变后代涂布其中一个平板后，再用纤维素 膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置， 平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌 落甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌，命名为LcS-Mef，保藏于MRS固体培养基（斜面）中。
[0128] (3)BN-NKPQQ-RWX-311 的活化培养
[0129] 将保存于豆芽汁糯米汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-311取一环，接种 至豆芽汁糯米汁液体培养基活化，培养温度35°C，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0130] (4)LcS-Meif的活化培养
[0131] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS_Met_取一环，接种至MRS液体培养基 37°C活化培养，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0132] (5)富含NK和PQQ的米发糕的发酵制备
[0133] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-311与LcS_Met_混合，使混合菌液中二者密度比为 1:5 (1X108CFM/mL: 5X108CFM/mL)，混合菌液以5 %接种量接种含糯米汁的发酵培养基， 37°C六层纱布封口培养36h，发酵后蒸煮锅沸水蒸煮10分钟，得到富含NK和PQQ的米发糕。 含糯米汁的发酵培养基中所含豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-311合成 NK和PQQ进行代谢调控，豆芽汁有利于纳豆芽孢杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由 酪氨酸和谷氨酸通过肽键连接环化而成。发酵结束后，米发糕中NK活力1300U/mL，PQQ含 量185ng/mL。所获得的米发糕富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌，具有米发糕固有的滋味和发酵 后特有的风味。
[0134] 本发明中采用色谱法测定PQQ，具体步骤参照"NojiN,NakamuraT，Kitahata N,etal.Simpleandsensitivemethodforpyrroloquinolinequinone(PQQ)analysis invariousfoodsusingliquidchromatography/electrospray-lonizationtandem massspectrometry.JAgriFoodChem，2007, 55 (18): 7258-7263.，'。
[0135] 本发明中采用琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定NK活力。测定步骤：将发酵物与等 量水混合碾磨均匀后过滤，滤液点种在琼脂糖-纤维蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶 作为标准品，通过测量透明圈直径计算纳豆激酶相当于尿激酶的活力单位（U/mL)。
【主权项】
1. 一种纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-311 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met_; 3) 、将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-311和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵糯米汁，发酵后 经蒸煮工艺后得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的米发糕。
2. 根据权利要求1所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁糯米汁固体培养基，其中一个 将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平 板B ;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板 后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡 咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断 产吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根 据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌 菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆 菌。
3. 根据权利要求2所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤1)中，所述的平板豆芽汁糯米汁固体培养基和斜面豆芽汁糯米汁固体培养基以IL计，由 以下量的组分组成： 糯米汁 100~150mL： 鹿糖 4.0?6.0g; 琼脂 1·5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根据权利要求1所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平 板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平 板，为平板D ;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个 平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落 而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营 养缺陷型干酪乳杆菌。
5. 根据权利要求4所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤2)中，所述的平板MRS固体培养基和斜面MRS固体培养基以IL计，由以下量的组分组 成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 丰宁檬酸氢二铵 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 〇.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根据权利要求1所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤3)中，在共发酵之前，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-311和干酪乳杆菌LcS-Met_分别 进行活化培养，纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-311在豆芽汁糯米汁液体培养基中进行活化 培养，培养温度为34?36°C，干酪乳杆菌MRS液体培养基中进行活化培养，培 养温度为36?38 °C。
7. 根据权利要求6所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤3)中，所述的豆芽汁糯米汁液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 糯米汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 l.OmL： 水 余量； 该MRS液体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根据权利要求1所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤3)中，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-311和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵糯米汁，具体 包括：将活化后的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-311和干酪乳杆菌LcS-Met_混合，形成混合 菌液，将混合菌液接种至含糯米汁的发酵培养基，纱布封口培养发酵后经蒸煮工艺后得到 富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的米发糕。
9. 根据权利要求8所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤3)中，所述的含糯米汁的发酵培养基以IL计，由以下量的组分组成： 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; 豆芽汁 IOOmL; 糯米汁 余量。
10. 根据权利要求1所述的纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，其特征在于，步 骤3)中，所述的糯米汁的制备包括：水中加糯米，浸泡2?12小时后，90°C?99°C碾磨成 浆汁。
【专利摘要】本发明公开了一种纳豆菌与乳酸菌共发酵制备米发糕的方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵糯米汁，发酵后经蒸煮后得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的米发糕。本发明得到的米发糕中，吡咯喹啉醌含量达到99-185ng/mL，纳豆激酶活力达到830-1300U/mL。
【IPC分类】C12R1-245, C12N15-01, C12R1-07, C12N15-03, A23L1-105
【公开号】CN104522513
【申请号】CN201410750983
【发明人】徐薇薇, 阮晖, 何李琳, 张哲滔, 莫凡
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日