动物饲料添加剂的制作方法
【专利说明】
[0001 ] 本案为针对CN201510095993.X号专利的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于动物饲料添加剂技术领域，具体涉及一种动物饲料添加剂。
【背景技术】
[0003] 在畜牧业养殖中，长期存在的问题是饲料的存放中的微菌毒素污染;动物食用被 污染的饲料后，造成养殖动物出现免疫抑制、下痢、母猪流产、仔猪假发情等问题。而面对这 一问题，由于饲料的种植生产中与所生长的气候环境等相关，无法从源头保证隔绝微菌的 污染；因此在这一情形下，多采用添加吸附剂这一物理吸附的方式来有效解决饲料污染的 问题。其中，物理吸附的方式多采用"微菌毒素吸附剂"对饲料中的微菌毒素进行吸附去除， 以降低微菌毒素在养殖中的上述毒害。
[0004] 常用的"微菌毒素吸附剂"有水和硅酸铝、活性炭等等。这些吸附脱霉剂能在液相 下与微菌毒素形成稳定的键合，进行吸附;但是上述的常用吸附剂，仅能对于部分的微菌毒 素具有吸附效果，比如:无机吸附剂对黄麴毒素(AFL)的吸附效果佳，但是却对其他霉菌毒 素卬通、？2、001了2等）的吸附效果非常低。这些吸附剂使用中吸附片面的原因在于，一方面 吸附效果优劣UI吸附材料的结构相关，譬如吸附空洞的大小、吸附结构本身的电荷分布方 式、有效吸附面积等等，无法保证与所有的微菌毒素相匹配;另一方面不同的吸附结构与不 同毒素具有不同的亲和性，而产生亲和性的差异影响因素有亲水性、疏水性、结构式与电荷 分布等等，因此手吸附自身这些性质的限制，也不可能全面地吸附所有的霉菌毒素。
[0005] 因此，现有的"微菌毒素吸附剂"在使用中对多种微菌毒素的吸附效果较为片面， 不能满足大量去除微菌污染的需求，同时在使用中这些微菌毒素会使养殖的动物产生免疫 抑制，而采用吸附剂在吸附之后也不能对动物食用污染饲料已经产生的免疫抑制有良好的 缓解和修复的功能。
【发明内容】
[0006] 本发明实施例的目的在于克服现有脱霉剂吸附效果片面且无法修复已经造成的 免疫抑制问题的上述不足，提供一种。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0008] -种饲料用抗菌肽脱霉剂的动物饲料添加剂，其中饲料用抗菌肽脱霉剂包括酵母 细胞壁和抗菌肽。
[0009] 采用本发明的动物饲料添加剂中采用的脱霉剂为本发明的上述饲料用抗菌肽脱 霉剂，其添加至饲料中之后，对饲料中微菌毒素的吸附亲和能力有提升，提升了脱霉的效 果;并且还可同时具有杀霉及修补多重功效。
【具体实施方式】
[0010] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0011] 本发明实施例提供一种饲料用抗菌肽脱霉剂，包括酵母细胞壁和抗菌肽；
[0012] 其中的酵母细胞壁本身成分主要是葡萄糖甘露聚糖的化学结构与同样属于有机 类的霉菌毒素的亲和性非常优良，能够形成较好的亲和吸附；相比无机的吸附剂，该种类型 的细胞壁吸附剂针对霉菌毒素所共有的表面有机结构进行，相对能弥补无机吸附剂的片面 缺点。同时，脱霉剂在酵母细胞壁吸附下混合抗菌肽，利用抗菌肽本身具有广谱抗菌活性的 特点，结合单纯的酵母细胞壁相对吸附广，在吸附的同时用抗菌肽进行增强杀菌，提升脱霉 剂的效果，并且抗菌肽在家畜使用后对已经产生的免疫抑制有修复作用;整体上本发明的 脱霉剂可同时具有杀霉、脱霉、吸附及修补多重功效。
[0013] 其中，在本发明的上述脱霉剂中，抗菌肽由于本身是生物内在免疫的效应分子，在 生物体内含量甚微，从天然资源中提取成本高、得率低、工序繁琐，从生物体内直接提取大 量抗菌肽的生产不满足本发明中大量饲料中添加的使用需求。因此，基于上述目的，本发明 还提出一种能够满足上述饲料用抗菌肽脱霉剂大量制备的方法，包括如下步骤：
[0014] S10,将含有目的抗菌肽的编码基因与载体重组，构建表达目的抗菌肽的重组表达 载体；
[0015] S20,将步骤SlO所获得的重组表达载体导入酵母细胞中，形成酵母工程菌；
[0016] S30，将步骤S20所获得的酵母工程菌进行发酵培养，获取发酵产物；
[0017] S40，将步骤S30发酵培养所获得的含有酵母细胞菌体和工程菌表达产物的发酵产 物进行自溶破壁、分离、纯化后即可获得同时含有酵母细胞菌体和目的抗菌肽的产物，即得 到本发明的上述脱霉剂。
[0018] 在上述整体制备的方法步骤的立意下，采用构建酵母工程菌进行发酵生产的方式 进行，发酵培养的过程中工程菌大量表达抗菌肽，因此在最终的发酵培养产物中同时具备 有酵母菌的细胞体和抗菌肽的表达产物;然后使产物中的酵母菌的细胞体自容破壁之后， 然后进行分离纯化收集酵母细胞壁和抗菌肽，即可大量获得脱霉剂产品。
[0019] 进一步在上述整体的方法立意下，本发明中进一步根据本身酵母细胞所能够进行 非融合表达的特性，其中步骤SlO中构建的工程菌中表达的目的基因为抗菌肽IsCT编码基 因；本身IsCT是一种天然的α-螺旋抗菌肽，来源于马达加斯加黑爪蝎（Opi sthacanthus madagascariensis)，是抗菌肽中最短的多肽，仅由13个氨基酸残基（ILGKIWEGIKSLF)组成， 没有半胱氨酸，对哺乳动物和细菌细胞都有活性。本发明中进行采用是基于这个原因设计 的 IsCT 衍生物中的[L6，Kll]-IsCT(ILGKILKGIKKLF)中与IsCT- 样，对 E. coli， P.aeruginosa, S. trphimurium，S. epidermidis，S.aureus有相同的抑菌活性，同时当[L6， Kll]-IsCT浓度达到100μΜ时的溶血活性仅为20%，能够具备在饲料中添加使用的能力。
[0020] 在上述情形下，本申请步骤SlO中针对采用的抗菌肽IsCT的表达，重组表达载体的 步骤可以包括如下：
[0021] Sll，根据酵母密码子的偏好性，设计上述IsCT表达的编码基因，该基因为具有序 列表SEQ. ID.No. 1的喊基序列的IsCT基因；
[0022] L/iN 丄 UDD 丄 ?????ο λ · * I ^ 〇/ ?
[0023] S12,采用质粒pYES2作为载体，并以pYES2a质粒的α信号肽为模板进行PCR扩增；
[0024]在该步骤中采用质粒pYES2作为载体，构建抗菌肽IsCT的重组表达载体；
[0025]其中在该步骤S12中，采用质粒pYES2,其目的在于在经过对酵母菌的非融合表达 特点和本身IsCT的氨基酸结构，经过反复的多种验证和考量之后最终采用质粒pYES2进行； 原因在于:首先，质粒PYES2本身具有酵母GALl启动子，其能够在酿酒酵母中用半乳糖高水 平的进行诱导，同时能被葡萄糖抑制;且质粒PYES的多克隆位点区域还具有CYCl终止子，能 够有效终止mRNA的转录表达，采用该质粒在表达能力较强的同时还更加易于控制;其次，质 粒PYES2本身的多克隆位点具有多种可用的酶切位点，便于重组操作;第三，质粒本身具有 URA3基因和氨苄抗性基因，分别可以用于筛选带有ura3基因型的酵母宿主菌株转化子，和 在大肠杆菌中进行载体筛选。在采用该质粒PYES2作为目的基因的表达载体之后，基于质粒 PYES2的采用，针对其pYES2a质粒的α信号肽为模板设计引物，其中pYES2a质粒(932-1207碱 基区段)的a信号肽的序列具有序列表SEQ. ID.No.2碱基序列；
[0026]以上述α信号肽为模板，分别设计的引物为具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列的 上游