用肽标记的寡核苷酸来操作复杂核酸种群的方法

专利名称：用肽标记的寡核苷酸来操作复杂核酸种群的方法
1.发明领域本发明总的来讲涉及标记、分类、比较和分离核酸种群的方法。更详细地讲，本发明涉及一种用于分类和比较复杂核酸种群的方法，所述复杂核酸种群例如cDNA文库。这些复杂的核酸种群可以来源于具有潜在临床重要性的表型变异的细胞类型或组织类型。通常将所述方法称为ValiGeneSM肽标记寡核苷酸(Peptide-Labeled Oligonucleotide)方法、或VG-PLOSM，且所述方法包含运用连接到寡核苷酸引物的、可辨别及可鉴定的肽标记物来操作核酸。
2.发明背景已经将标记的寡核苷酸用于检测特定的序列。例如，Burdick和Oakes(用固相俘获手段检测核酸的诊断试剂盒与方法，欧洲专利公布号EP 0370 694 A2，公布日1990年5月30日)公开了用一种标记物标记并具有互补于一预定的关注序列的特定核酸序列的寡核苷酸引物的运用。该方法限于鉴定特定样品里面已知的序列，且每对引物必须对应于单一的、预定的PCR产物。
对于定量测定药物对细胞培养中大部分基因和蛋白表达的影响，几种基因表达分析现在正变得可以实际使用(参见例如Schena等，1995，用互补DNA微阵列来定量监测基因表达型式(pattern)，Science 270467-470；Lochort等，1996，通过与高密度寡核苷酸阵列的杂交来监测表达，NatureBiotechnology 141675-1680；Blanchard等，1996，排阵列的序列探查基因组的秘密，Nature Biotechnology 141649；1996，美国专利5,569,588，1996年10月29日授予Ashby等，题目是“用于药物筛选的方法”)。来自这些基因表达分析的原始资料常常是难于清晰地解释的。这样的测量技术一般选出许多响应药物而改变表达的基因，典型地为50-100个，也许多达1000个或者少至10个。
几乎不存在快速比较复杂的核酸混合物从而选择被差异表达的基因或选择某些但不是全部关注(interest)表型共共享的基因的方法。因此，在本技术领域中，需要快速且有效地提供核酸种群之间的比较方法。
3.发明概述本发明提供标记、分类、比较和筛选多个复杂的核酸种群的方法。这些种群可以是由可辨别表型的、关注的细胞类型或组织类型构建的cDNA文库。所述方法是极其灵活的，并且是可适用于完成许多复杂的分类和比较任务的。
也可用本发明的方法来增加和补充操作复杂cDNA种群的其它技术的分析能力。本发明方法的主要优势是筛选例如来源于不同组织的多个cDNA种群的能力；所述不同组织属于同一个体的不同组织、或属于同时存在于特定组织样品里的不同表型细胞类型的不同组织。
本发明利用通过不同的分类步骤和分子比较步骤来跟踪多个核酸种群的能力。本发明使用具有可辨别和可鉴定的肽标记的寡核苷酸引物，可以用所述引物使PCR反应从载体序列起动。运用这样的寡核苷酸引物，用文库特异性的肽标记物，可以标记来自任一特定cDNA文库的插入片段。可用可辨别的标记物来鉴定任一特定的插入片段的起源文库。此外，可以基于插入片段的起源文库，用可辨别的肽标记物来选择性地分类和分离插入片段，而不管产物混合物的复杂性。例如，人们可以用具有一种特异性抗体的层析基质；所述特异性抗体对可辨别的肽标记物之一是特异性的。这样的基质即可以捕获或留住带有该特异性肽标记物的单链片段，又可以截获或留住带有该特异性肽标记物的双链片段。不包含这种标记物的片段将在流通物中自由地离开。
本发明的方法主要利用聚合酶链反应(PCR)使在一特定cDNA文库中的所有插入片段线性化，并将一种可辨别和可鉴定的肽标记物添加到来自一特定cDNA文库的所有插入片段上；以便表明其起源文库。也可在不同的阶段使用PCR，以扩增产物的复杂混合物。
可以从许多不同的来源得到核酸样品种群。这样的来源可包括同时存在于一特定组织样品中的不同表型、或同时存在于属于同一个体的不同组织中的不同表型。一种表型可以是但不必是“健康的”，而另一种表型是典型病态的。本发明方法不仅允许鉴定与各自表型相联系地特异性表达的基因，而且允许比较与表型无关地表达的基因或允许比较由某些表型但不是全部表型共享的基因。
在第一个实施方案中，本发明提供包含下面步骤的方法，下面步骤为(a)运用PCR，用具有每种文库独特标记物的寡核苷酸引物标记来自许多cDNA文库中的每一个文库的DNA；(b)使在步骤(a)中标记的、具有第一所述标记物的DNA与在步骤(a)中标记的、具有一不同的所述标记物的DNA接触；以及(c)使用一种或更多种分子，各种分子能够结合每种文库独特的所述标记物。
在第一个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，每种文库独特的所述标记物是5’肽标记物。
在第一个实施方案中，本发明又提供另外的方法，其中，每种文库独特的所述标记物是生物素。
在第一个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，所述一种或更多种分子是抗体。
在第一个实施方案中，本发明又提供以下方法，其中，所述寡核苷酸引物使PCR从一个特定文库里的核酸共同的载体序列启动(因而对于每个文库用不同的、一种这样的引物)；或者所述寡核苷酸引物使PCR从许多cDNA文库中共同的载体序列启动(因而将同样的引物用于启动全部众多文库的PCR)。
在第一个实施方案中，本发明再提供分类的方法，该方法包括(d)将产生自步骤(b)的杂种DNA链变性；(e)使在(d)中变性单链与单链结合蛋白接触，以防止链重退火；以及(f)使在(e)中形成的单链结合蛋白包裹的单链与一种或更多种分子接触，各种分子能够结合每种文库独特的所述标记物。
此外，在第一个实施方案中，本发明提供一种方法，其中，在(e)中的一种或更多种分子中的至少一种是抗体。
在第二个实施方案中，本发明提供一种比较cDNA文库方法，该方法包括(a)通过PCR，用具有第一种5’肽标记物的寡核苷酸引物标记来自第一种cDNA种群的DNA；(b)通过PCR，用具有第二种5’肽标记物的寡核苷酸引物标记来自第二种cDNA种群的DNA；(c)在以致于杂交能发生的条件下，使在步骤(a)中标记的DNA与在步骤(b)中标记的DNA接触；以及(d)使具有第一种和第二种5’肽标记物的DNA与仅有第一种或第二种5’肽标记物的DNA分开。
在第二个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，所述第一种cDNA种群来自一种或更多种经受了第一种条件的细胞、或者来自经受了第一种条件的一种生物；且所述第二种cDNA种群来自一种或更多种没有经受所述第一种条件的同一类型的细胞、或者来自没有经受所述第一种条件的一种同一类型的生物。
在第二个实施方案中，本发明又提供另外的方法，其中，所述第一种cDNA种群来自一种或更多种经受了第一种条件的细胞、或者来自经受了第一种条件的一种生物；且所述第二种cDNA种群来自一种或更多种经受了第二种条件的细胞、或者来自经受了所述第二种条件的一种同一类型的生物。
在第二个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，所述第一种和第二种cDNA种群来自表型不同的细胞或生物。
此外，在第二个实施方案中，本发明提供另外的方法，其中，具有所述第一种5’肽标记物的寡核苷酸引物对的核苷酸序列与具有所述第二种5’肽标记物的寡核苷酸引物对的核苷酸序列是相同的。
在第三个实施方案中，本发明提供监测基因表达的方法，所述方法包括(a)使来自细胞的mRNA与依赖RNA的DNA聚合酶和5’去磷酸化的靶特异性引物(即对希望监测表达的基因特异性的)接触；(b)使在步骤(a)中合成的任何DNARNA杂交体与核酸酶接触，以除去单链RNA突出端；(c)在步骤(b)后，将DNARNA杂种分子连接到部分双链的磷酸化的第二种引物上(例如一种不是靶特异性的引物)；(d)通过PCR，用互补于用于步骤(a)中的靶特异性引物的第一种引物，标记在在步骤(c)中连接的产物；用第一种标记物标记所述第一种引物，且第二种引物互补于(e)中的、双链的、磷酸化的第二种引物的一条链，用不同于所述第一种标记物的第二种标记物标记所述的第二种引物；(e)使在步骤(d)中标记的PCR产物与一种或更多种在固体支持物上固定化的、能结合所述第一种标记物的分子接触；(f)洗涤该固体支持物；以及(g)使在步骤(f)中洗涤过的支持物与一种或更多种能够结合所述第二种标记物的分子接触。
在第三个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，所述核酸酶是绿豆核酸酶。
在第三个实施方案中，本发明又提供另外的方法，其中，所述部分双链的磷酸化的第二种引物是一种M13正向测序引物。
在第三个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，所述第一种标记物是肽标记物。
在第三个实施方案中，本发明又提供另外的方法，其中，在步骤(e)中的一种或更多种分子中的至少一种是抗体。
此外，在第三个实施方案中，本发明提供另外的方法，其中，在步骤(g)中的一种或更多种分子中的至少一种是链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶。
第四个实施方案提供鉴定在第一个cDNA文库中有且在许多其它的cDNA文库中没有的cDNA插入片段的方法；所述方法包括(a)通过聚合酶链反应，用具有各文库独特标记物的寡核苷酸引物，标记来自各cDNA文库的DNA插入片段；(b)将在步骤(a)中标记的DNA杂交；(c)使在步骤(b)中杂交的DNA与许多能够识别许多其它cDNA文库中的各个文库的独特标记物而非所述第一个cDNA文库的独特标记物的固定化的抗体接触；以及(d)将不被许多固定化抗体结合的DNA回收。
在第四个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，来自许多其它cDNA文库中的每个文库的、杂交的DNA相对于第一个cDNA文库是过量的。此外，提供另外的方法，所述另外的方法使用2倍至100倍的过量、2.5倍至10倍的过量；以及在所述另外的方法中，过量为3倍的过量。
在第四个实施方案中，本发明又提供另外的方法，其中，各个文库独特的标记物是一种肽标记物。此外，提供其中肽标记物为3至12个氨基酸残基的方法。而且，提供其中所述标记物为耐热蛋白标记物的方法。
在第四个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，在一独立的亲和柱上，固定在步骤(c)中的许多抗体中的一种。此外，提供方法，其中，将所述独立的亲和柱以任何次序串联物理连接。
在第四个实施方案中，本发明又提供另外的方法，其中，将柱的流过物上柱于独立的物理连接的亲和柱一次或更多次。此外，提供一种方法，其中，将柱的流过物上柱于独立的物理连接的亲和柱三次。
此外，在第四个实施方案中，本发明提供一种方法，其中，回收由对第一个cDNA文库独特标记物特异性的抗体留住的DNA，并将该DNA克隆。
在第五个实施方案中，本发明提供鉴定在第一个cDNA文库和第二个cDNA文库中有、且在许多其它的cDNA文库中没有的cDNA插入片段的方法；所述方法包括(a)通过聚合酶链反应，用带有各文库独特标记物的寡核苷酸引物，标记来自各cDNA文库的DNA；(b)将在步骤(a)中标记的DNA杂交；(c)使在步骤(b)中杂交的DNA与许多能够识别许多其它cDNA文库中的各个文库的独特标记物而非第一个cDNA文库或第二个cDNA文库的独特标记物的固定化的抗体接触；以及(d)将不被许多固定化抗体结合的DNA回收。
在第五个实施方案中，本发明再提供方法，其中，来自许多其它cDNA文库中的每个文库的、杂交了的DNA相对于所述第一个和第二个cDNA文库是过量的。此外，提供过量为2倍至100倍过量、过量为2.5倍至10倍过量、以及过量为3倍过量的方法。
在第五个实施方案中，本发明又提供方法，其中，各个文库独特的标记物是一种肽标记物。此外，提供其中肽标记物为3至12个氨基酸残基的方法。而且，提供其中所述各个文库的独特标记物为一耐热蛋白标记物的方法。
在第五个实施方案中，本发明再提供方法，其中，在一独立的亲和柱上，固定在步骤(c)中的许多抗体中的每一种。
此外，提供其中以任一次序将所述的独立的亲和柱串联物理地连接的方法。
在第五个实施方案中，本发明又提供方法，其中，将柱的流过物上柱于独立的物理连接的亲和柱一次或更多次。此外，提供其中将柱的流过物上柱于独立的物理连接的亲和柱三次的方法。
此外，在第五个实施方案中，本发明提供方法，其中，进一步地使在步骤(d)中回收的DNA与对所述第一个cDNA文库独特标记物或对第二个cDNA文库独特标记物特异性的抗体接触，以便浓缩对第一个cDNA文库和第二个cDNA文库特异性的cDNA片段。而且，提供方法，在所提供的方法中，回收浓缩的、对所述第一个cDNA文库和第二个cDNA文库特异性的cDNA片段，并将其克隆。另外，提供方法，在所提供的方法中，分离浓缩的、对第一个cDNA文库和第二个cDNA文库特异性的cDNA片段。此外，提供一种进行分离的方法；利用这方法，通过变性、用单链结合蛋白包裹、以及与对所述第一个cDNA文库或第二个cDNA文库独特标记物特异性的抗体接触，来进行分离。
在第六个实施方案中，本发明提供用于许多cDNA文库的矩阵分析的方法；所述方法包括(a)用可辨别的标记物，标记来自许多cDNA文库中的每个文库的cDNA插入片段；(b)将在步骤(a)中标记的cDNA插入片段杂交；(c)使在步骤(b)中杂交的cDNA插入片段与一能够结合可辨别标记物的亲和柱接触；以及(d)洗脱所述的亲和柱。
在第六个实施方案中，本发明再提供另外的方法，其中，所述可辨别的标记物是肽标记物，且所述标记步骤包括通过用具有所述肽标记物的寡核苷酸引物对，从cDNA文库载体序列起动PCR；所述肽标记物连接所述引物对的5末端。
在第六个实施方案中，本发明又提供一种方法，其中，以相等的比例将来自各个文库的标记的cDNA片段杂交。
在第六个实施方案中，本发明再提供方法，其中，能够结合可辨别标记物的亲和柱是抗体亲和柱。此外，提供一种方法，其中，用pH梯度洗脱所述的抗体亲和柱。
在第六个实施方案中，本发明又提供一种方法，其中，将洗脱的DNA变性，以分离从两个不同文库起源的链。此外，提供一种方法，其中，通过(a)用单链结合蛋白包裹、以及(b)与能够结合可辨别标记物的亲和柱接触，来分离变性的链。
在另一个实施方案中，也可以用本发明的方法构建扣除的cDNA文库。可以用得自任一上述方法的序列，从已知共享这样同系物的文库中或从任何给定的未知文库中除去同系物。待扣除的文库作为纯化的双链克隆而存在。这个实施方案利用大肠杆菌RecA蛋白在同源序列间形成稳定的三链结构的能力。这样的三链结构以RecA蛋白包裹的单链丝体加双链的线性双链体的形式、以及以RecA蛋白包裹的单链丝体加双链的环状双链体的形式而存在。这个实施方案的该方法包括(a)通过PCR，用具有5’-肽标记物的载体特异性引物扩增并标记被鉴定为由不同文库共享的序列；(b)将所述标记的序列变性；(c)冷却(例如快速冷冻)变性的产物以防止复性；(d)添加RecA蛋白的等分试样和不可水解的ATP(例如ATPγS)；(e)融化该混合物；以及(f)添加呈闭合环状克隆形式(例如质粒或噬菌粒)的待扣除文库的等分试样。
4.附图简述

图1分别得自用于将标记的cDNA片段分类的第I阶段、第II阶段和第III阶段的抗体亲和柱之结果的图解表示。
图2构成分类过程之第IV相的输入和输出的cDNA片段的图解表示。
图3 通过cDNA第一条链的合成而产生的RNADNA杂交体，包括在cDNA链5’末端的所述靶特异性引物。
图4 所述RNADNA杂交体的部分双链标准引物的连接，包括仅部分连接到RNA链上。
5.发明详述为了操作(例如标记、分类、分离和/或筛选)两个或更多个复杂的核酸种群，本发明提供一般称为ValiGeneSM肽标记寡核苷酸方法(VG-PLOSM方法)的方法。可以从各种各样的来源得到这样的核酸，典型地是代表不同表型的cDNA文库。例如，使用的cDNA文库可以代表(i)同时存在于于特定组织(例如活组织检查样品中的正常部分和癌的部分)中的表型，(ii)存在于属于同一个体或不同个体的不同组织中的表型，(iii)存在于不同细胞系之中的表型，或(iv)存在于受到一种或更多种不同处理的同一细胞系中的表型。
在本发明的方法中，一般用聚合酶链反应(PCR)来线性化在一个特定cDNA文库中的插入片段，并将可辨别和可鉴定的标记物添加到来自该特定cDNA文库的所有插入片段上；以便表明起源文库(以及因此的细胞类型、组织或生物)。在一个优选的实施方案中，用连接了肽标记物的寡核苷酸引物从cDNA文库的载体序列启动聚合酶链反应。
使整个本申请涉及肽标记物和结合所述标记物的抗体。除了肽-抗体结合之外，本领域技术熟练人员将明白配合一合适的结合配偶体，可以使用任一标记物。这样的标记物和结合配偶体的实例包括但不限制于地高辛配基-抗地高辛配基、生物素-链霉亲和素、配体(例如激素)-受体以及碳水化合物-凝集素组合。
当用于本文时，本领域普通的技术熟练人员将明白核酸种群或混合物的复杂性一般指的是任一特定cDNA文库中的或者文库混合物中的、可辨别的克隆数。用本发明的方法分析的核酸复杂性可以在非常广的范围内变化。对于所分析的种群或混合物的复杂性，一般没有上限或下限。例如，在一个实施方案中，种群或混合物的复杂性可以为从10至10,000,000。进一步地，该复杂性可以为从100至1,000,000。更进一步地，该复杂性可以为从500至500,000。在一个优选的实施方案中，所分析的混合物的复杂性大约为(±20％)150,000。在另一个优选的实施方案中，混合物的复杂性(±20％)150,000包括5个文库；每个文库具有大约30,000的复杂性。在另一个特定的实施方案中，所分析的种群的复杂性至少为103、104、105或106。
本发明的一套方法利用连接于引物对的文库特异性标记物，所述引物对能够识别用来构建该文库之载体的载体序列。这样，用这样的引物通过PCR扩增而产生的所有核酸片段在其5’和3’末端均具有相同的载体序列；同样，也具有表明所述起源文库的可辨别的标记物。在下面描述方法，这些方法用于将cDNA片段分类，分离出可辨别的、归于一个单链cDNA文库的那些cDNA片段；将cDNA片段分类，分离出两个文库共同的那些cDNA片段；将cDNA片段分类，分离出多个文库但不是所有文库共同的那些cDNA片段；以及将cDNA片段分类，分离出仅被出自所分析的所有文库中的两个文库共享的片段。另外，在下面提出了构建扣除文库的方洗从而监测基因的表达事件，并分离部分长度序列的全长转录物；例如已表达序列标记。
5.1.识别对许多cDNA文库中的一个文库特异性的cDNA片段在本实施方案中，用连接到载体特异性引物的可辨别标记物(例如一种包含一表位的肽标记物)，通过PCR，来各自地线性化及标记来自许多cDNA文库(例如A、B、C、D和E)中的每个文库的插入片段。在文库中，载体特异性引物对的核苷酸序列可以是相同的。然而对于起源文库，每种标记物(标记)是特异性的。这样，所有产生的片段都有(a)在其5’和3’末端的、对应于载体特异性引物序列的相同核苷酸序列，以及(b)表明所述起源文库的一种标记物。然后，例如通过排阻层析纯化标记的插入片段，除去所有的反应组份，包括过量的肽标记引物。然后，将这些纯化的、标记的PCR产物合并、热变性，并允许其重退火。
进行复性和杂交的条件可以变化。在本发明一个优选的实施方案中，在98℃将合并的、热变性的PCR产物一起保持10分钟。然后，在5分钟期间，让该溶液从98℃冷却到85℃。保持该混合物的温度在85℃达10分钟，然后在15分钟期间，将该混合物的温度冷却到65℃。然后，在65℃的温度将该溶液再保持15分钟。此刻，认为重退火过程完成了。
在这里，用于杂交反应的各种PCR反应产物的量同样可以变化。因为希望分离对一个文库特异性的cDNA片段，所以过量地使用其它的文库(即作为一个“拖把”)。具体地说，在人们希望分离存在于文库A而不是存在于文库B、C、D和E的片段的地方，人们用过量的B、C、D和E。过量的B、C、D和E的使用量将决定去除的效率。在一个优选的实施方案中，使用3倍过量的B、C、D和E。在另一个实施方案中，使用从2倍到100倍过量的B、C、D和E。还在再一个实施方案中，使用从2.5倍到10倍过量的B、C、D和E。因为使用过量的B、C、D和E的作用是用作除去来自关注的文库(在这个实例中为文库A)的同源cDNA片段的“拖把”；所以，对于可以用的过量的上限没有限制。然而，3倍的过量将有效地从文库A除去将与B、C、D和E杂交的片段，且不浪费。
然后，将重退火混合物的等分试样与一种或更多种固相接触，例如，通过具有一种结合配偶体的独立的层析柱，所述配偶体最好是标记物B、C、D和E各自特异性的抗体。可选择地，可以用一单独的固相；例如，具有对全部四种标记物特异性的抗体的柱。制造抗体亲和柱的方法是众所周知的。例如，通过使用用于抗体连接的碳酰二咪唑或溴化氢，可以活化琼脂糖珠(例如SepharoseTM或Sepharose CL，Pharmacia)。用在水中的二氧杂环己烷洗涤琼脂糖珠，并在室温下将其与碳酰二咪唑一起保温。保温后，再次用二氧杂环已烷洗涤所述琼脂糖珠。然后，可以将所需抗体的纯化溶液添加到活化的琼脂糖珠上，并于室温下混合过夜。接着，用1M NaCl洗涤所述琼脂糖珠，并添加乙醇胺。于是，所述琼脂糖珠随时可以用于结合抗原，或者可储存所述琼脂糖珠。对于本领域技术熟练人员，用于制备抗体亲和柱的许多其它方法是众所周知的(尤其参见Antibodies-A Laboratory Marnual，Harlow，Lane，D.主编，Co1d Spring Harbor Laboratory Press，1988，第519-540页)。
在用于本发明不同实施方案的单一抗体亲和柱及多种抗体亲和柱中，可以使用许多不同的抗体。在一个优选的实施方案中，使用一种特异性结合6至12个氨基酸短肽的抗体，所述短肽被用作标记物/标记。但是，如果已知所选择的肽在热变性后自发地复性(例如耐热蛋白)，则可以用任何长度的肽作为“标记”。在一个优选的实施方案中，当放置在弱酸溶液(例如pH 5.5)中时，所述抗体释放出保留的肽标记物。本发明另一个优选的实施方案是在pH梯度的基础上洗脱抗体亲和柱。
可以将所述流过物用于各B、C、D和E柱或者其它固相一次或更多次。优选多次。在几个循环后，将捕获全部或大多数在单链或双链带有B、C、D或E标记物的片段。在一个最优选的实施方案中，将所述流过物用于该柱3次。该流过物通常将仅包含带有A标记物的、单链片段或双链片段。
用于操作抗体亲和柱的温度可以变化。在一个优选的实施方案中，该温度为从4℃至50℃。在一个最优选的实施方案中，所述抗体亲和柱是水套的，且将所述抗体亲和柱保持在37℃的温度。
其次用低盐(例如50mM NaCl)缓冲液(例如磷酸缓冲液)洗涤B、C、D和E柱。把流过物和洗涤液汇集起来。然后，使来自B、C、D和E柱的、汇集的流过物和洗涤液通过一根仅含有A特异性抗体的柱。接着，可以洗脱捕获的、A标记的片段，将所述片段沉淀；并用未标记的、载体特异性的引物，运用PCR来扩增所述片段。在一个优选的实施方案中，运用20个PCR循环来扩增A标记的片段，且将其克隆以用于分析。关于对文库A特异性的片段(即在文库B、C、D或E中没发现的片段)，这些克隆片段是高度富集化的。
可以用本技术领域已知的任何方法从用于本发明不同实施方案中的抗体亲和柱上洗脱出肽标记的片段。在一个优选的实施方案中，如上所述，通过改变pH(pH梯度)来洗脱所述的柱。在一个最优选的实施方案中，所选择的抗体或其它固相将于弱酸pH(例如pH 5.5)释放肽标记物。
通过改变所述的“拖把”，可以用同样的系列步骤分离用B、C、D或E肽标记的cDNA片段。例如，为了分离用B标记的片段，人们能够着手用一根A、C、D和E多抗体亲和柱留住除B标记片段之外的一切物质。然后，使汇集的该柱的流过物和洗涤液经过一根仅含有B特异性抗体的柱。可以用同样的方法分离对C、D和E文库特异性的片段。
在上述的实施例中，于分离A特异性片段的地方，在第一根柱(多抗体柱)里捕获的物质将包含用B、C、D和E标记物标记的所有片段。这将包括含有一条A标记的链的杂交体。也可以洗脱该物质，并用本发明的其它实施方案将其进一步分类；或者，如同由专业人员另外所希望的。
5.2识别对许多cDNA文库中的两个或更多个文库特异性的cDNA片段在这个实施方案中，运用本发明的方法分离和来自一个或更多个其它文库的cDNA片段共有的cDNA片段(即所述cDNA片段将与来自一个或更多个其它文库的cDNA片段形成杂交体)。例如，如果人们从许多个cDNA文库(例如A、B、C、D和E)开始，则本实施方案允许分离为A文库和C文库(或者为任何其它两种指定的文库)所共同的转录物。在该实施例中，通过解释的方式描述从A文库中分离与来自C文库的cDNA片段形成杂种双链的cDNA片段。
在这个实施方案中，如同在上面5.1节中那样，用连接到载体特异性引物的可辨别文库特异性标记物，通过PCR，来线性化及标记来自许多cDNA文库(A、B、C、D和E)中的每个文库的插入片段。因此，如上所述，所有产生的片段都有在其5’和3’末端的、对应于载体特异性引物序列的相同核苷酸序列，以及表明所述起源文库的一种可辨别的标记物。然后，通过排阻层析纯化标记的PCR产物，从而除去所有的反应组份，包括过量的标记引物。然后，将这些纯化的、标记的PCR产物合并、热变性，并允许其重退火。
在这个实施方案中，如同在第一种方法中，用于杂交的各种PCR反应产物的量可以变化。在这个实施例中，在人们对分离AC杂交体感兴趣的地方，人们能用过量的文库B、文库D和文库E。这种过量的目的是如同在先前的方法中那样用作“拖把”。对于B、D和E的过量的上限，则没有限制。然而，3倍的过量将有效地除去将与来自B、D和E文库的任何些片段形成杂交体的、来自A文库和C文库两者的cDNA片段，且不浪费。因而，3倍的过量是优选的实施方案。在另一个实施方案中，使用超过A和C两倍到100倍的过量的B、D和E。在又一个实施方案中，使用超过A与C2.5倍到10倍的过量的B、D和E。B、D和E的过量程度将决定所述“拖把”的效率。可以用少于2倍的过量；但在该步骤结束时，能与B、D或E中的片段杂交的、显著量的A片段或C片段则仍可保留。
然后，使重退火的混合物通过一根包含对除了关注的两个文库外的所有文库标记物的特异性抗体之层析柱。在这个实施例中，该柱可以包含抗文库B、D和E之标记物的抗体。可以用该多抗体柱的流过物上柱一次或更多次。但是，优选多次，因为每次通过将增加将被留在该柱中的、标记了B、D或E的片段的百分数；并因此从该流过物中除去标记了B、D或E的片段。在几次循环之后，将除去全部或大多数带有B、D或E标记物的片段；且该流过物将仅包含带有A或C标记物的片段。这些片段将由AA双链和CC双链体组成，而且可以包含AC杂交体(即所关注的片段)。这些AC杂交体包含与来自C文库的片段形成杂种双链体的来自A文库的cDNA片段；且这些AC杂交体不被来自B、D和E文库之片段的“拖把”除去。
所述AC杂交体是关注的产物。然后，使包含AA双链体和CC双链体以及AC杂交体的混合物通过一根具有抗A标记物的固定化抗体的抗体亲和柱。该柱将留住全部或大多数的、至少带有一个A标记物的片段。这将包括AA双链体和关注的AC杂交体。可将流出物上样于这种单一抗体柱一次或更多次。伴随着每次通过，将增加留住的A标记片段的量。在一个优选的实施方案中，使所述流过物通过该柱三次。
洗脱由该柱留住的物质，并回收所捕获物质，且将其沉淀。所述回收的物质由AA双链体和AC杂交体组成。然后，将这些双链片段热变性。
在变性后，立即将所产生的单链快速冷却，以防止复性。例如，通过在一干冰和甲醇的浴上快速冷却热变性的物质，可以完成这一步。向所述冷冻的混合物中添加单链结合蛋白(SSB)。这种蛋白将通过包裹单链DNA链而稳定它们，由此防止复性。在这实例中，往冷冻的变性单链混合物中添加过量的SSB。然后，使该冷冻的混合物升温，以允许所述SSB进入到溶液中，并接触所述单链。在一个优选的实施方案中，将所述混合物从干冰/甲醇浴的温度加热到37℃，并在该温度保持几分钟(例如在5和10分钟之间)。所述SSB将包裹及稳定单链DNA链，且将防止杂交体的重新形成和二级结构的形成。
所述DNA的单链包括来自A文库的、与从A文库来的其它片段形成杂交体的片段，以及来自C文库的、与从A文库来的片段形成杂交体的片段。在该阶段存在的该C文库片段将限于能与A文库片段杂交的、并因此被留在抗A抗体柱上的那些片段。另外，这些C文库片段不与用作“拖把”的过量的B、D和E的片段杂交，且因此不被用作“拖把”的过量的B、D和E的片段除去。所以，在A文库中而不是在B、D或E文库中有这些C文库片段。
在这个实施方案中，使用再一步骤，以分离所述SSB包裹的A单链和C单链。这步骤包括使所述SSB包裹的单链通过一根抗体亲和柱。该柱可包含固定化的抗A抗体或者固定化的抗C抗体。如果用抗A抗体柱，那么该柱将留住A标记的片段，且C标记的片段将保留在流过物及洗涤液中。如果用抗C抗体柱，那么该柱将留住C标记的片段；并且可以从这柱洗脱出C标记的片段。在任何一种情况中，均可以回收A标记的片段和C标记的片段。然后，抽提回收的片段，以除去SSB，并用PCR扩增回收的片段。可以克隆这些C标记的片段用于进一步分析；或者，可以将它们用作合并探针(即“扣除探针”)，从而除去来自最初的A文库或C文库的其同系物(参见例如下面的5.4节)。
在本发明该实施方案的一种变化的形式中，可以指定多于两个的关注的文库。例如，如果人们对可以在文库A、B和C之间形成杂交体而不与文库D和E形成杂交体的片段感兴趣，那么第一步照理应该使用超过A、B和C之PCR反应产物量的、过量的D和E的PCR反应产物。在这个实施方案中，多抗体柱理应包含抗D和抗E的抗体。所用的过量的D和E能形成所述的“拖把”，从而除去与A、B或C文库中的一些片段形成杂交体的cDNA片段。这根多抗体柱的流过物和洗涤液理应包含AA双链体、BB双链体和CC双链体，但如果已形成AB杂交体、AC杂交体和BC杂交体，则同样理应含有这些杂交体。这些杂交体是这个实施方案中的关注的产物。如果使该物质通过一根抗A柱，那么AB杂交体和AC杂交体则将被留住。一根抗B抗体柱将留住任何AB杂交体和BC杂交体，而一根包含抗C抗体的抗体柱将留住CB杂交体和CA杂交体。根据上面使用的方法，可以洗脱留在这三根柱上的物质；并将其分离。这理应包括使所述的双链杂交体变性，在一干冰/甲醇浴上快速冷却，继之以升温从而和过量的SSB接触。靠着通过一根包含一种对A、B或C标记物中的任何一种具有特异性的单一抗体的抗体柱，可以分离所述SSB包裹的单链。从这些柱中洗脱出的片段理应含有关注的cDNA片段。
5.3许多文库的矩阵分析在本发明的另一个实施方案中，运用上面陈述方法的变化形式，在许多构建和操作的cDNA文库之间，部分进行阵列或矩阵比较。在这个实施方案中，可以分离存在于N个文库里的两个文库中的任何cDNA片段，这里N是受到矩阵分析的文库的总数。进一步地，可以分离存在于N个文库里的X个文库中的任何cDNA片段，这里的X为其中发现所分离的特定cDNA片段的文库的数目。更进一步地，可以分离仅存在于N个文库里的两个(或三个、或X个)文库中的任何cDNA片段。的确，可以分离任何数目(N)所分析的文库中的任何所需数目(X)之文库的共同的cDNA片段，并且可以确定是否这些片段仅在所分析的N个文库的文库子集中共享。
这个实施方案的一个主要优点是在开始比较分析之前，没有必要具有关于在一特定的cDNA文库中可能有或没有哪些基因(即cDNA片段)的任何知识。而且，也不必知道得自许多文库的cDNA片段之间的同源(即相似)程度。再者，人们在开始所述分析前不必知道是否一个特定的关注文库与任何其它文库共享一些相似的cDNA插入片段。总之，矩阵分析的结果揭示在许多关注文库中的两个或更多个文库里，哪些cDNA片段是共同的(即相似得足够杂交)。
为了阐明本实施方案，我们再一次从五个cDNA文库(A、B、C、D和E)开始。首先，用各个文库的可辨别的标记物，通过PCR，分别将各个文库的cDNA插入片段线性化并且标记。而且，优选5’-肽标记物。如同上述，将各个文库的可辨别的肽标记物连接于用来从文库载体序列起动PCR的寡核苷酸引物对的5’末端。
在PCR线性化和标记步骤之后，分别纯化各个标记文库的内含物，例如，通过排阻层析纯化。该步骤纯化线性化的、标记的插入片段，使其远离不需要的反应组份，例如过量的肽标记引物。用本技术领域众所周知的标准方法中的任何方法可完成这种纯化(例如来自Qiagen，Santa Clarita，Califomia的PCR纯化试剂盒)。
然后，把来自五个文库中的每个文库的、纯化的、可辨别地标记的cDNA片段混合在一起，将其热变性并让其重退火。根据使用者的判断，确定在这个反应中混合在一起的来自每个文库的物质的相对比例。该反应可以用或不用来自一个或更多个文库的、超过另外一个或更多个文库的过量物质。在一个优选的实施方案中，以相等的比例将来自各个文库的标记的cDNA片段混合在一起。
如同已描述的本发明方法那样，这个实施方案基于标记的cDNA插入片段的杂交和分类来进行cDNA文库的比较分析。然而在这里，所述分析使用多达四个阶段的能够结合特异性文库标记物的亲和柱或者任何固相。如同前面那样，可以用本技术领域已知的、适合于通过PCR标记cDNA链的任一标记物。此外，可以使用本技术领域已知的、能够结合这样的标记物的任何亲和柱或任何固相。在一个优选的实施方案中，亲和柱为能够结合肽标记物的抗体亲和柱。
由使用者部分根据所希望的结果，确定在本实施方案中使用的阶段的准确数目、以及它们的使用次序。在这方面，不必分析产生的比较阵列的所有产物，且可以将其储存。例如，在人们希望分离在任何两个关注文库之间共享的插入片段且人们并不关心分离仅仅存在于这两个文库的插入片段的地方，那么，所述分析仅必须进行通过第I阶段和第II阶段。然而，在人们希望分离仅仅存在于一个文库组内的文库中的片段的地方，那么，使用第I阶段、第II阶段和第III阶段。进一步地，在人们希望分离仅仅存在于来自不同文库组的文库中之片段的地方，那么，使用第I阶段、第II阶段和第IV阶段。将一个文库“组”定义为得自一根第I阶段柱的洗脱液，如同在下面各节中进一步陈述的。下面的叙述文描述了用来获得刚刚描述的结果的步骤。正如上面所提到的，虽然已根据抗体亲和柱和肽标记物进行了描述，但是，可以用具有其它类型的结合另外类型标记物的配偶体的、其它类型的固相。
5.3.1第I阶段在第I阶段，将标记的cDNA片段的重退火混合物相继地运加样于一系列抗体亲和柱，所述的每根柱具有一种仅能够识别一种文库标记物的固定化抗体。用另一种方法，可以将该重退火混合物分成等分试样，并单独地加样于每根柱。在这五个文库的实施例中，使用五根柱。将重退火混合物加样于五根单独柱的次序可以是任一次序。例如，该次序可以依次为A柱、B柱、C柱、D柱和E柱。在一个优选的实施方案中，按照串联将五根柱物理地连接。这种布置具有下面的优点在运用所述柱方面有效、将所述柱的加样体积减至最小、以及减少柱流过物和洗涤液的损失。在物理地连接第I阶段柱的系列地方，在该串接中的柱的次序仍然是不重要的，且可以是任一次序。
第I阶段系列的各柱将捕获或留住具有一种特异性标记物的cDNA片段。因此，所述A柱将留住所有A标记的片段，所述B柱将留住所有B标记的片段，等等。例如由A柱留住的片段包括A标记的杂交体(即AA双链体、AB双链体、AC双链体、AD双链体以及AE双链体)和A标记的单链DNA。
然后，一根一根单独地洗脱五根第I阶段柱中的每一根。在物理地连接A柱一直到E柱以用于将cDNA混合物和洗涤液加样的地方，于洗脱前，将这些柱分开。得自每根第I阶段柱洗脱的物质限定一个独立的文库组，如下所述来自A柱的文库组A-AA双链体、AB双链体、AC双链体、AD双链体和AE双链体以及A标记的单链DNA；来自B柱的文库组B BA双链体、BB双链体、BC双链体、BD双链体和BE双链体以及B标记的单链DNA；来自C柱的文库组C CA双链体、CB双链体、CC双链体、CD双链体和CE双链体以及C标记的单链DNA；来自D柱的文库组D DA双链体、DB双链体、DC双链体、DD双链体和DE双链体以及D标记的单链DNA；和来自E柱的文库组E EA双链体、EB双链体、EC双链体、ED双链体和EE双链体以及E标记的单链DNA。
在这个实施例中，所关注的物质是由起源于两个不同文库的链杂交而形成的双链DNA。在将五个文库用作第I阶段的输入混合物的地方，正如在本实例中的，可以形成20种不同的关注双链体。例如，在A柱中，捕获的文库组A的关注双链体包括AB双链体、AC双链体、AD双链体和AE双链体。在B柱中，捕获的文库组B的关注双链体包括BA双链体、BC双链体、BD双链体和BE双链体，等等。参见图1，为第I阶段的、所产生产物阵列的完整的一览表。通常，不关心在第I阶段柱中被捕获的、在各条链上的具有相同标记物的双链体以及任一单链DNA；因此，在图1中没有显示它们。
5.3.2第II阶段在第II阶段分离任何两个关注文库之间共享的cDNA片段(即转录物)。这里，在输入到第II阶段的柱上之前，使来自五根第I阶段柱中的各根柱洗脱液成为单链。这可以用任一本技术领域已知的方法完成。在一个优选的实施方案中，运用单链结合蛋白(SSB)。因而，分别将来自五根第I阶段柱中的各根柱的洗脱液(在图1中从组A一直到组E)热变性并快速冷却(例如干冰/甲醇浴)。添加过量的SSB，然后，使SSB加DNA的混合物升温。在一个优选的实施方案中，将温度升高到37℃，并在37℃保持10至15分钟。SSB包裹变性的单链，并防止复性和二级结构的形成。
然后，将五根第I阶段单一抗体柱中的各根柱的、已变性的、且用SSB稳定的输出物加样于一系列的第II阶段柱。在一个优选的实施方案中，物理地连接各系列第II阶段柱。每根第II阶段柱包含一种固定化的、对一种可辨别肽标记物特异性的单一抗体，所述肽标记物被用来标记输入的cDNA文库。第II阶段柱系列可以包含和所分析的cDNA文库数N一样多的柱。在一个可选择的实施方案中，第II阶段柱系列包含N-1根柱，这里省去的柱对应于该文库(例如对于文库A，可以省去A柱)。在每根第II阶段柱中的固定化的抗体捕获带有一种可辨别肽标记物的单链。然后，分别洗脱每根第II阶段柱。这样，分离一系列的20个组的单链cDNA片段，其中，所述20个组中的每个组包含两个文库共享的(即可杂交的)片段(参见图1，第II阶段)。
例如，在洗脱A文库组中的每根第II阶段柱后(N-1方法)，以单链的形式分离下面的cDNA片段B柱-起源于B文库的、也存在于A文库中的cDNA片段；C柱-起源于C文库的、也存在于A文库中的cDNA片段；D柱-起源于D文库的、也存在于A文库中的cDNA片段；
以及E柱-起源于E文库的、也存在于A文库中的的cDNA片段。
作为一个另外的实例，在N根柱方法中，在洗脱B文库组中的每根第II阶段柱后，以单链的形式分离下面的cDNA片段B柱-仅B的cDNA片段；A柱-起源于A文库的、也存在于B文库中的cDNA片段；C柱-起源于C文库的、也存在于B文库中的cDNA片段；D柱-起源于D文库的、也存在于B文库中的cDNA片段；以及E柱-起源于E文库的、也存在于B文库中的cDNA片段。
对于第II阶段柱的每个系列，可以构建所分离cDNA片段的、类似的一览表，由此完成所述的阵列(参见图1，第II阶段)。
当然，为了进一步进行由使用者希望的分析，可以克隆由第II阶段柱的输出物所产生的阵列中的一些片段。也可以将这样的片段用作“组合探针”，以用例如在本文别处详述的RecA方法，从一个现存的文库中挽回对应的双链克隆。如同在下面进一步陈述的，为了分离仅存在于或者文库组内或者文库组之间的两个或更多个所需文库中的cDNA，也可以将这些片段分别地用作第III阶段和第IV阶段的输入物。
5.3.3第III阶段运用第III阶段分离仅仅被一个文库组里的两个或更多个指定的文库所共享的片段。例如，第III阶段允许分离在文库组A里仅仅被文库A和B、文库A和C、文库A和D以及文库A和E所共享的片段。另外，第III阶段允许分离在文库组B里仅仅被文库B和A、文库B和C、文库B和D以及文库B和E所共享的片段。这种模式同样地适用于文库组C、文库组D以及文库组E。
第III阶段从分别洗脱自如上所述的一个选定文库组里的一系列第II阶段柱中的各柱的单链片段开始。首先通过PCR独立地扩增这些片段，并用适当的肽标记物标记这些片段。例如，在文库组A正经受第III阶段分析的地方，运用B特异性肽标记物，扩增从第II阶段的B柱洗脱的片段；运用C特异性肽标记物，扩增从第II阶段的C柱洗脱的片段；等等。
通过PCR，将属于一个特定文库组的所有独立文库同样地扩增并标记。然后，将扩增的产物混合、变性，并让其重退火。在这个实施例中(正在分析文库A一直到文库E的文库组A)，接着将所述重退火的第III阶段输入混合物分成四份等分试样。所需等分试样的数目取决于该混合物中独立标记物的数目。在这个实施例中，分析文库组A，并且在PCR扩增过程期间所用的标记物为B、C、D和E。所述第III阶段柱包括四系列亲和柱，每个系列包括三根单一抗体柱。这四个系列柱中的每个系列包含对用于第III阶段之PCR扩增步骤中的四种标记物中的三种的特异性抗体。正如这里，在使文库组A经受第III阶段分析的地方，所述的四个系列亲和柱包含系列1-C抗体、D抗体和E抗体；系列2-B抗体、D抗体和E抗体；系列3-B抗体、C抗体和E抗体；以及系列4-B抗体、C抗体和D抗体。
第III阶段的系列1留住用C、D和E标记的任何cDNA片段，让B标记的双链体和单链保留在流过物中。在文库组A里，这些cDNA片段存在于文库A和文库B中，而不存在于文库C、文库D或文库E中。因此，已经分离了仅仅存在于文库A和文库B中的cDNA片段。按照同一方式，第III阶段的系列2仅允许C标记的片段通过；第III阶段的系列3仅允许D标记的片段通过；以及第III阶段的系列4仅允许E标记的片段通过。在这里，已分别分离出仅仅存在于文库A和文库C中的cDNA片段、仅仅存在于文库A和文库D中的cDNA片段、以及仅仅存在于文库A和文库E中的cDNA片段。
因而一般而言，在每个系列柱中，人们运用比用于所述扩增步骤中的标记物的数目少一个的柱。进一步地，人们运用足够的系列以覆盖所有不同的柱的组合。
在一个可选择的实施方案中，使上面刚刚描述的四个系列多抗体柱中的每个系列的流过物接着通过另一根抗体柱。这些柱各包含一种对允许在第III阶段之系列的柱中通过的标记片段的特异性单一抗体。这一步骤可用来浓缩在其它情况下从大体积的流过物和洗涤液中可能难以回收的片段。洗脱并回收由这四种单一抗体柱留住的片段。该物质包括浓缩的、仅被两个特定文库共享的cDNA片段。在这个实施例中，所回收的片段是仅在文库组A里的文库A和B之间、文库A和C之间、文库A和D之间以及文库A和E之间共享的。
5.3.4第IV阶段可以在第IV阶段中进一步分析来自第II阶段的输出物，以确定在所述阵列中的任何两个关注文库共享的cDNA片段在文库组之间而不是在文库组内是否是可辨别的。因此，所述第IV阶段分析通过允许人们使用不同的输入cDNA片段基本上问同一问题，来补充第III阶段分析。所述使用者因而得益于把第III阶段分析的结果同第IV阶段分析的结果相比较。如同在第III阶段中的，由第II阶段的输出物获得用于第IV阶段分析的输入DNA。然而，在第IV阶段分析前于聚合酶链反应反应中连接的标记物与所述文库组的标记物一致，而与所述片段的初始标记物不一致(参见图2中的框)。
因而重要的是，在第II阶段产物的第IV阶段分析前于PCR中连接的标记物与一种特定片段的起源文库不对应。而所述标记物与其中特定片段已发现同系物的文库相对应(即所述文库组)。这样，可以在文库组之间进行类似于第III阶段分析的分析。
例如，为了在文库组之间进行第IV阶段分析，用B肽标记物(参见图2中在“标记物B”的框)标记起源于A文库的、从一根第II阶段B组柱中回收的所有片段。以一类似的方式，分别用C、D和E肽标记物(相应地分别参见图2中在“标记物C”、“标记物D”和“标记物E”的框)相应地标记从一根第II阶段的C、D或E组柱中回收的起源于A文库的所有片段。
在PCR扩增和标记后，将所有这样的差别标记的A文库片段混合、变性，并让其重退火。接着，将所述重退火的混合物分成四份等分试样；并使每一等分试样通过一根类似于第III阶段系列1-4柱的多抗体亲和柱。因此，每根多抗体亲和柱包含三种标记物特异性抗体。如同这里，在对起源于A文库中的片段进行第IV阶段分析的地方，第IV阶段的四个系列柱包含系列1-C抗体、D抗体和E抗体；系列2-B抗体、D抗体和E抗体；系列3-B抗体、C抗体和D抗体；以及系列4-B抗体、C抗体和E抗体。
如同关于第III阶段分析的，然后，可以合并来自每根第IV阶段系列之柱的流过物和洗涤液，并将其加样于一根包含一种单一抗体的柱；所述单一抗体对一种仍然没被捕获的标记物特异性的。例如，可以合并上述第IV阶段系列1柱的输出物，并使其通过一根包含抗B的柱。在图4中显示了起源于A文库中的片段和起源于B文库中的片段的代表性的结果(参见“第IV阶段的输出物”)。正如所描述的第III阶段输出物的情况，从每根第IV阶段的单一抗体柱中洗脱出的物质包括浓缩的、仅仅由两个文库共享的cDNA片段(即在所述分析的其它文库中是没发现的)。
5.3.5进一步的考虑同样，通过操作第III阶段和第IV阶段系列柱以除去较少的片段，人们可以分离三个(或更多个)文库共同的片段，而把其余的片段除外。例如，在起源于文库A的片段的第IV阶段分析方面，当该分析的目标是分离存在于A、C和E中而不存在于B或D中的片段时，人们可以操作一根仅仅包含B和D抗体的第IV阶段系列的柱。
5.4构建扣除文库方法的运用在另一个实施方案中，可以用本发明的方法构建扣除的cDNA文库，即从两个或更多个cDNA文库中除去相似的克隆。本文描述的方法利用大肠杆菌RecA蛋白的能力，来形成作为重组中间体的稳定的三链结构。在大肠杆菌同源重组期间，RecA催化同源配对和链的交换反应。在该反应的第一个步骤期间，RecA包裹DNA的一条单链，并在该单链与双链DNA的同源区之间起动一种交换反应。形成一种三链核蛋白中间体，在没有ATP的情况下，这种三链核蛋白中间体是惊人地稳定的(参见West，1992，Annu.Rev.Biochem.，61603-640)。
用肽标记的载体特异性引物通过PCR来扩增所关注的cDNA片段，例如如上所述鉴定的由不同文库共享的那些片段。因此，一种可辨别的肽标记物标明特定的一组cDNA序列。同时把这样片段组同时用作“扣除探针”。在PCR和热变性后，通过排阻层析纯化一组扣除探针。然后，快速冷冻该cDNA混合物(例如，干冰/甲醇)。将一等份RecA蛋白与不能水解的ATP(例如ATPγS)一道添加到所述冰粒上。慢慢融化该冰粒。低温和该ATP类似物阻止RecA结合的单链DNA复性，以致该扣除探针仍然是单链，且变得被RecA包裹。
以纯化的双链环状DNA的形式把待扣除的文库添加到融化的冰粒上，以致于存在大量过量的RecA包裹的单链(20-50倍)。将这混合物加热到37℃。RecA包裹的单链搜索该双链cDNA文库以寻找同源序列，并与这样的同源序列配对；从而形成三链重组中间体，尽管由于没有可水解形式的ATP而将不发生链的交换。由单链DNA和同源的双链DNA所形成的三链结构标记有结合于单链的特异性肽标记物。通过使这种溶液流过一根肽标记物特异性抗体柱，可以将这样的标记的三链结构与未标记的双链环状分子分开。如果存在比起质粒克隆来大量过量的RecA包裹的单链，则将从该文库中除去对应于所述标记片段的大部分或全部克隆。
本实施方案的这方法与用来构建文库之核酸的原来性质无关。因此，可以用由cDNA或基因组DNA制成的文库来应用该方法。
在一个优选的实施方案中，单链片段和双链文库质粒都在至少10-15碱基范围内共享相同的末端(即5’和3’末端)，且同源片段的长度至少为350bp。就RecA形成稳定的三链结构而言，如果存在强烈的总体同源性，则不需要片段之间的完全相同(参见例如Rao等，1995，Trends In Biological Science 20109-113)。在另一个优选的实施方案中，所述克隆的插入片段的长度不超过1-2千碱基(kb)，以便不选择出仅仅与所述扣除探针共享强烈的局部同源性的克隆。
5.5各种方法在监测基因表达方面的运用在本发明另一个实施方案中，提供监测基因表达事件的方法。使用用可识别的特异性肽标记物标记的寡核苷酸，但在这个实施方案中，待监测表达的靶(即基因)是已知。例如，如果目的是确定一种特定药物治疗的作用机制或生理作用，这些靶可以属于一个表达级联。对于本实施方案的方法，一种可选择的运用是基于与一种特定表型相关的代谢途径的活化或抑制，来监测确定一种表型之基因的表达。这个方法的优点是提供了一种基于所述肽标记物而分类、分离和定量所述产物(代表待监测表达的靶)的简单且快速的方法。
另外，这个实施方案的方法允许直接地定量测定靶mRNA的存在量。简短地说，运用来自第一条链合成反应的、未扩增的cDNA进行聚合酶链反应。对于一固定且限制数目的PCR循环(例如从大约5个至20个循环)，该反应的产物与存在于该反应中的非基因组的大小小(小于2kb)的DNA靶的起始量成正比。对于本领域技术熟练人员，定量的PCR技术是众所周知的。
这个实施方案的方法不仅将允许直接监测基因表达事件，而且将允许分离部分长度的转录物；且无需先构建相关的cDNA文库，并从非常少的活组织检查样品开始；所述活组织检查的样品可能太少，以致于无法允许构建新的cDNA文库。
这个实施方案的敏感性和多用性使其能被应用于分析一种特定表型对一特定刺激物或一组条件的反应。另外，这种方法提供一种快速而准确的、直接确定影响基因表达的任何处理形式的生理作用的手段；所述处理形式例如用类固醇激素处理。因为通过检查mRNA的产生而直接地进行这一步，所以不必等待明显的临床结果自身显现或血清学因子的产生。因此，可以用这个实施方案的方法对可能的处理结果作出迅速的评价；或者，可用这个实施方案的方法提供快速而直接的反馈，从而使得能够进行治疗的再调整以使结果最佳化。
在这个实施方案中，用本领域技术熟练人员众所周知的标准方法从该组织样品中提取总RNA。将总RNA用于与靶特异性探针杂交。这些探针中的每一种包括一种在5’末端用一种特定的肽表位或标记物标记且在3’末端用一种荧光团标记的合成寡核苷酸。如果存在靶mRNA分子，则在允许探针与它们的靶mRNA分子杂交的条件下，将所述单链探针与总RNA的样品混合。在杂交后，用单链特异性的DNA酶处理该混合物，以便破坏所有未杂交的过量的探针，或者以便完成在保持单链的探针上的肽标记物与荧光标记物之间的分离。这里，本领域技术熟练人员将认识到其它可探测标记物可替代该荧光标记物。然后，将该混合物显露在一种已布置了标记物特异性抗体或其它结合配偶体的固体表面上(例如一块ELISA板)，从而确定每种靶特异性探针的相对位置。只有那些已与其靶杂交的探针会在该固体表面上的特定位置产生荧光或其它可探测的信号；在所述的阵列中的位置表明该靶的存在和身份，并且该信号的强度表示在最初的RNA样品里的每个靶的相对丰度。
也可以用这个实施方案来分离只是部分全长转录物的全长形式。如同先前那样提取总RNA，并将该总RNA的等分试样用于使用靶特异性非磷酸化引物的、cDNA第一条链的合成(参见图3)。
该合成利用一种不具有RNA酶-H之活性的、依赖RNA的DNA聚合酶(即逆转录酶)(例如莫洛尼氏鼠白血病病毒的逆转录酶)。对本领域技术熟练人员，用于完成该合成的方法是众所周知的(Sambrook等，1989，《分子克隆》实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。该合成的结果是在DNA链的5’末端具有靶特异性引物的DNARNA杂交体。通过用切割单链mRNA突出的绿豆核酸酶处理，可以除去任何RNA突出，以产生平端。
可以在适合于使用绿豆核酸酶的标准条件下完成这个反应。例如，可以将DNARNA杂交体悬浮于包括50mM乙酸钠(在25℃时pH5.0)、30mM NaCl、1mM ZnSO4的绿豆核酸酶缓冲液中。以每微克DNARNA杂交体1.0个单位的量添加绿豆核酸酶，并在30℃将该混合物保温30分钟。然后，通过苯酚/氯仿抽提或者通过添加SDS到0.01％可使所述酶失活。通过乙醇沉淀，可以回收平端杂交体。Kowalski，D.等，(1976)Biochemistry 15，4457-4463；McCutchan，T.F.等，(1984)Science 225，626-628。
通过标准排阻层析纯化该样品。纯化后，该样品包括DNARNA杂交体以及最初存在的总RNA种类的残余物。该排阻层析除去小的RNA种类(例如tRNA)以及过量的靶特异性引物。
此时，用来自T4噬菌体的DNA连接酶进行连接反应。该连接酶将催化在DNA或RNA的邻近的3’-羟基末端和5’-磷酸酯末端之间的磷酸二酯键的形成；且因此将把双链DNA片段的3’-末端连接到双链DNARNA杂种分子的5’-末端上。所用的引物为一种部分双链的、磷酸化的第二种引物(即不是靶特异性的引物)，例如一种M13“正向”测序引物(参见图4)。
噬菌体T4的DNA连接酶仅仅将把该引物全部连接到DNARNA杂交体的磷酸化末端上。然而，某些所述引物分子也将连接到DNARNA杂交体的RNA链的3’-末端上。这将不影响结果，因为在随后步骤中的DNA聚合酶将不用RNA作为模板，且因为在3’方向上没有模板可利用，因此，在该位点的起动将不导致由于从头合成的延伸。
可以从New England Biolabs(Waverly，Massachusetts)获得纯化自大肠杆菌的T4DNA连接酶。可以在T4DNA连接酶缓冲液中进行该反应，所述T4DNA连接酶缓冲包含50mM Tris-盐酸(pH7.8)、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMATP、25μg/ml的牛血清白蛋白。在一个优选的实施方案中，在16℃进行该反应，反应时间在4小时和16小时之间。Engler，M.J.和Richardson，C.C.(1982)载于TheEnzymes(Boyer P.D.，编辑)第5卷、第3页，Academic Press，San Diego，CA。
在连接反应以后，通过排阻层析再一次纯化该样品，并通过PCR扩增。
该PCR反应既使用互补于先前所用的靶特异性引物的、肽标记的引物，又使用互补于该连接反应中所用的部分双链磷酸化标准引物的、生物素化引物。在一个优选的实施方案中，这一PCR反应包括50纳克的酵母RNA/30微升溶液。在这个PCR反应中的循环次数可变化。在一个优选的实施方案中，用20次或更少次的循环。
在这个实施方案的一种变化形式中，可以在PCR之前、紧接所述连接反应后，用RNA酶处理该样品。这将破坏所有的RNA链，包括总RNA的单链和DNARNA杂种分子的RNA链。然后，可以通过排阻层析纯化该样品，以及如同上述地将该样品PCR扩增和标记。接着，通过排阻层析纯化扩增的产物，除去所有过量的引物。
可以用酶联免疫分析技术(ELISA)的改进形式来定量测定通过聚合酶链反应而产生的产物量。可以在用特异性抗体包被的微量滴定板各孔中分析这种纯化的反应混合物；所述特异性抗体为针对连接到所述靶特异性引物的肽标记物的特异性抗体。然后，可以添加链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶，以结合到与保留的PCR产物之标准引物相连接的生物素部分。接着，可以添加辣根过氧化物酶的底物，并定量测定反应产物(参见例如Sambrook等，1989，《分子克隆》-实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press于18.75)；从而表明存在于最初样品中的靶mRNA的量。
在该方法的另一个实施方案中，可以同时分析几种不同的靶。在第一条链合成反应中，可以用两种或更多种靶特异性引物。可以将互补于靶特异性引物的、可鉴定和有差别的肽标记引物用于所述的聚合酶链反应中。在这个实施方案中，根据引物的解链温度(Tm)和形成二级结构的习性，挑选适合的、所涉及的引物。
5.6挑选输入物的表型根据一个本领域技术熟练人员的需要，可以挑选由本发明方法中使用的cDNA文库提供的输入物的表型。另外，为了挑选表型，人们可以使用由Iris，F.和Poumy，JL.的名为“用于鉴定作为确定的表型之基础的基因的方法”的共同待审的美国专利申请中公开的方法；所述专利申请的序号为09/007,905，提交日期为1998年1月15日。通过引用，将这个共同待审的申请全部结合到本文中。
5.7与本发明一起使用的方法和产物5.7.1 DNA的扩增结合本发明，运用聚合酶链反应(PCR)扩增来自一种来源(例如一组织样品、一基因组文库或cDNA文库)的所需序列。可以将代表已知序列的寡核苷酸引物用作PCR中引物。典型地，通过使用一台热循环仪(例如，来自Perkin-Elmer Cetus)和一种热稳定的聚合酶(例如，GeneAmpTM牌的Taq聚合酶)，进行PCR。待扩增的核酸模板可以包括但不限于来自任何物种的mRNA、cDNA或基因组DNA。PCR扩增的方法在本技术领域是众所周知的(参见例如，编号为4,683,202、4,683,195和4,889,818的美国专利；Gyllenstein等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7652-7656；Ochman等，1988，Genetics 120，621-623；Loh等，1989，Science 243，217-220)。
任何原核细胞、真核细胞、或病毒均可以用作核酸源。例如，可以从下面的来源获得核酸序列，所述下面的源为人、猪、牛、猫、鸟类、马、犬、昆虫(例如果蝇属)、无脊椎动物(例如C.elegans)、植物，等等。可以用本技术领域已知的标准方法获得DNA(参见例如Sambrook等，1989，《分子克隆》-实验室手册，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover(编辑)1985，DNA CloningA Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.卷I、卷II)。
5.7.2控制严格性可结合本发明的方法加以应用的其它方法包括在低、中或高严格条件下的核酸杂交(例如RNA印迹和DNA印迹)。用于控制杂交严格性的方法在本技术领域是众所周知的(参见例如Sambrook等，1989，《分子克隆》-本实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；也参见Ausubel等，编辑，在实验室技术手册系列的Current Protocols in Molecular Biology，1987-1994，Current Protoeols，1994-1997 John Wiley and Sons，Inc.；尤其参见Dyson，N.J.，1991，核酸的固定化与杂交分析，载于EssentialMolecular BiologyA Practical Approach，卷II，第111-156页，T.A.Brown编辑，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，U.K.；通过引用，将这些资料中的各份的内容全部结合到本文中)。当按照本技术领域已知的方法调节一特定杂交反应的严格性时，盐浓度、解链温度、不存在或存在变性剂、以及待杂交核酸(例如DNA、RNA、PNA)的类型和长度是一些被考虑的可变因素。
作为实例而不是限制性的，低严格性的条件可以是如同下面的条件(也参见Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6789-6792)。在40℃，将含有DNA的滤膜于一包含35％甲酰胺、5XSSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA、以及500μg/ml的变性鲑精DNA的溶液中预处理6小时。在具有下面修改的上述溶液中进行杂交反应；所述修改为0.02％的PVP、0.02％的Ficoll、0.2％的BSA、100μg/ml的鲑精DNA、10％(重量/体积)的硫酸葡聚糖、以及使用5-20X106cpm的32P标记的探针。在40℃，将滤膜保温于杂交混合物中达18至20个小时，然后，在55℃于一包含2XSSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA以及0.1％SDS的溶液中洗涤滤膜1.5小时。用新鲜溶液替代该洗涤溶液，并在60℃再保温1.5小时。将滤膜吸干，并使其处于放射自显影的条件下。如果必要的话，在65-68℃第三次洗涤滤膜，并再次使其对胶片曝光。
作为实例且不限于此，高严格性的条件可以是如同下面的条件。于65℃，在由6XSSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA、以及500μg/ml的变性鲑精DNA组成的缓冲液中，将含有DNA之滤膜的预杂交进行8个小时至过夜。在一包含2XSSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll以及0.01％BSA的溶液中，于37℃进行滤膜的洗涤达1小时。这后面是在放射自显影之前，于50℃用0.1XSSC洗涤45分钟。
5.7.3寡核苷酸类似物结合本发明的方法使用的核酸常常是长度范围从10个核苷酸到大约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体的方面，寡核苷酸的长度为10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸或50个核苷酸的长度。寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者可以是其嵌合混合物或其衍生物或其修饰的形式，寡核苷酸或者为单链、或者为双链，或为部分双链。可以在寡核苷酸的碱基部分、糖部分、或磷酸酯主链、或其组合修饰寡核苷酸。寡核苷酸可以包括其它的附加基团，例如生物素、荧光团、或肽。
寡核苷酸可以至少包括一种选自下面组的、修饰的碱基部分，所述下面的组包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、以及2，6-氨基嘌呤。
寡核苷酸可以至少包括一种选自以下组的、修饰的磷酸酯主链，所述组包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、酰胺基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯(alkylphosphotriester)、以及其formacetal或其类似物。
可以使用本技术领域已知的任一方法来合成结合本发明方法使用的寡核苷酸或其衍生物；例如，通过用一台自动化的DNA合成仪(例如商业上可从Biosearch、Applied Biosystems等公司买到的DNA合成仪)来合成。作为实例，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.Acids Res.16，3209)合成硫代磷酸寡核苷酸；通过用控制孔的玻璃聚合物载体(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.85，7448-7451)，可以制备甲基膦酸寡核苷酸，等等。寡核苷酸可以是α-端基异构体的寡核苷酸。α-端基异构体的寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂交体，在所述双链杂交体中，与通常的β-单位相反，链相互之间平行(参见Gautier等，1987，Nucl.Acids Res.15，6625-6641)。
可以用本技术领域已知的任一方法来合成寡核苷酸(例如在一台Applied Biosystems的392/394 DNA合成仪上的标准亚磷酰胺化学)。此外，可以从许多商业供应商中的任何一家获得用于合成的试剂。
在寡核苷酸合成期间，可以使用间隔亚磷酰胺分子，例如桥接不希望有碱基对的寡核苷酸区域；或者，把标记物或标记定位于适当的位置，从而远离进行碱基配对的寡核苷酸部分。通过陆续加入间隔亚磷酰胺，可以变化该间隔物的长度。可以将间隔亚磷酰胺分子用作5’-或3’-寡核苷酸的修饰因子。这样的间隔物包括间隔亚磷酰胺9(即9-O-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)、以及间隔亚磷酰胺18(即18-O-二甲氧基三苯甲基-六甘醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)，两者都可从Glen Research(Sterling，Virginia)得到。
可以将其它的间隔物加以应用于标准的寡核苷酸合成。例如，可以运用间隔亚磷酰胺C3和d间隔亚磷酰胺(dSpacer Phosphoramidite)，从而使在捕获寡核苷酸范围以内不希望有的自身杂交作用不稳定；或者，使错误配对的模板/探针复合物之间的假杂交事件不稳定。如果将这样的间隔物定位在寡核苷酸的3’末端，则当在PCR反应混合物中包含它们时，这种定位的间隔物也将阻止产生错误延伸的产物。
可以添加一种可从Glen Research得到的间隔物间隔亚磷酰胺C3(即3-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-1-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)，以取代在一寡核苷酸序列里的、未知的一碱基。
作为增加标记物掺入寡核苷酸中的一种方法，可以使用分支的间隔物。靠通过许多分支捕获探针的杂交或PCR引物，也可用这样的分支间隔物来增强可检测出的信号。商业上，分支间隔物是可买到的，例如从Glen Research买到。
生物素化的寡核苷酸是本技术领域众所周知的。运用生物素-NHS酯的方法可以将寡核苷酸生物素化。用另一种方法，可以在寡核苷酸合成期间用生物素亚磷酰胺将生物素连接上(Cocuzza，1989，Tetrahed.Lett.30，6287-6290)。一种可从Glen Research买到的、这样的生物素亚磷酰胺是1-二甲氧基三苯甲氧基-2-(N-生物素基-4-氨基丁基)-丙基-3-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺。这种化合物也有一分支点允许进一步连接。Nelson等已描述了用于这种生物素亚磷酰胺方面的分支间隔物(1992，Nucl.Acids Res.20，6253-6259)。
可以用另一种5’-生物素亚磷酰胺，即[1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素基-6-氨基己基]-2-氰乙基-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺，使寡核苷酸生物素化。在Zeneca PLC的许可之下，Glen Research出售这种化合物。
也可以用染料标记的亚磷酰胺将荧光染料掺入寡核苷酸中。两种这样的标记物为5’-六氯荧光素亚磷酰胺(HEX)和5’-四氯荧光素亚磷酰胺(TET)，两者都可从Glen Research买到。
5.7.4标记的寡核苷酸的产生可以用各种各样的标记物标记寡核苷酸，供本发明不同的实施方案之用。例如，Burdick和Oakes的名为“用固相捕获手段检测核酸的诊断试剂盒与方法”的欧洲专利公布号EP 0370 694 A2的出版物，公开了将标记物连接到寡核苷酸上的方法；该出版物的公布日期为1990年5月30日。
对于本领域技术人员，将肽连接到寡核苷酸上的方法是众所周知的；例如，参见1)Soukchareun S等，包含病毒融合蛋白的反义寡核苷酸-肽杂种的制备和特性鉴定；Bioconjug.Chem.，1995，6(1)43-53；2)Tung CH等，寡核苷酸-肽缀合物的制备；Bioconjug.Chem.，1991，2(6)464-465；3)Bmick RK等，模板指导的肽与寡核苷酸的连接；Chem.Biol.，1996，3(1)49-56；4)Tung CH等，HIV-1 TAR RNA与Tat肽-寡核苷酸缀合物的双重特异性相互作用； Bioconjug.Chem.，1995，6(3)292-295；5)Robels J.等，磷酸二酯连接的肽-寡核苷酸杂种的合成及酶稳定性；Bioconjug.Chem.，1997，8(6)785-788；以及6)Rajur S.B.等，用于有效传递反义分子的共价蛋白-寡核苷酸缀合物；Bioconjug.Chem.，1997，8(6)935-940。
可以例如，从Cybergene S.A.(11 rue Claude Bemard，zl nord，35400，Saint Mallo，France)和Glen Research(22825 Davis Drive，Sterling，Virginia 20164)获得供本发明方法之用的连接到不同肽的寡核苷酸。来自Glen Research的进一步的资料可通过其网址(WWW.glenres.com)而获得。
由Glen Research推荐的、用于将肽连接到寡核苷酸的一种具体方法如下(也参见WWW.glenres.com)。用一种异双官能交联试剂，将具有一个N-末端赖氨酸残基的合成肽连接到一5’-巯基修饰的寡核苷酸上。这样的一种交联试剂为N-马来酰亚胺基-6-氨基己酰基-(2’-硝基，4’-磺酸)苯酯(mal-sac-HNSA)。mal-sac-HNSA的钠盐可从BachemBioscience买到。方便地是，该mal-sac-HNSA交联剂与氨基的反应释放出二价阴离子酚盐(即1-羟基-2-硝基-4-苯磺酸)。这种二价阴离子酚盐也是一种黄色发色团。该发色团的特性提供(i)用于量化偶联反应的完成程度的方法(在该反应中较大的黄颜色强度对应于一更完全的偶联反应)、以及(ii)在凝胶过滤期间监测将活化的肽(即交联到mal-sac-HNSA且准备与5’-巯基修饰的寡核苷酸接触的一种肽)和游离的交联试剂分开的程度的一种帮助。
当用mal-sac-HNSA交联剂时，所用的具体步骤可如下。第一步，合成一种具有一个N-末端赖氨酸的肽。另一方面，可以用具有一内部赖氨酸的肽，因为赖氨酸的ε-氨基实际上比赖氨酸的α-氨基更具活性。第二步，用本技术领域已知的方法合成具有一个5’-巯基的寡核苷酸。第三步，在磷酸钠缓冲液(pH7.1)中，将该肽与过量的mal-sac-HNSA反应。第四步，用一根凝胶过滤柱(例如NAP-5，Pharmacia，Uppsala，瑞典)，将肽-mal-sac-HNSA缀合物和游离的交联剂分离，并把缓冲液交换成磷酸钠缓冲液(pH6)。第五步，在一根凝胶过滤柱上，将一种巯基修饰的寡核苷酸活化、脱盐，且将缓冲液交换成磷酸钠缓冲液(pH6)。第六步，将这活化的肽与所述巯基修饰的寡核苷酸反应。最后，通过离子交换层析(例如Nucleogen DEAE-500-10或同等物)纯化所述肽-寡核苷酸缀合物。来自该离子交换柱的洗脱次序如下首先是游离肽，其次为肽标记的寡核苷酸，且最后是游离的寡核苷酸。
5.7.5抗体和肽与本发明的方法一起使用的抗体包括本技术领域已知的任何抗体。例如，可以用这样的抗体来操作所关注的核酸。在这方面，通过抗体结合到核酸本身或者通过抗体结合到一种与该核酸结合(共价或者非共价地)的抗原(例如一种蛋白、肽或半抗原)上，可操作核酸。在一个优选的实施方案中，用共价连接到PCR引物的肽抗原来操作核酸。这样的抗体包括但不限制于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体；如同在下面所描述的。此外，也可以用单链抗体、Fab片段和F(ab)’2片段、由一Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体、以及上述各种中的任一种的结合表位的片段。
可以与本发明一起使用的多克隆抗体为来源于被免疫动物血清的抗体分子的异种群。可以周本技术领域众所周知的各种各样的方法来生产所关注抗原的多克隆抗体。例如，通过用所关注抗原或其衍生物注射，来免疫各种各样的宿主动物，从而生产多克隆抗体；所述宿主动物包括但不限制于兔、小鼠、大鼠、等等。可以根据宿主的物种，用不同的佐剂来增强免疫应答；且所述佐剂包括但不限制于弗氏佐剂(完全的和不完全的)、例如氢氧化铝的矿物凝胶、例如溶血卵磷脂的表面活性物质、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及诸如BCG(卡介菌)和小棒杆菌之类的潜在有用的人用佐剂。这样的佐剂也是本技术领域众所周知的。
可以与本发明一起使用的单克隆抗体是特定抗原的同种抗体群。通过用本技术领域已知的任一技术，可制备所关注抗原的单克隆抗体(mAb)；所述任一技术可供用于用培养中的传代细胞系考生产抗体分子。这些技术包括但不限制于最初由Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术(1975，Nature 256，495-497)、更新近的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，Immunology Today 4，72)、以及EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，《单克隆抗体与癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。这样的抗体可以属于包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、的免疫球蛋白种类以及其任一亚类。可以在体外或体内培养生产用于本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
可以与本发明方法一起使用的单克隆抗体包括但不限制于人的单克隆抗体。可以用本技术领域已知的许多技术中的任一种(例如，Teng等，1983，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.80，7308-7312；Kozbor等，1983，ImmunologyToday 4，72-79；Olsson等，1982，Meth.Enzymol.92，3-16)，来制备人的单克隆抗体。
可以与本发明方法一起使用嵌合抗体。一种嵌合抗体是一种其中不同的部分来源于不同动物物种的分子；例如，具有来源于一种鼠单克隆抗体的可变区和一种人免疫球蛋白恒定区的分子。通过将来自合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起，可得到用来生产这样的嵌合抗体的各种各样的方法(参见例如，Morrrison等，1984，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.81，6851-6855；Neuberger等，1984，Nature，312，604-608；Takeda等，1985，Nature，314，452-454)。
可以与本发明方法一起使用人源化单克隆抗体。简单地说，人源化抗体是来自非人类物种的抗体分子，这种抗体分子具有一种或更多种来自非人类物种的互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。已经提出了各种各样的、用于生产人源化抗体的技术(参见例如，Queen，美国专利第5,585,089号，通过引用将其全部结合到本文中)。免疫球蛋白的一轻链可变区或重链可变区包括一个被三个称为互补决定区(CDR)的高变区间隔的“框架”区。已精确地确定了所述框架区和互补决定区的范围(参见Kabat等，1983，有免疫学意义的蛋白序列，U.S.Department of Health and Human Services)。
另一方面，可以采用已描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号；Bird，1988，Science 242，423-426；Huston等，1988，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.85，5879-5883；以及Ward等，1989，Nature.334，544-546)来生产可用于本发明装置的单链抗体。通过经由一氨基酸桥，将Fv区的重链片段和轻链片段连接在一起，从而产生一单链多肽，来形成单链抗体。
根据已知技术，可以制备出识别特定表位的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限制于能够用胃蛋白酶消化抗体分子而产生的所述F(ab’)2片段、以及可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而产生的所述Fab片段。另一方面，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Scienee 246，1275-1281)，以允许快速而容易鉴别具有所需特异性的、单克隆抗体的Fab片段。
抗体生产和使用的其它一般方法适合于结合本发明方法使用。例如，参见Harlow和Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；通过引用将其全部结合到本文中。
所述单字母氨基酸密码相当于在本文下面所显示的序列表中的三字母氨基酸密码，如下所述A，Ala；R，Arg；N，Asn；D，Asp；B，Asx；C，Cys；Q，Gln；E，Glu；Z，Glx；G，Gly；H，His；I，Ile；L，Leu；K，Lys；M，Met；F，Phe；P，Pro；S，Ser；T，Thr；W，Trp；Y，Tyr；以及V，Val。
供本发明方法使用的适当抗体包括下面的抗体，从法国巴黎的Affinity Bioreagents公司(Affinity Bioreagents，Inc.，79，rue des Morillons，75015，Paris，France.)可买到它们。
1)目录号PA 1-047(亲和纯化的兔IgG)。由该抗体识别的对应肽为KFSREKKAAKT(SEQ ID NO1)。
2)目录号PA 1-039(亲和纯化的兔免疫球蛋白)。由该抗体识别的对应肽为DQKRYHEDIFG(SEQ Id NO2)。
3)目录号PA 1-036(纯化的兔IgG)。由该抗体识别的对应肽为DLKEEKDINNNVKKT(SEQ ID NO3)。
4)目录号PA 1-014(纯化的兔抗体)。由该抗体识别的对应肽为CTGEEDTSE(SEQ ID NO4)。
5)目录号PA 3-013(亲和纯化的IgG)。由该抗体识别的对应肽为PEETQTQDQPM(SEQ ID NO5)。
6)目录号PA 1-815(兔抗血清)。由该抗体识别的对应肽为QKSDQGVEGPGAT(SEQ ID NO6)。
7)目录号PA 3-034(兔多克隆血清IgG)。由该抗体识别的对应肽为DIGQSIKKFSKV(SEQ ID NO7)，这种多克隆抗体也将识别QRADSLSSHL(SEQ ID NO8)。
另外，可从Medical & Biological LaboratoriesCo.，Ltd.(440Arsenal Street，Watertown，Massachusetts 02171，U.S.A.)获得供本发明方法使用的抗体。
这些抗体包括下面的抗体1)代码号561(来自抗血清的兔IgG)。识别的对应肽为YPYDVPDYA(SEQ ID NO9)。
2)代码号562(来自抗血清的兔IgG)。识别的对应肽为EQKLISEEDL(SEQ ID NO10)。
3)代码号563(来自抗血清的兔IgG)。识别的对应肽为YTDIEMNKLGK(SEQ ID NO11)。
在此描述和要求保护的本发明不限于由本文公开的特定实施方案限定的范围；因为打算把这些实施方案作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案均意味着在本发明的范围内。实际上，对于本领域技术熟练的人员，除了在本文中显示和描述的那些外，根据先前的描述，本发明各种各样的修改将变得显而易见。这样的修改同样意味着属于在附上的权利要求书的范围内。在整个本申请中引用了各种各样的参考资料，由此，通过引用，将它们中的每份的内容全部结合到本申请中。
序列表<110> VALIGENE CORPORATION<120> 用肽标记的寡核苷酸来操作复杂核酸种群的方法<130> 9408-025-228<140> PCT/US99/23906<141> 1999-10-15<160> 11<170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 11<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 1Lys Phe Ser Arg Glu Lys Lys Ala Ala Lys Thr1 5 10<210> 2<211> 11<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 2Asp Gln Lys Arg Tyr His Glu Asp Ile Phe Gly1 5 10<210> 3<211> 15<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 3Asp Leu Lys Glu Glu Lys Asp Ile Asn Asn Asn Val Lys Lys Thr1 5 10 15<210> 4<211> 9<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 4Cys Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ser Glu1 5<210> 5<211> 11<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 5Pro Glu Glu Thr Gln Thr Gln Asp Gln Pro Met1 5 10<210> 6<211> 13<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 6Gln Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly Pro Gly Ala Thr1 5 10<210> 7<211> 12<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 7Asp Ile Gly Gln Ser Ile Lys Lys Phe Ser Lys Val1 5 10<210> 8<211> 10<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 8Gln Arg Ala Asp Ser Leu Ser Ser His Leu1 5 10<210> 9<211> 9<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 9Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5<210> 10<211> 10<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 10Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu1 5 10<210> 11<211> 11<212> PRT<213> Oryctolagus cuniculus<400> 11Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Lys Leu Gly Lys1 5 10
权利要求
1.将来源于许多cDNA文库的核酸混合物分类的方法，所述方法包括(a)用具有可区别每个文库的标记物的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应，标记来自许多cDNA文库中的每个文库的DNA；(b)在以致于杂交能发生的这样的条件下，使在步骤(a)中用第一种所述标记物标记的DNA与在步骤(a)中用一种不同的所述标记物标记的DNA接触；以及(c)运用一种或更多种能够结合可区别每个文库的标记物中的一种的分子，将在步骤(b)中接触的DNA分类。
2.权利要求1的方法，其中，所述的可区别每个文库的标记物为一种5’-肽标记物。
3.权利要求1的方法，其中，所述的可区别一个文库的标记物为生物素。
4.权利要求1的方法，其中，所述一种或更多种分子中的至少一种是抗体。
5.权利要求1的方法，其中，所述寡核苷酸引物从许多cDNA文库共同的载体序列起动聚合酶链反应。
6.权利要求1的方法，其中，所述分类包括(d)将从步骤(b)产生的间隔物DNA链变性；(e)使在(d)中变性的单链与单链结合蛋白接触，以防止链的重退火；以及(F)使在(e)中形成的、单链结合蛋白包裹的单链与一种或更多种的分子接触，每种所述分子能够结合可区别每个文库的标记物中的一种。
7.权利要求1或权利要求6的方法，其中，所述一种或更多种分子中的至少一种是抗体。
8.比较cDNA文库的方法，所述方法包括(a)用具有第一种5’-肽标记物的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应，标记来自第一种cDNA种群的DNA；(b)用具有第二种5’-肽标记物的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应，标记来自第二种cDNA种群的DNA；(c)在以致于杂交能发生的这样的条件下，使在步骤(a)中标记的DNA与在步骤(b)中标记的DNA接触；以及(d)使具有所述第一种与所述第二种5’-肽标记物的DNA和仅具有所述第一种或所述第二种5’-肽标记物的DNA分开。
9.权利要求8的方法，其中，所述第一种cDNA种群来自经受了第一种条件的一种或更多种细胞、或者一生物，且所述第二种cDNA种群来自没有经受所述第一种条件的同一类型的一种或更多种细胞、或者一生物。
10.权利要求8的方法，其中，所述第一种cDNA种群来自经受了第一种条件的一种或更多种细胞、或者一生物，且所述第二种cDNA种群来自经受了第二种条件的同一类型的一种或更多种细胞、或者一生物。
11.权利要求8的方法，其中，所述第一种和第二种cDNA种群来自表型不同的细胞或生物。
12.权利要求8的方法，其中，具有所述第一种5’-肽标记物的寡核苷酸引物对的核苷酸序列与具有所述第二种5’-肽标记物的寡核苷酸引物对的核苷酸序列是相同的。
13.监测基因表达的方法，所述方法包括(a)使来自一种细胞的mRNA与一种依赖RNA的DNA聚合酶以及一种5’-去磷酸化的靶特异性引物接触；(b)使在步骤(a)中合成的任何DNARNA杂种分子与一种核酸酶接触，以除去单链RNA突出；(c)在步骤(b)之后，将所述DNARNA杂种分子连接到一种部分双链的、磷酸化引物上；(d)用互补于在步骤(a)中使用的靶特异性引物的第一种引物、以及互补于在步骤(c)中使用的双链磷酸化引物的一条链的第二种引物，通过聚合酶链反应，标记在步骤(c)中连接的产物；所述第一种引物被第一种标记物所标记，所述第二种引物被可区别于所述第一种标记物的第二种标记物所标记；(e)使在步骤(d)中标记的聚合酶链反应的产物与在一固相支持体上固定化的、能够结合所述第一种标记物的一种或更多种分子接触；(f)洗涤该固相支持体；以及(g)使在步骤(f)中洗涤的该支持体与能够结合所述第二种标记物的一种或更多种分子接触。
14.权利要求13的方法，其中，所述核酸酶为绿豆核酸酶。
15.权利要求13的方法，其中，所述部分双链磷酸化引物是一种M13正向测序引物。
16.权利要求13的方法，其中，所述第一种标记物为一种肽标记物。
17.权利要求13的方法，其中，所述第二种标记物为生物素。
18.权利要求13的方法，其中，在步骤(e)中的所述一种或更多种分子中的至少一种是抗体。
19.权利要求13的方法，其中，在步骤(f)中的所述一种或更多种分子中的至少一种是连接了链霉亲和素的辣根过氧化物酶。
20.鉴别在第一个cDNA文库中有的而在许多其它的cDNA文库中没有的cDNA插入片段的方法，所述方法包括(a)用具有每个文库独特标记物的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应，标记来自每个cDNA文库的DNA插入片段；(b)将在步骤(a)中标记的DNA杂交；(c)使在步骤(b)中杂交的DNA与许多能够识别许多其它cDNA文库中的每个文库的独特标记物但不能识别所述第一个cDNA文库独特标记物的、固定化抗体接触；以及(d)回收不被所述许多固定化抗体结合的DNA。
21.权利要求20的方法，其中，来自许多其它cDNA文库中的每个文库的、杂交的DNA相对于所述第一个cDNA文库是过量的。
22.权利要求21的方法，其中，所述过量为2倍至100倍的过量。
23.权利要求21的方法，其中，所述过量为2.5倍至10倍的过量。
24.权利要求21的方法，其中，所述过量为3倍的过量。
25.权利要求20的方法，其中，所述每个文库的独特标记物为一种肽标记物。
26.权利要求25的方法，其中，所述肽标记物为3至12个氨基酸残基。
27.权利要求20的方法，其中，所述每个文库的独特标记物为一种耐热蛋白标记物。
28.权利要求20的方法，其中，将在步骤(c)中的、许多抗体中的每一种固定在一根独立的亲和柱上。
29.权利要求28的方法，其中，以任何次序将所述独立的亲和柱串联物理地连接。
30.权利要求29的方法，其中，将柱的流过物加样于所述独立的、物理连接的亲和柱一次或更多次。
31.权利要求29的方法，其中，将柱的流过物加样于所述独立的、物理连接的亲和柱三次。
32.权利要求20的方法，其中，使在步骤(d)中回收的DNA进一步地与一种对所述第一个cDNA文库独特标记物特异性的抗体接触。
33.权利要求32的方法，其中，回收由所述的对所述第一个cDNA文库独特标记物特异性的抗体留住的DNA，并将其克隆。
34.鉴别在第一个cDNA文库中和在第二个cDNA文库中有的而在许多其它的cDNA文库中没有的cDNA插入片段的方法，所述方法包括(a)用具有每个文库独特标记物的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应，标记来自每个cDNA文库的DNA；(b)将在步骤(a)中标记的DNA杂交；(c)使在步骤(b)中杂交的DNA与许多能够识别许多其它cDNA文库中的每个文库的独特标记物但不能识别所述第一个cDNA文库或第二个cDNA文库独特标记物的、固定化抗体接触；以及(d)回收不被所述许多固定化抗体结合的DNA。
35.权利要求34的方法，其中，来自所述许多其它cDNA文库中的每个文库的、杂交的DNA相对于所述第一个和第二个cDNA文库是过量的。
36.权利要求35的方法，其中，所述过量为2倍至100倍的过量。
37.权利要求35的方法，其中，所述过量为2.5倍至10倍的过量。
38.权利要求35的方法，其中，所述过量为3倍的过量。
39.权利要求34的方法，其中，所述每个文库的独特标记物为一种肽标记物。
40.权利要求39的方法，其中，所述肽标记物为3至12个氨基酸残基。
41.权利要求34的方法，其中，所述每个文库的独特标记物为一种耐热蛋白标记物。
42.权利要求34的方法，其中，将在步骤(c)中的、所述许多抗体中的每一种固定在一根独立的亲和柱上。
43.权利要求42的方法，其中，以任何次序将所述独立的亲和柱串联物理地连接。
44.权利要求43的方法，其中，将柱的流过物加样于所述独立的、物理连接的亲和柱一次或更多次。
45.权利要求43的方法，其中，将柱的流过物加样于所述独立的、物理连接的亲和柱三次。
46.权利要求34的方法，其中，使在步骤(d)中回收的DNA进一步地与一种对所述第一个cDNA文库独特标记物或第二个cDNA文库独特标记物特异性的抗体接触，以便浓缩对所述第一个cDNA文库和所述第二个cDNA文库特异性的cDNA片段。
47.权利要求46的方法，其中，回收浓缩的、对所述第一个cDNA文库和所述第二个cDNA文库特异性的cDNA片段，并将其克隆。
48.权利要求47的方法，其中，将浓缩的、对所述第一个cDNA文库和所述第二个cDNA文库特异性的cDNA片段分离。
49.权利要求48的方法，其中，通过变性、用单链结合蛋白包裹、以及与一种对所述第一个cDNA文库或所述第二个cDNA文库独特标记物特异性的抗体接触，来进行分离。
50.用于许多cDNA文库矩阵分析的方法，所述方法包括(a)用一种可辨别的标记物，标记来自所述许多cDNA文库中的每个文库的cDNA插入片段；(b)将在步骤(a)中标记的cDNA插入片段杂交；(c)使在步骤(b)中杂交的cDNA插入片段与能够结合一种可辨别标记物的一根亲和柱接触；以及(d)洗脱所述亲和柱。
51.权利要求50的方法，其中，所述可辨别的标记物为一种肽标记物，且标记步骤包括通过使用一种具有所述肽标记物的寡核苷酸引物对，从cDNA文库载体序列起动聚合酶链反应；所述肽标记物连接到所述引物对的5末端。
52.权利要求50的方法，其中，将来自每个文库的、标记的cDNA片段以相等的比例杂交。
53.权利要求50的方法，其中，所述能够结合一种可辨别标记物的亲和柱是一根抗体亲和柱。
54.权利要求53的方法，其中，用一pH梯度洗脱所述的抗体亲和柱。
55.权利要求50的方法，其中，将洗脱的DNA变性，以分离起源于两个不同文库的链。
56.权利要求55的方法，其中，通过(a)用单链结合蛋白包裹，以及(b)与一根能够结合一种可辨别标记物的亲和柱接触；来分离变性的链。
全文摘要
本发明总的来讲涉及标记、分类和筛选核酸种群的方法。更详细地说,本发明涉及一种用于分类和比较复杂核酸种群的方法,所述的复杂核酸种群例如cDNA文库。这些复杂的核酸种群可以来源于具有潜在临床重要性的表型变异的细胞类型或组织类型。通常将所述方法称为ValiGene
文档编号C12N15/10GK1342208SQ99814384
公开日2002年3月27日 申请日期1999年10月15日 优先权日1998年10月16日
发明者F·J－M·伊里斯, J·－L·普尔尼 申请人:瓦利根美国有限公司