.mobilis)，U91484(R.aquatilis)，AF052289(P.syrinqae)和U34874(B.stearothermophilus))在NCBI数据库中找到。另一种细菌型果糖基转移酶已经被hiroza和Kuramitsu介绍过(J.Bacteriol.，170，(1988)，810-816)。
真菌型果糖基转移酶可以找到，例如，在登录号AJ000493(A.foetidus)下以及在德国专利申请DE 19840028.4(A.sydowi)中。来自植物的果糖基转移酶也曾有人描述过，例如，在DE19708774.4(C.scolomus)、DE19749122.7(C.scolomus)和PCT/NL96/00012(H.tuberosus)中。
在本发明进一步的实施例中，转基因给葡糖基转移酶编码。在葡糖基转移酶当中有一些可以引用，例如，右旋糖苷蔗糖酶(在登录号U38181、AF030129下的序列)，淀粉蔗糖酶(WO95/31553、PCT98/05573)和交替蔗糖酶(alternan sucrases)(DE19905069.4)。
在本发明的优选实施例中，转基因为可以作为植物、细菌或真菌起源的转化酶(E.C.3.2.1.26)编码。例如，给细菌型转化酶编码的序列可以按照下述的NCBI数据库登录号D10465和L33403(Z.mobilis)、AF015307(A.pasteurianis)、AF084030(E.coli)被找到。例如，给真菌型转化酶编码的序列可以按照登录号V01311、K00540、X07572、X07570(全部是Saccharomyce cerevisiae)、AF029359和L068044(两者是A.niger)找到。例如，植物型转化酶可以按照NCBI或基因分子库(GenBank)的登录号X73601(A.sativa)、D10265(V.radiata)、AB 004558(L.esculentum)、AJ006067(A.cepa)、AF050631、AF03042(T.aestivum)、AF063246(P.sativum)、X 95821(S.tuberosum)、X81797和X81796(B.vulqaris)、AF155121(O.sativa)、Y16262(D.carota)、AF050128、AF050129、AF043346和AF043347(全部Z.mays)、AF030420(T.aestivum)被找到。
在特别优选的实施例中，转基因给来自酿酒酵母的转化酶编码，这种转化酶在植物中被定位在非质体(apoplast)中(Sonnewald等人，《自然生物工艺学》(Nature Biotechnology)15，(1997)，794-797)。
在进一步特别优选的实施例中，转基因给来自酿酒酵母的转化酶编码，这种转化酶在植物中被定位在植物细胞的细胞溶胶中(Sonnewald等人，《植物杂志》(Plant J.)1，(1991)，95-106)。
根据本发明的植物，可以与自然发生的植物有明显区别，除了其它方面，它们包括至少一个并非自然存在于这些细胞中的构建体的复本，或者如果该构建体包含已经存在于目标植物的基因组中的转基因，那么所述的转基因已经在该植物的基因组范围内结合在某个并非自然发现的座位上，即在不同的基因环境中。
如果被引入目标细胞的构建体包含已经存在于该目标细胞中的核酸分子的补充性复本，那么本发明的植物可以与引入所述的构建体之前的目标植物有明显的区别，尤其与自然发生的植物有明显区别，具体地说，它们包含这些核酸分子的一个或多个补充性复本，这些复本在该基因组中被定位在并非自然发生的座位上。这可以通过，例如，DNA Southern印记分析被确定。
此外，本发明的植物可以优选通过下述特点之一明显地区别于自然的植物如果引进的构建体中待转录的核酸分子部分相对靶植物细胞/靶植物是异种的，那么所述的转基因植物有并非在野生型植物中自然发生的引进的核酸分子转录本。这些可以借助RNANorthern印记分析进行检测。优选的是，根据本发明的植物，包含某种蛋白质，这种蛋白质借助包含在该构建体中的转基因被编码。这种蛋白质可以被检测，例如，借助免疫学的方法，尤其是借助蛋白质印记分析。如果引进的构建体包含一些与靶植物同源的部分(例如，转基因)，那么依据本发明的转基因植物可以与非转基因植物有明显的区别，例如通过引进的转基因的补充性表达。此外，转基因的植物将优选包含相关的核酸酸分子的多个转录本。这可以被检测，例如，通过Northern印记分析。
在现在的意义上，“改造基因的”或“基因改造”意味着包含在植物中的基因信息通过引入构建体被改变，以及意味着该构建体的存在、该构建体或该构建体的某些部分的转录或者包含在该构建体中的转基因的表达将导致所述植物的表型变更。在这个意义上，“表型变更”意味着植物的一个或多个功能发生可察觉的变更。例如，依据本发明的植物，由于构建体的存在，或者由于包含在构建体中的转基因的表达，表现出蔗糖剪切活性增加。
“蔗糖剪切活性增强”或“蔗糖剪切活性增加”意味着在可以借助已建成的测定方法进行测量的靶组织中相应的酶的活性增强。例如，在本发明的范围内，蔗糖剪切活性的增加，可能是由于下述现象之一●具有蔗糖剪切活性的蛋白质的数量增加，和/或●蔗糖剪切蛋白质的活性增加，例如，由于效应蛋白质的表达使蔗糖剪切蛋白质激活，或使蔗糖剪切蛋白质失去活性的抑制蛋白质失去活性。
蔗糖剪切活性的增加(例如，在植物组织中)，可以通过测定蔗糖释放葡萄糖或果糖的过程予以确定，这个释放过程，受被研究的组织的蔗糖剪切蛋白质的活性的催化。优选的是，这样的增加，意味着由于来自通过基因改良的植物细胞的蛋白质提取物的催化，即蔗糖剪切活性被释放的葡萄糖或果糖的量，与受来自未通过基因改良的植物细胞的蛋白质提取物催化的葡萄糖或果糖的释放相比，至少增加10％，优选至少增加20％，更优选的至少增加50％，特别优选至少增加75％。
如果蔗糖剪切活性的增强，是由于具有蔗糖剪切活性的一种或多种蛋白质的数量的增加，那么这种特定的蛋白质或这些特定的蛋白质的数量的增加，也可以通过蛋白质印记分析(western-blotanalysis)被确定。在这个特定的范围内，“增加”意味着相对植物细胞中蛋白质的总量具有蔗糖剪切活性的蛋白质的数量在与相应的未改造基因植物细胞比较时有所增加。
业已令人吃惊地发现，借助特异增强在植物顶端分裂组织中的蔗糖剪切活性，植物的开花行为可以受到影响。
在本发明特定的实施例中，就将在细胞组织中引起蔗糖剪切活性增强的构建体的顶端分裂组织特有的转录和表达(后者非必选)而言，该构建体包含把蔗糖剪切活性的增强特异引向顶端分裂组织的启动子。在这里以及在下文中，“特异的”将具有与前面的说明相同的意思。启动子可以是具有必要的组织特异性的自然发生的启动子，可以来源于这样的启动子，或者可以是完全按设计合成的启动子，例如，借助“制造分子模型(molecular modelling)”的运用。
被描述成属于顶端分裂组织特有的启动子已被揭示，例如，在WO97/10339中。此外，在Brassica oleracea(花椰菜)中的突变是已知的，它导致表现出非常显著的分枝的顶端分裂组织的巨大发展(Sadik，1962，American J Bot 49290-297)。通过使用这个突变体，可以借助相减杂交(substractive hybridization)提供分裂组织特有的cDNA文库，以及分离各种分裂组织特异的基因(Medford等人，1991，Plant Cell 3359-370)。由于在芸苔属和拟南芥属之间的高同源性在，识别A.thaliana中相应的基因是可能的。一个克隆携带标识meri-5(ATHMERI5G，IDg166777，ACM63166)，并且表现出与木葡聚糖转糖苷内切酶(xyloglucanendotransglycosylase)的相似性(Medford等人，1991)。分裂组织特有的表达已经借助在拟南芥和烟草中转录的启动子-GUS-融合被检测出来(Medford等人，1991)。就本发明的特定途径即蔗糖剪切蛋白质在植物的顶端的分裂组织中特有的表达而言，这个启动子在拟南芥中使用时原来不是充分特有的。
就来自ATK1基因，(一种来自拟南芥的基因，它属于Knotted1基因族)的3.5kb XbaI/BamHI启动子片段而言，如果被用在与GUS融合中，那么有可能在转基因的拟南芥属植物中检测发芽顶端分裂组织(SAM)的特异表达(Dockx等人，《植物分子生物学》(PlantMol.Biol.)，28，(1995)，723-737)。进一步的分裂组织特有的启动子已经被Mudge等人(《澳大利亚植物生理学杂志》(AustralianJournal of Plant Physiology)25，(1998)，637-643)、Yokoyama等人(《ERECTA启动子》Promoter；《植物杂志》(Plant Journal)15，(1998)，301-310)和Long等人(《STM1基因的启动子》(Promoterofthe STM1 gene)；《自然》(Natrue)379，(1996)，66-69)描述过。
在本发明的优选实施例中，顶端分裂组织特有的启动子像在所附序列表序列识别No.1中描绘的那样，是来自拟南芥的完整的KNAT启动子。这个启动子在这里被初次介绍，并且其本身是本发明的一部分。如果没有最后四个核苷酸，在序列识别No.1中给定的序列，对应于自然发现的来自拟南芥的KNAT1基因的启动子的序列。KNAT1基因对来自玉米的Knotted1(KN1)基因呈现同源性，后者对应形成叶脉的结状隆起。为了引进适合插入用来在这个启动子的控制下表达的转基因的限制内切核酸酶识别部位，已通过克隆添加最后四个核苷酸。
包含KNAT启动子(在3’末端再包括一个核苷酸)的KANT1基因的5’不翻译段的完整序列，是在序列识别NO.2(nt.l-nt.1475)中描绘的。核苷酸1476～1500代表用于KNAT1蛋白质的第一个N-端氨基酸的密码子。
在本发明进一步的优选实施例中，顶端分裂组织特有的启动子是在序列识别NO.1中给定的序列的功能部分，该部分把编码核甙酸序列的转录和表达(后者非必选)置于其控制之下，特异引向植物的顶端分裂组织。
在这种连接中，“功能部分”除了其它方面还涉及一些序列，这些序列尽管缺乏非本质的DNA部分，但仍然拥有预期的功能，例如，启动子的活性和组织或器官的特异性。这包括只包含来自在序列识别NO.1中描绘的序列的一个、两个或多个部分的启动子，例如，其中在序列识别NO.1的序列范围内，对于预期的功能并非必不可少的DNA片段已被删除。相应的启动子实例是具有来源于序列识别NO.1的序列的启动子，其中包含在其中的一个或两个可译框架(ORF)(nt.1111-1122；nt.1269-1292)，或包括所述的ORF的一个或两个更大的段落已被删除。
本发明还涉及在此描述的启动子序列和功能部分或片段的自然发生的变种，以及人造的或合成的启动子序列，后者是可以设计的，例如从序列识别NO.1的核苷酸序列出发，通过化学合成考虑植物的特定密码子使用。
此外，只要就顶端分裂组织而论，象启动子活性和组织特异性那样的必不可少的功能被保持，通过核苷酸的添加、取代、删除、插入或修饰，从序列识别NO.1中给定的序列或其功能部分派生的启动子也可以被使用。该序列相应的修饰，可以针对以进一步缩小其中包含的启动子序列，或者，例如，以引进适合克隆的限制核酸内切酶剪切部位。例如，从序列识别NO.1中给定的序列或其功能部分派生的启动子，对起始序列可以呈现至少50％，优选至少65％，特别优选至少80％，更优选至少90％，甚至至少95％的同源性，即同一性。
“衍生的启动子”特别包括具有从序列记录(sequence protocol)中描绘的序列，或其某些部分在下面定义的严格条件下与来自序列记录或其某些部分的相应的起始序列杂交派生出来的DNA序列的启动子。
启动子序列的功能部分还包括与野生型启动子相比呈现启动子活性升高或降低的启动子变化。
在本发明的进一步的实施例中，人们可以使用来自KNOTTED1发育同源序列基因的基因家族的KNAT1同源基因之一的启动子，只要所述的启动子指导被置于其控制之下的核苷酸序列的顶端分裂组织特有的表达。
因此，本发明还适合一些给来自一组KNAT1蛋白质的蛋白质编码的基因的启动子，并且对来自拟南芥的KNAT1基因的核苷酸序列的编码区总是呈现至少50％，优选至少65％，特别优选至少80％，更优选至少90％的同源性(即同一性)，以使启动子指导在它们控制下的编码核苷酸序列的顶端分裂组织特异的表达。
来自拟南芥的KNAT1基因的序列已被Lincoln等人描述过(《植物细胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876)，并且已被存放在基因分子库(GenBank)数据库之中，登录号为U14174。在本发明的中，KNAT1同源因优选那些对来自拟南芥的KNAT1基因的核苷酸序列的编码区，呈现至少50％，优选至少65％，特别优选至少80％，更优选至少90％的序列同一性的基因。
对来自拟南芥的KNAT1基因呈现同源性的DNA序列可以被识别，例如，利用计算机与已知的序列进行序列对比。同源性百分比的确定可以利用市面上出售的计算机程序(例如，“最佳拟合(Bestfit)”程序[威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence AnalysisPackage)])，用于Unix操作系统的第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711))来完成。此最佳拟合程序以Smith和Waterman的算法(《应用数学进展》(Advances in Applied Mathematics)2，(1981)482-489)为基础寻找两个序列之间序列同一性最高的部分。如果使用“最佳拟合”程序来确定特定的序列与基准序列的同一性是否达到某种程度(例如95％)，那么各种参数优选以这样的方式设定，即在允许在基准序列范围内同源性缺口不超过核苷酸总数5％的情况下，沿着基准序列的总长度计算同一性百分比。如果使用“最佳拟合”程序，那么所谓的非必选参数优选保持它们的默认值不变。
作为替代，KNAT1同源基因可以用下述方法予以识别，即利用存放在基因分子库(GenBank)登录号U14174或其某些部分下的序列，来筛选cDNA或基因组文库。适当的筛选技术对于熟练的科学家是应知的(例如，参阅J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，(1989)，《分子克隆实验室手册》(Molecular cloninga laboratorymanual)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)。此外，基于计算机的序列比较，也可以利用存放在基因分子库(GenBank)登录号U14174或其某些部分下的氨基酸序列，完成关于氨基酸序同源水平的比较。
在识别KNAT1的同源cDNAs、基因或蛋白质之后，属于这些同源的cDNA、基因或蛋白质的启动子，将按照技术上已知的方法被分离和识别。然后，可以利用下面将详细描述的报道基因，通过实验分析这些被分离的启动子的表达特征。
来自玉米且与来自拟南芥的KNATl基因同源的Knottedl(KN1)基因，是第一个由植物无性繁殖的发育同源序列基因(Hake等人，《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)8，(1989)，15-22；Vollbrecht等人，《自然》(Nature)350，(1991)，241-243)，并且已被广泛研究。在关于玉米植物中对形成叶脉纽结形隆起有关的显性变异的研究过程中，这个基因曾被检测过。这个特征表型是把相关的基因座命名为KNOTTED的理由(Gelinas等人，《美国植物学杂志》(American Journal of Botany)56，(1969)，671-678；Freeling和Hake，《遗传学》(Genetics)111，(1985)，617-634)。在分离KN1基因之后，对突变体的详细研究表明，这种表型是KN1基因在变形叶子的横向脉管中异常表达的结果(Sinha和Hake，《发展的生物学》(Developmental Biology)141，(1990)，203-210)。在野生型植物中，KN1是在发芽顶端分裂组织(SAM)中被表达的，而在正在展开的导管中仅仅达到稀少的程度(Smith等人，《发展》(Development)116，(1992)，21-30)；此外，这个基因或许被卷入维持分裂组织的无差别状态(Smith等人，1992；Sinha等人，《基因和发展》(Genes & Development)7，(1993)，787-795；Jackson等人，《发展》(Development)120，(1994)，405-413)。KN1发育同源域(homoeodomain)的结构就发育同源蛋白而言是典型的，并且是由N端臂和三个α螺旋组成的，其中第二和第三个螺旋形成典型的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构(Hake等人，伦敦皇家学会哲学学报—系列B生物科学(Philosophical Transactions of theRoyal Society of London-Series BBiological Sciences 350，(1995)，45-51)。
在此期间，已经从玉米(Vollbrecht等人，《自然》(Nature)350，(1991)241-243；Kerstetter等人，《植物细胞》(Plant Cell)6，(1994)，1877-1887)、烟草(Feng和Kung，《生生物物理学研究物化学和通讯》(Biochemical & Biophysical ResearchCommunications)198，(1994)，1012-1019)、稻谷(Matsuoka等人，《植物细胞》(Plant Cell)5，(1993)，1039-1048)、大豆(Ma等人，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)24，(1994)，465-473)、番茄(Hareven等人，《细胞》(Cell)84，(1996)，735-744；Janssen等人，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)36，(1998)，417-425)以及拟南芥(Lincoln等人，《植物细胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876)中分离出大量类似的基因。由于在发育同源域和ELK域中的大序列同源性(ELK域保留在发育同源域前面有24个氨基酸的序列，而且就那组类似于KNOTTED1的发育同源蛋白而言是典型的(Meisel和Lam，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)30，(1996)，1-14))，这些基因被分配给KNOTTED1发育同源序列基因的基因家族(Kerstetter等人，《植物细胞》(Plant Cell)，6，(1994)，1877-1887)。来自拟南芥的KNAT1基因在表达型和功能两方面，表现非常类似于来自玉米的KN1基因(Lincoln等人，《植物细胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876；Chuck等人，《植物细胞》(Plant Cell)8，(1996)，1277-1289)。借助原位杂交，有可能证明在营养生长阶段KNAT1 RNA在SAM的边缘区和“肋()rib”区特别集中(Lincoln等人，《植物细胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876；Jackson等人，《发展》(Development)120，(1994)，405-413)。
启动子的活性可以被测定，例如，借助确定按照本发明已经被置于启动子的调节控制之下的特定的标志基因的表达率。
有代表性的适当的标志基因实例是来自大肠杆菌(E.coli)的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，或绿荧光蛋白(GFP)基因(Baulcombe等人，《植物杂志》(Plant J.)7(16)，(1993)，1045-1053)。通过比较在植物的各种组织或器官中获得的上述标志基因的表达率，容易确定器官或组织的特定性(specificity)。
原则上，真核生物的RNA聚合酶II的启动子的活性，是通过各种反式激活因子(DNA结合蛋白)的增效协同作用确定的，其中反式激活因子结合到该启动子序列中存在的各种顺式的DNA调节要素上。这些因子直接或间接与最终导致在转录起点附近形成起始前复合物的基础转录机构的一个或多个因子相互作用[Drapkin等人，1993，《在细胞生物学方面的流行观点》(Current Opinion inCell Biology)5469-476]。看来值得一提的是，真核生物的RNA聚合酶II的启动子的模块结构(modular structure)，其中各种顺式要素(模块)的组成部分，决定启动子的总活性(Tjian和Maniatis，1994，《细胞》(Cell)77，5-8)。这种模块结构已被阐明，例如关于花椰菜花斑病病毒(CaMV)的35S启动子的研究(Benfey和Chua，1990，《科学》(Science)250959-966；Benfey等人，1990，《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)91677-1684；Benfey等人，1990，《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)91685-1696)。由组织的特有的不同，-343到+8(相对于转录起始点)的启动子的各种子限制酶切段呈现在转基因的烟草植物中，该启动子已被分成6个子域。因此，受完整的启动子指导的强组成型表达，被分成各个组织特有的局部活性。
按照本发明可能引起组织特异性的各个启动子子域，可以通过融合到包括被置于最小的启动子的控制之下的报道基因的盒(cassettes，借指DNA序列组件)中被识别。最小的启动子，是包括在转录起始点或起始序列上游大约20至30个碱基对的TATA箱(box)(Smale和Baltimore，《细胞》(Cell)57，(1989)，103-113；Zawel和Reinberg，《国家科学院学报》，(Proc.Natl.Acad.Sci.)44，(1993)，67-108；Conaway和Conaway，《生物化学研究年鉴》(Annu.Rev.Biochem)62，(1993)，161-190)。最小的启动子实例是给-63至+8的D35S启动子(Frohberg，1994，博士论文(Ph.D.thesis of the FU Berlin，FB Biologie，Federal Republic of Germany))、-332至+14的最小的马铃薯糖蛋白I类启动子和-176至+4的最小的PetE启动子(Pwee等人，《植物学杂志》(Plant J.)3，(1993)，437-449)。
此外，按照本发明的启动子相关的子域或顺式要素，还可以通过删除分析或诱变进行检测(Kawagoe等人，1994，《植物学杂志》(Plant J.)5(6)885-890)。这样的子域或顺式要素的功能性检测，可以借助检测在植物中转化细胞的报道基因的活性来完成。在本文中，“启动子序列的功能部分”也包括来自序列识别NO.1中给定的核苷酸序列的这样的子域或顺式要素，这些子域或要素把在它们控制之下的编码核苷酸序列的表达特异引向的顶端的分裂组织。
人们进一步了解到，子域或顺式要素可以通过多聚作用被大大增强。例如，就CaMV 35S启动子而言，250bp片段的串联二聚作用，曾导致启动子的活性增加10倍(Kay等人，1987，《科学》(Science)2301299-1302)。就CaMV 35S启动子的子域B5而言，如果这个域是以四聚体而不是以单体的形式存在的，那么可以检测到该启动子构建体的活性大幅度增加(Benfey等人，1990，《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)9；1685-1696)。
因此，在进一步的实施例中，本发明涉及来自基因识别NO.1中给定的核苷酸序列的子域或顺式要素的二聚体和多聚体，以及包括所述的二聚体或多聚体的启动子。
在本发明的进一步的实施例中，通过选择被并入构建体的顶端分裂组织特有的增强子，指导转录和表达(后者非必选)的组织特异性。此外，通过顶端分裂组织特有的增强子与启动子相结合，变成可能是也可能不是顶端分裂组织特有的启动子，该启动子的活性与不包含所述的增强子的野生型启动子相比可以得到增强。
通常引起表达的组织特异强化的各种增强子，在文献中有所描述。这种组织的特异性(tissue specficity)，通常借助特别利用的增强子予以确定(Benfey等人，《科学》(Science)250，(1990)，959-966；Benfey等人《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)8，(1989)，2195-2202；Chen等人，《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)7，(1988)，297-302；Simpson等人，《自然》(Nature)323，(1986)，551-554)。
此外，存在像PetE增强子那样的增强子(Sandhu等人，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)37，(1998)，885-896)，这些增强子在组织特有的路径中不起作用，因此，可以作为只有数量的要素在顶端分裂组织特有的启动子(例如，依据本发明的启动子)的前面被利用。至此，相关的构建体的表达将在顶端的分裂组织中被增强，而且不影响该启动子的组织特异性。
此外，可以使用合成的增强子，这些增强子可从自然发生的增强子衍生得到，和/或通过各种增强子的合并得到。
就增强构建体中包含的转基因的转录而言，构建体还可以包括所谓的“基质附着区”，也叫做“支架附着区”(参阅，例如，Allen等人，《植物细胞》(Plant Cell)5，(1993)，603-613；WO97/27207；WO98/16650；Vain等人，《植物学杂志》(Plant J.)18(3)，(1999)，233-242)。通过增强转录，可以导致被强化的翻译，因此，就植物内的靶位置而言，将增加蔗糖剪切蛋白质之类的转基因的基因产品的量。
在已经发现了植物的开花行为可以由于蔗糖剪切的活性明确地在顶端的分裂组织中增强而受到影响之后，意外地注意到可以通过在顶端的分裂组织范围内蔗糖剪切活性的分区特定的强化来实现特定的提前或推迟开花。
意外地发现，如果通过构建体从中调节或引入的蔗糖剪切活性被定位在顶端分裂组织的非质体中，那么依据本发明的植物与相应的未被改造的野生型植物相比呈现早成花。反之，如果蔗糖剪切活性的增强被定位在顶端分裂组织细胞的细胞质中，那么与相应的未被改造的野生型植物相比观察到迟延成花。
所以，本发明还包括与相应的未被改造的植物相比呈现早成花或迟延成花的转基因植物。
在本发明的上下文中，“未被改造的植物”或“野生型植物”涉及用于依据本发明的植物产品的起始材料。因此，未被改造的或者野生型的植物的遗传信息，与依据本发明的植物相对应，但是，为了影响开花行为被特别引入的基因信息除外。
“早成花”意为被转化的植物比野生型植物至少早几天开花，例如，早2～10天，优选一周或多周，特别是2～6星期。
“推迟成花”意为被改造的植物比野生型植物晚几天开花，例如，晚2～10天，优选一周或多周，特别是2～6星期。
在本发明的优选实施例中，构建体包括转基因，被增强的蔗糖剪切活性特有的非质体定位可以实现，例如，通过在构建体中提供一个或多个指导用转基因编码的非质体定位的以蛋白质为目标的信号序列。例如，可以使用蛋白酶抑制剂II基因的信号序列(Keil等人，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)14，(1986)，5641-5650；yon Schaewen等人，《欧洲分子生物学定期刊物》(EMBO Journal)9，(1990)，30-33)，或者来自马铃薯的仅仅给氨基酸l至33编码马铃薯糖蛋白基因B33的信号序列片段(Rosahl等人，1986，MolGen Genet 203214-220)，或者来自解淀粉欧文氏菌的蔗糖6-果糖转移酶基因的片段(Geier和Geider，1993，Phys Mol Plant Pathol 42387-404)作为信号序列。另一种信号序列已被Oshima等人描述过[《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，(1990)，181]。
蔗糖剪切活性在顶端的分裂组织的细胞的细胞质中被特异增强，可以具体地通过使用上述的启动子或启动子要素得以实现，所述的启动子或启动子要素指导引起蔗糖剪切活性在细胞组织中强化的构建体的顶端分裂组织特异的转录和表达(后者非必选)。这些启动子和启动子要素特异地在分裂组织顶端的细胞的细胞质中引起构建体的转录和表达(后者非必选)。
另外，在顶端分裂组织的细胞的细胞质中构建体的组织特有的转录和表达(后者非必选)可以通过在构建体范围内使用顶端分裂组织特有的增强子序列得以实现，这在前面已经详细地提出要点。在后一种情况中，启动子序列既可以是组织特有的，又可以不是组织特有的。例如，就这种情而言，可以使用在与最小的启动子相结合时包含顶端分裂组织特有的增强子的构建体。
蔗糖剪切活性分别在顶端分裂组织的非质体中和顶端分裂组织的细胞的细胞质中的组织和区室特异的增强，可以通过在本发明的方法中所使用的构建体范围内，使用像上述的增强子和/或“基质附着区”(“支架附着区”)那样的补充性转录增强子要素，使得到进一步增强。
依据本发明的植物，可以属于任何植物种属，即可以是单子叶植物或者双子叶植物。优选的是，它们将是农业上有用的植物，即人类为了生产食物或技术应用，尤其是产业应用的目的耕作的植物。优选的是，本发明涉及生产纤维的植物(例如，亚麻、大麻、棉花)，油料的植物(例如，油菜、向日葵、大豆)，储备淀粉的植物(例如，小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、稻谷、豆、木薯)，储备糖的植物(例如，甜菜、甘蔗)和储备蛋白质的植物(例如，豆类、谷类、大豆)。本发明还涉及果树和棕榈科植物。
在进一步的优选实施例中，本发明涉及饲料植物(例如，饲料和牧场植物以及禾本科植物，例如紫花苜蓿、三叶苜蓿、黑麦草)，蔬菜植物(例如，西红柿，生菜，菊苣)和观赏性植物(例如，郁金香、风信子)。优选的是饲料植物，豆，向日葵，西红柿。特别优选的是烟草、玉米、大豆、甜菜、生菜、油菜和稻谷。油菜是更优选的。
本发明还涉及与野生型植物相比表现出早成花的转基因植物的生产过程，其中包括
(a)构建体引入植物细胞，其中所述构建体在植物细胞中的存在、完全或部分的转录或表达导致与野生型植物相比，蔗糖剪切活性在顶端分裂组织的非质体中被特异增强；(b)从在步骤(a)中获得的植物细胞的再生植物；(c)非必选的步骤，从在步骤(b)中获得的再生植物产生另一些植物。
此外，本发明涉及与野生型植物相比表现出推迟成花的转基因植物的生产过程，其中包括(a)构建体引入植物细胞，其中所述构建体在植物细胞中的存在、完全或部分的转录或表达导致与野生型植物相比，蔗糖剪切活性在顶端分裂组织的细胞的细胞质中被特异地增强；(b)从在步骤(a)中获得的植物细胞再生植物；(c)非必选的步骤，从在步骤(b)中获得的再生植物产生另一些植物。
就按照上述过程的步骤(a)把基因改造引入植物细胞而论，前面已经提及要点，在依据本发明的植物方面同样适用。依据步骤(b)的植物再生，可以按照熟练的科学家众所应知的方法予以完成。按照步骤(c)生成另一些植物可以这样完成，例如，通过无性繁殖(例如，借助插枝、块茎或愈伤组织培养和整株植物的再生)或者通过有性繁殖。优选的是，任何有性繁殖都将在受控的条件下实现，即被选定的具有特殊表征的植物将被杂交和繁殖。
本发明还涉及通过权利要求的方法所获植物，以及转基因的繁殖材料，尤其是转基因的种子、转基因的植物部分和转基因的植物细胞，所述材料来自用权利要求的方法所获得的植物。在文中，“繁殖材料”包括任何适合用于产生子代的无性繁殖或有性繁殖的植物部分。例如，就无性繁殖而言，插枝、愈伤组织培养、根茎或块茎将是适当的。其它繁殖材料例如包括水果、种子、秧苗、非体(apoplast)、细胞培养等。优选的繁殖材料是种子。
为了制备与野生型植物细胞相比分别表现出早成花或推迟成花的转基因植物，本发明进一步涉及核酸构建体的运用，这种核酸构建体引起植物中的蔗糖剪切活性增强，并且包括一个或多个在顶端分裂组织的非质体中或作为替代在顶端分裂组织的细胞的细胞质中引起该构建体或其某些部分的转录和表达(后者非必选)和/或所述构建体中包含的转基因的翻译产品的定位的核酸部分。就这点而言，前面就依据本发明的植物介绍过的构建体优选被使用。
在优选实施例中，本发明的涉及使用包含转基因的构建体，其中该转基因将优选给蔗糖剪切蛋白质编码。在特别优选实施例中，转基因将给转化酶编码，而且所述转化酶的表达将出现在顶端分裂组织的特定部分中；由此，与野生型植物相比表现出早成花或推迟成花的转基因植物就可以被制备出来。
本发明的进一步的目标是上述的启动子要素，这些启动子要素是由在序列识别NO.1中描绘的DNA序列或其某些功能部分组成的，或者包括该DNA序列或其某些功能部分。
除了最后四个核苷酸之外，已被提及要点的序列识别NO.1的序列，对应于对来自玉米并且对形成叶脉扭结状隆起起作用的Knotted1(KN1)基因呈现同源性的来自拟南芥的KNAT1基因的启动子的自然存在的序列。在序列识别NO.1中，为了引进适合插入打算在这个启动子的控制下转录和表达(非必选)的基因要素，或转基因的限制性内切核酸酶的剪切位置，最后四个核苷酸已经通过克隆被添加进去。
包含KNAT启动子(在3’末端包括另一个核苷酸)的KNAT1基因的5’未被翻译的区域的完整的序列，是在序列识别NO.2(nt.1到nt.1475)中描绘的。核苷酸1476至1500代表用于该KNAT1蛋白质的第一个N端氨基酸的密码子。
作为包括序列识别NO.1的序列的某个功能部分的启动子要素的例证，是具有从序列识别NO.1派生出来的序列的启动子要素，其中包含一个或两个短可译框(ORF)(nt.1111-1122；nt.1269-1292)，或包括所述的ORF的一个或两个比较大的区域已经被删除。在本发明的优选实施例中，后一种启动子将呈现高于包含序列识别NO.1的完整序列的启动子的启动子活性。
此外，本发明涉及已经通过添加、取代、删除，插入或修饰从在序列识别NO.1中给定的序列或该序列的某些功能部分派生出来的启动子。特别优选的派生的启动子的特征是，起始序列对顶端分裂组织的功能(例如，启动子活性和组织特有的)被保留在派生物中。举例说，相应的序列修饰可能是以进一步缩小包含在其中的启动子序列、或引进适合克隆的限制性内切核酸酶的剪切部位为目标。例如，以在序列识别NO.1中给定的序列或其某些功能部分作为起始序列派生的启动子，对各自的起始序列可能呈现至少50％，优选至少65％，特别优选至少80％和本质上优选至少90％的同源性，即同一性。
具体地说，本发明包括具有从序列识别NO.1的DNA序列，或者从序列识别NO.1的某个功能部分或至少两个功能部分的组合的DNA序列，通过核苷酸的添加、取代、删除，插入或修饰派生出来的DNA序列的启动子要素，派生的启动子要素是在严格条件下与各个起始序列的杂交产物。
本发明还包括与相应的野生型启动子相比呈现增大或者减小的启动子活性的启动子变种。
在进一步的实施例中，本发明还以来自KNOTTED1发育同源序列基因的基因家族的KNAT1同源基因的启动子为目标。特别优选的是这样一些启动子，它们指导被置于它们的控制下的核苷酸的顶端分裂组织特异的表达。
因此，本发明还涉及一些给来自一组KNAT1蛋白质的蛋白质编码，并且对来自拟南芥的KNAT1基因的核甙酸序列的编码区呈现至少50％、优选至少65％、特别优选至少80％和本质上优选至少90％的同源性(即同一性)的基因的启动子，其中这些启动子优选在植物中把编码核甙酸序列的表达置于它们的控制下特异引向顶端分裂组织。这些启动子对于拟南芥的KNAT1基因的启动子可以是在某种程度上同源的；因此，它们对于来自拟南芥的KNAT1基因的核甙酸序列的相应的启动子区可能呈现至少50％、优选至少65％、特别优选至少80％或85％、更优选至少90％的同源性，即同一性。
另外，就本发明的启动子及其特定的特点而论，指的是就可供生产本发明的通过基因改良的植物利用的启动子而论，前面给出的解释。
在本发明的范围内，在按照下述的至少一种方法的杂交过程之后，在严格条件下的杂交将是可检测的。杂交按照Church和Gilbert的方法，在PEG缓冲液中(0.25M Na2HPO4，1mM EDTA，1％(w/v)BSA，7％(w/v)SDS，用磷酸调到pH7.5；G.M.Church，W.Gilbert，(1984)，《基因测序，美国国家科学院学报》(Genomic sequencing，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)811991-1995)在42℃下不超过20小时；或者在包含甲酰胺(42℃)或不包含甲酰胺(68℃)的标准杂交缓冲液中不超过20小时(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，(1989)，《分子克隆实验室手册》(Molecular cloninga laboratorymanual)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)。洗涤在65℃下用3XSSC缓冲液，0.1％SDS(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，(1989)，《分子克隆实验室手册》，见上)，洗涤3次，每次30分钟。
本发明还包括一些构建体，特别是包括依据本发明的启动子要素、以及把本发明的启动子要素用于在植物的顶端分裂组织中基因的组织特有的表达的载体，例如，质粒、粘粒、类噬菌体质粒、杆粒、病毒或噬菌体基因组、YACs(酵母人工染色体)和BACs(细菌人工染色体)。本发明还涉及任何种类的宿主细胞，特别是细菌型、真菌型和转基因的植物细胞，以及用其中包含依据本发明的启动子要素的构建体已经转化过的转基因植物。
另外，就转基因植物而论，指的是就某些以已经用导致蔗糖剪切活性在顶端分裂组织中被特异增强的构建体转化过为特征的植物，见前面给出的解释。
本发明的进一步的主题内容是转基因植物的生产方法，该方法的特征是下述步骤(a)把包括依据本发明的启动子要素的构建体，特别是载体，引入植物细胞；(b)从借助步骤(a)获得的植物细胞再生某种植物；(c)(非必选)，从借助步骤(b)获得的再生植物生成另一些植物。
本发明还涉及借助权利要求所述的方法获得的植物。
此外，本发明还涉及繁殖材料，这些繁殖材料是在优选实施例中是转基因的，特别是可以从依据本发明的植物或借助权利要求所述的方法获得到植物中获得的种子、植物部分和/或植物细胞。就“繁殖材料”而论，指的是前面给出的解释。
附1构建体KNAT-AI的示意图。酵母转化酶基因(SUCII)在顶端分裂组织特有的KNAT启动子控制下。PI-II＝允许在非质体中定位的来自马铃薯的蛋白酶抑制剂基因(PI-II)的信号序列的一部分；SUCII＝酵母转化酶；ocs＝来自A.tumefaciens的章鱼碱合成酶基因的多腺苷化(polyadenylation)信号。
图2构建体KNAT-CI的示意图。酵母转化酶基因(SUCII)在顶端分裂组织特有的KNAT启动子控制下。SUCII＝酵母转化酶；ocs＝来自A.tumefaciens的章鱼碱合成酶基因的多腺苷化(polyadenylation)信号。
图3酵母转化酶的顶端分裂组织特有异的表达，随着非质体的定位对转基因的拟南芥属品系的开花行为的影响。KNAT-AI品系的开花行为是在长日照(A)和短日照(B)条件下，通过T2的生成进行研究的。为了确定转化酶活性(C)，使用T1生成的花序(条形代表标准偏差；数目＝个体数；按照斯氏t检验的显著性p＜0.01＝***)。在A和B中Y-轴莲座叶数目。在C中Y-轴转化酶活性(毫摩尔己糖/分钟*克鲜重)。在A-C中X-轴转基因系的编号；WT＝野生型。
图4酵母转化酶的顶端分裂组织特异的表达，随着细胞质的定位对转基因的拟南芥属品系的开花行的影响。KNAT-CI系的开花行为是在长日照(A)和短日照(B)条件下通过T2的生成进行研究的。为了确定转化酶活性(c)，使用T1生成的花序(条形代表标准差；数目＝个体数；按照斯氏t检验的显著性p＜0.01＝***)。在A和B中Y-轴莲座叶数目。在C中Y-轴转化酶活性(毫摩尔己糖/分钟*克鲜重)。在A-C中X-轴转基因系的编号；WT＝野生型。
下面将借助非限制性实施例举例说明本发明。
来自拟南芥的同源基因的cDNA序列是已知的，并且已经被存放在基因分子库(GenBank)，数据库的登录号是U14174。这个序列包含来自ATG起始密码子的384个碱基对5′(Lincoln等人，1994，《植物细胞》(Plant Cell)61859-1876)；但是，KNAT1基因的启动子还是未知的。
为了分离KNAT1启动子，用370个碱基对(bp)的DNA片段筛选拟南芥的基因组文库。这个片段已经从拟南芥基因组的DNA，利用引物KNAT-for和KNAT-mut(其序列将在下面给出)通过运用PCR技术被扩增。该序列包括在ATG起始密码子上游的已知的5′部分。为了产生用于限制性核酸内切酶BamHI的识别序列，引物KNAT-mut包括导致ATG起始密码子突变的序列变更。下面给出引物的序列KNAT-for 5′TGT CAC TTC TTG ACG AAT TCKNAT-mut 5′ATG CAT CCC AGA TGA GAT AAG ATT TG
经过扩增的片段是接到EcoRV剪切载体pKS中的平端，并且被用于筛选基因组的λ-噬菌体文库。
通过杂交对上述片段进行检验的噬菌体克隆的DNA的SalI/XbaI消化，产生在DNA实验中用PCR探针杂交的2.1kbp的片段。这个片段被连接到已经被SalI/XbaI打开的pKS载体中。这个克隆被称为pKANT-KS-nonmut，而这个启动子区是完全排序的。这个启动子序列是在序列识别NO.1中描绘的。
来自StuI剪切部位的启动子部分3’通过StuI/XbaI限制被除去，而XbaI剪切的填入反应，是借助T4聚合酶完成的。然后，把来自pKNATS的225bp StuI/EcoRI片段(+T4聚合酶反应)平端接入载体是可能的。这个构建体被命名为pKNAT-mut，并且包含大约1.5kbp的启动子序列(其中包括不超过发生突变的ATG的5′-NTR)。
2.关于KANT1的特异性的研究由于KNATl启动子的表达特征尚未在转基因植物中研究过，所以其功能性首先在转录融合中用转基因的拟南芥属植物中的GUS报道基因进行实验。为此，1.5kbp的SalI/XbaI启动子片段在UIDA基因前面被克隆成等剪切的载体pGPT V-HPT(Becker等人，1992，《植物分子生物学》(Plant Mol Biol)201195-1197)。这种构建体被命名为pKNAT-GUS，并且被转移到随后用于A.thaliana的转化的A.tumefaciens菌株GV2260中。拟南芥植物的转化是按照已知的方法(Schmidt和Willmitzer，1989，17-24)完成的。转基因植物的分析结果是，在营养生长阶段在转基因的拟南芥植物的顶端分裂组织中检测到受KNAT1启动子驱动的UIDA基因的特异的表达。花序展开之后，UIDA基因的表达在开花期的茎中也可能被检测到。
3.构建体KNAT-AI和KNAT-CI的合成。
把来自酿酒酵母的SUC2基因的编码区(它在烟草植物中已被用于的酵母转化酶的表达(Sonnewald等人，1991，《植物学杂志》(Plant J)195-106))在转录融合时克隆到用于顶端分裂组织特异表达的NT1启动子上。为此，载体KNAT-Bin被构建。这种载体包括在载体pBinAR-Hyg中作为SalI(被填满)/XbaI(被填满)片段(Abel，1995，《对于马铃薯淀粉合成机理研究》(Untersuchungenzur Funktion von Strke-Synthasen in der Kartoffel(Solanumtuberrosum L.))，理学博士论文(Ph.D.thesis.)，FU Berlin，Berlin，联邦德国)的大约1.5kb的来自拟南芥的KNAT1基因的启动子片段，它已通过消化被限制性核酸内切酶EcoRI(被填满)和Asp718(被填满)打开，借此除去原本已插在pBinAR-Hyg中的CaMV 35S启动子。为了使酵母转化酶在非质体中定位，包括OCS多腺苷化序列的完整的PI-II/SUCII融合(von Schaewen等人，1990，EMBOJ93033-3044)被转移到载体KNAT-Bin中。这种最终获得的载体被命名为KNAT-AI(
图1)。截去顶端的SUCII基因被用于细胞质中的定位并且包括发表的核苷酸序列(登录号M13627，Kaiser和Botstein，1986，)《分子细胞生物学》(Mol Cell Biol)62382-2391)中的核苷酸段(nt.1795(ATG)到nt.2383(TAA))。这种片段可以作为XbaI(被填满)/SalI片段被连接到被SamI/SalI打开的KNAT-Bin载体中(图2)。这种构建体被命名为KNAT-CI，而且象KNAT-AI载体那样被转移到随后用于A.thaliana转化的A.tumefaciens-Stamm GV2260中。
4. 转基因植物的分析转化酶的活性来自分别用构建体KNAT-AI和KNAT-CI转化的拟南芥属植物的种子被播种在包含培养基的潮霉素上，随后被转移到土壤中。这种转基因的表达特征，是借助确定转化酶的活性针对各种品系的植物被确定的。为了确定转化酶的活性，花芽被使用，因为在KNAT-GUS植物中启动子的特有的分析表明，在这个区域GUS的表达被增强(见实施例2)。这是有利的，因为摘除之后花芽将重新形成，所以仍然有可能为接下来的开花实验收获种子。
就KNAT-AI和KNAT-CI两种转化而言，表现出转化酶活性增强的独立品系都可能被检测。与野生型相比，在KNAT-AI品系中，转化酶活性被增强不超过3倍(见图3c)，而在KNAT-CI品系中不超过2倍(见图4c)。
开花行为来自表现出转化酶有所增强的被选定的品系的种子被用于两种独立的开花实验。
(a)实验I种子被播种到土壤里，并且为了发芽，对该种子进行历时4夜(4℃)的春化处理。再过6天之后，把多余的植物去除，以致每罐保留一棵植物。在拟南芥情况下被优选用来确定植物年龄的莲座叶数被计数，以便确定在短日照(KT人工气候室；光量145-150μmol/m2/s；8小时明、16小时暗)和长日照(LT人工气候室；光量145-150μmol/m2/s；16小时明亮、8小时黑暗)的条件下栽培的开花时间。
转基因的转化酶品系在KT条件下象野生型那样开花(见图3b)。从莲座叶数上的差异看来与野生型没有明显的不同。
但是，在LT诱导条件下，另一种开花行为可能在KNAT-AI品系中被观察到(见图3a)。在转化酶已经定位在非质体中的5个被研究的转基因品系中，有4个品系的植物在比野生型植物少10个莲座叶片时已经开花。在生成T1时只表现出转化酶活性略有增强的品系9中的植物象野生型植物那样开花(见图3c)。
尽管KNAT-AI品系在LT条件下呈现早开花的表型，但是在同样的条件下KNAT-CI品系开花大大晚于野生型植物(见图4a)。因此，与野生型相比，在被研究的4个KNAT-CI品系的3个品系中，莲座叶的平均数在开花被增加7到9之前形成。只有第4个品系的植物开花行为没有改变；但是这些植物在开始产生时仅仅表现出转化酶活性略有增强(见图4c)。
(b)实验II种子在短日照条件(8小时光照/16小时黑暗；温度18℃(白天)，6℃(黑夜))下，在土壤中被预发芽两星期。被移植的发芽种子(子叶大小大约2mm)被栽培在由GS90培养基底和轻粒料的1∶1的混合物组成的土壤中。然后，该植物在下述条件下被栽种在温室中相对湿度60％至70％；白天温度20至22℃；夜间温度18至20℃；光量280至300μmol/m2/s；明/暗周期16小时/8小时。
在温室条件下，开花行为的改变在KNAT-AI品系(比野生型植物大约早2天开花)和KNAT-CI品系(给比野生型植物大约迟3至5天开花)两个品系中都可以观察到。
基因序列表<110>Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften e.V<120>影响植物的开花行为的手段和方法<130>EP-83671/PCT<140><141><150>DE19857654.4<151>1998-12-14<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1478<212>DNA<213>拟南芥<220><221>启动子<222>(1)..(1474)<223>KNAT1基因的启动子(KNAT启动子)<220><221>misc feature<222>(1111)..(1122)<223>可译框(ORF)<220><221>misc-teature<222>(1269)..(1292)<223>可译框(ORF)<220><221>misc_feature<222>(1475)..(1478)<223>为了引进限制核酸内切酶剪切部位在3’端添加的补充性核苷酸<400>1gtcgacctgc aggtcaacgg atctagagcc ctaggatttg acgatttata tataaataaa 60accctaggat tttcgtttct ttttgtataa aaatgaattc ataggcactc tatacgtctc 120atgaatcatg aaatataaat cgagattaaa tagaaaattg aatgttgacc gtggaacaga 180acaagtgttg aaagaagtgt gtttgcagca tggtcttatc atagagccaa tagttggaaa 240ttagcagaat atcgtataat atccactatc ctgtaaagca tttttataat tccttttttt 300ttctcggttt ctaatgtaat cttctatccg ataacaaata ttcggatagt gtgatctctc 360cactaatata catacgaaat tacgaaaact aaaattataa tttcatcgat ttgattaaac 420tccaaaaaca tccaagtctt gcatcaaata tgtacatttc tatcatattg tttataattc 480tttttttgtt atccgtaagt tttaggcaga aacccgtaca gtgaaaccga ggaccagaac 540aagataaacg tagtcccctc tcctaagtat agaattataa tgtgacacat gatcacaatt 600tgttgaacga actctatgtt caaccactag actacaagaa gtatatataa atcatacata 660tttttaa aacttttttc ttgactattc ttttaagaaa aaaaaaacat ttcattacta 720gaaaatagta caaaatatat cattcaacct agcaagaaac catagcctga agtagccgcg 780aagacctagt tgcttaaaca ctgagtggtt catcttaatt cgaatattat aaaccacatt 840ttaattaagt aaattacgta gtcttgttct aatgtataaa atagcctatg agaggaaaac 900agaagagaga agcctttgcc ttatctcttg tcccttctct cttaccttta ttttaatttt 960caaatatttc tttttgctcc caaagcaaac gacgtcttgt caatccactc aagccaccca 1020acttcttcat tattgttaat ctctctctct ctctctcttt ctctcttctt ctctctttct 1080cttttttttt tttttatttt cttctcttcc atgtcacttc cttgacgaat tctatatacc 1140tagttcgttt tttcttcctc aaatatatct ttttcaattt atttggtttt tctttgggtg 1200caacttcacc tcacaaaatt ttctctcttt tttatattaa tttgagttag gcctttttga 1260tttcatagat gagtcgtcta gtcgtctgga tttgatgtgg ttatagtctt acagagacct 1320ttgattgaaa taagaacaaa agcaagaata catacatcct cttcatctta cacccatcct 1380tttttatttt tctagggttt tatttttttt taatttattt ttttttcttt gatttttata 1440ttctctctct ctctcaaatc tttactcatc tgggatcc 1478<210>2<211>1500<212>DNA<213>拟南芥<220><221>启动子<222>(I)..(1475)<223>KNAT1基因的启动子(KNAT启动子)<220><221>misc_feature<222>(1111)..(1122)<223>可译框(ORF)<220><221>misc_feature<222>(1269)..(1292)<223>可译框(ORF)<220><221>CDS<222>(1476)..(1499)<223>给KNAT1的N-端氨基酸序列编码的编码序列<220><221>misc_feature<222>(1500)<223>KNAT1基因的编码序列的继续<400>2gtcgacctgc aggtcaacgg atctagagcc ctaggatttg acgatttata tataaataaa 60accctaggat tttcgtttct ttttgtataa aaatgaattc ataggcactc tatacgtctc 120atgaatcatg aaatataaat cgagattaaa tagaaaattg aatgttgacc gtggaacaga 180acaagtgttg aaagaagtgt gtttgcagca tggtcttatc atagagccaa tagttggaaa 240ttagcagaat atcgtataat atccactatc ctgtaaagca tttttataat tccttttttt 300ttctcggttt ctaatgtaat cttctatccg ataacaaata ttcggatagt gtgatctctc 360cactaatata catacgaaat tacgaaaact aaaattataa tttcatcgat ttgattaaac 420tccaaaaaca tccaagtctt gcatcaaata tgtacatttc tatcatattg tttataattc 480tttttttgtt atccgtaagt tttaggcaga aacccgtaca gtgaaaccga ggaccagaac 540aagataaacg tagtcccctc tcctaagtat agaattataa tgtgacacat gatcacaatt 600tgttgaacga actctatgtt caaccactag actacaagaa gtatatataa atcatacata 660ttttttttaa aacttttttc ttgactattc ttttaagaaa aaaaaaacat ttcattacta 720gaaaatagta caaaatatat cattcaacct agcaagaaac catagcctga agtagccgcg 780aagacctagt tgcttaaaca ctgagtggtt catcttaatt cgaatattat aaaccacatt 840ttaattaagt aaattacgta gtcttgttct aatgtataaa atagcctatg agaggaaaac 900agaagagaga agcctttgcc ttatctcttg tcccttctct cttaccttta ttttaatttt 960caaatatttc tttttgctcc caaagcaaac gacgtcttgt caatccactc aagccaccca 1020acttcttcat tattgttaat ctctctctct ctctctcttt ctctcttctt ctctctttct 1080cttttttttt tttttatttt cttctcttcc atgtcacttc cttgacgaat tctatatacc 1140tagttcgttt tttcttcctc aaatatatct ttttcaattt atttggtttt tctttgggtg 1200caacttcacc tcacaaaatt ttctctcttt tttatattaa tttgagttag gcctttttga 1260tttcatagat gagtcgtcta gtcgtctgga tttgatgtgg ttatagtctt acagagacct 1320ttgattgaaa taagaacaaa agcaagaata catacatcct cttcatctta cacccatcct 1380tttttatttt tctagggttt tatttttttt taatttattt ttttttcttt gatttttata 1440ttctctctct ctctcaaatc tttactcatc tgggt atg gaa gaa tac cag cat1493Met Glu Glu Tyr Gln His1 5gac aac a1500Asp Asn<210>3<211>8<212>PRT<213>拟南芥<400>3Met Glu Glu Tyr Gln His Asp Asn1 权利要求
1.一种转基因植物，其特征在于用构建体导致与野生型植物相比蔗糖剪切活性在植物的顶端分裂组织中被特异增强而发生转化。
2.根据权利要求1所述的转基因植物，其特征在于所述构建体包括转基因。
3.根据权利要求2所述的转基因植物，其特征在于所述的转基因给具有蔗糖剪切活性的蛋白质编码。
4.根据权利要求3所述的转基因植物，其特征在于所述的转基因给从由转化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖合成酶、果糖基转移酶和葡糖苷基转移酶组成的一组蛋白质中选出的蛋白质编码。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其特征在于所述的转基因给来自酿酒酵母的转化酶编码。
6.根据权利要求2所述的转基因植物，其特征在于所述的转基因给激活植物细胞内蔗糖剪切蛋白质的效应蛋白质编码。
7.根据权利要求1所述的转基因植物，其特征在于所述的构建体根据植物细胞内给抑制蔗糖剪切蛋白质的蛋白质编码的植物细胞基因给“有意义的”或“无意义的”核酸编码。
8.根据权利要求1至7中所述的任何一项转基因植物，其特征在于所述的构建体包括顶端分裂组织特定的启动子。
9.根据权利要求8所述的转基因植物，其特征在于所述的构建体包括顶端分裂组织特有的KNAT启动子，该启动子具有在基因识别NO.1中给定的序列或其中的一个或多个功能部分。
10.根据权利要求1至9所述的任何一项的转基因植物，其特征在于所述的构建体包括顶端分裂组织特异的增强子序列。
11.根据权利要求1至10所述的任何一项转基因植物，其特征在于所述的构建体导致与野生型植物相比蔗糖剪切活性在顶端分裂组织的非质体中被特异增强而发生转化。
12.根据权利要求11所述的转基因植物，其特征在于所述的构建体包括转基因。
13.根据权利要求12所述的转基因植物，其特征在于其中所述的构建体还包括以蛋白质为靶信号序列，所述的序列指导由所述的构建体中包含的转基因的表达产生的蛋白质或多肽的非质体定位。
14.根据权利要求13所述的转基因植物，其特征在于其中以蛋白质作为靶信号序列是从来自马铃薯的pin2、来自马铃薯的马铃薯糖蛋白基因B33的信号序列和来自解淀粉欧文氏菌的蔗糖6-果糖转移酶的信号序列所组成的一组信号序列中选出的。
15.根据权利要求1至10中所述的任何一项的转基因植物，其特征在于某种构建体导致与野生型植物相比，蔗糖剪切活性在顶端分裂组织的细胞的细胞质中被特异增强而发生变化。
16.根据权利要求1至15中所述的任何一项的转基因植物，其特征在于是一种产生纤维、储存油脂、储存淀粉、储存糖或储存蛋白质的植物。
17.根据权利要求1至15中任何一项所述的转基因植物，其特征在于是一种饲料、蔬菜或观赏性植物。
18.一种生产与野生型植物相比表现出早成花的转基因植物的方法，其中所述方法的特征在于下述步骤(a)把某种构建体引入植物细胞，这种构建体在植物细胞中的存在、完全或部分转录或表达，导致所述的植物与野生型植物相比，所述的蔗糖剪切活性在植物顶端分裂组织的非质体中被特异地增强；(b)利用步骤(a)中获得的所述的植物细胞再生某种植物；(c)(非必选)利用步骤(b)中获得的再生植物产生另外一些植物。
19.一种生产与野生型植物相比表现出推迟成花的转基因植物的方法，其中所述方法的特征在于下述步骤(a)把某种构建体引入植物细胞，这种构建体在植物细胞中的存在、完全或部分转录或表达将导致与野生型植物相比，蔗糖剪切活性在所述植物的顶端分裂组织的细胞的细胞质中被特异地增强；(b)利用步骤(a)中获得的植物细胞再生某种植物；(c)非必选地利用步骤(b)中获得的再生植物产生另外一些植物。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于所述的构建体包括转基因。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述的转基因是具有蔗糖剪切活性的蛋白质。
22.用根据权利要求18至21所述的任何一项的方法获得的转基因植物。
23.从根据权利要求1至17或22所述的任何一项转基因植物中可获得的转基因繁殖材料、转基因种子、转基因植物部分或转基因植物细胞。
24.在植物中引起蔗糖剪切活性增强的核酸构建体的使用，为了生产与野生型植物相比表现出早成花的转基因植物，所述的构建体包括一个或多个核酸部分，这些核酸部分将引起所述构建体或其中某些部分在顶端分裂组织的非质体中的转录或表达(后者非必选)，和/或引起包含在所述构建体中的转基因的翻译产品在顶端分裂组织的非质体中定位。
25.在植物中引起蔗糖剪切活性增强的核酸构建体的使用，为了生产与野生型植物相比表现出推迟成花的转基因植物，所述构建体包括一个或多个核酸部分，这些核酸部分引起所述构建体或其某些部分在顶端分裂组织的细胞的细胞质中的转录或表达(后者非必选)，和/或引起包含在所述构建体中的转基因的翻译产品在顶端分裂组织的细胞的细胞质中定位。
26.根据权利要求24或25所述的使用，其特征在于所述的核酸构建体包含转基因。
27.根据权利要求26所述的使用，其特征在于包含在所述的核酸构建体中的转基因给具有蔗糖剪切活性的蛋白质编码。
28.根据权利要求27所述的使用，其征在于包含在所述的核酸构建体中的转基因给转化酶编码。
29.一种包含在在序列识别NO.1中描绘的DNA序列或其一个或多个功能部分中的启动子要素。
30.根据权利要求29所述包含在在序列识别NO.1中描绘的DNA序列中的启动子要素，其中两个可译框(nt.1111-1122；nt.1269-1292)或包括这些可译框的区域已被删除。
31.一种启动子要素，包括由在序列识别NO.1中描绘的DNA序列或该序列的一个或多个功能部分作为起始序列，所述的DNA序列是在严格条件下与各自的起始序列杂交，借助核苷酸的添加、取代、删除、插入或修饰派生出来的DAN序列。
32.一种给来自一组KNAT1蛋白质的蛋白质编码的基因的启动子要素，所述的要素对来自拟南芥的KNAT1基因的核苷酸序列的编码区呈现65％的同源性，其中所述的启动子要素把植物中在其控制之下的编码核苷酸序列的表达特异地引向所述的植物的顶端分裂组织。
33.包括根据权利要求29至32中所述的任何一项的启动子要素的构建体。
34.根据权利要求29至32中所述任何一项在植物的顶端分裂组织中用于编码核苷酸序列的组织特异表达的启动子要素的使用。
35.根据权利要求33所述的构建体改造的宿主细胞，特别是细菌的、真菌的和转基因的植物细胞。
36.包含根据权利要求35所述的植物细胞的植物。
全文摘要
这项发明涉及使提供表现出开花行为已被改变的植物成为可能的手段和方法,具体地说,改造过基因的植物与未作相应的改造而且在其它方面类似的野生型植物相比表现出提前或推迟成花;以及在生产这些改造过基因的植物的方法中可以利用的组织特有的启动子。这项发明的基础是一项发现,即植物的开花行为可以受蔗糖剪切活性在植物的顶端分裂组织中被特异增强的影响。在这个意义上,与相应的未作改造的野生型植物相比,蔗糖剪切活性在植物顶端分裂组织的非质体中被特异增强将导致早成花;反之,蔗糖剪切活性在顶端分裂组织细胞的细胞质中被特异增强将导致推迟成花。
文档编号C12N15/82GK1330719SQ99814397
公开日2002年1月9日 申请日期1999年12月14日 优先权日1998年12月14日
发明者麦克·拉谱, 阿诺德·G·海尔 申请人:马克斯－普朗克－科学促进协会,柏林