一种具有缓解铅毒性功能的益生菌和植物提取物的膳食补充剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有缓解铅毒性功能的益生菌和植物提取物的膳食补充剂，属于食品技术领域。本发明是将该株菌以冷冻干燥获得的菌粉为主药，辅以植物提取物，添加适宜辅料后以粉末直接压片法制备片剂形式的益生菌和植物提取物的膳食补充剂，它含有活菌含量大于109CFU/g的植物乳杆菌CGMCC 5494。以该方法获得的膳食补充剂能够降低铅暴露小鼠体内铅含量；恢复铅暴露造成的氧化应激损伤；提高铅暴露小鼠体内氨基乙酰丙酸脱水酶的活性；降低铅暴露小鼠体内锌原卟啉含量；恢复铅暴露小鼠的智力损伤。具有广阔的市场前景。
【专利说明】
一种具有缓解铅毒性功能的益生菌和植物提取物的膳食补 充剂
技术领域
[0001] 本发明涉及一种具有缓解铅毒性功能的益生菌和植物提取物的膳食补充剂，属于 食品技术领域。
【背景技术】
[0002] 铅是一种带有蓝色的银白色重金属，在空气中易氧化，变暗。铅用途广泛，既可以 有效阻挡X射线和放射性射线，也是制造蓄电池的主要材料。此外，铅的化合物是很多颜料 的原料。铅污染指铅或铅的化合物对周围环境造成的污染，其浓度和化学形态与其危害程 度直接相关。铅富集性强的特点使其在环境中很难降解，不能通过环境自身的净化作用而 降低，超出正常范围，不仅会危害人体健康，还会导致环境质量恶化。环境中铅含量的增高 是铅污染的产生的主要原因。我国大气环境中的铅含量高达5500万吨。空气中的高铅含量 一方面是自然因素造成的，如火山爆发，森林火灾等等，另一方面则是由于工业污染和交通 废气污染。此外土壤铅污染的现象也十分严重。用污水灌溉土壤后，土壤含有的重金属超标 直接造成土壤重金属污染。这种土壤产出的谷物和蔬菜，重金属含量会大大超标。全国土壤 背景值基本统计量的结果表明，我国土壤铅含量最高可达1143yg/g，最低为0.68yg/g，平均 可达到26yg/g。食品，饮用水的铅污染大部分都是外来污染。含铅食品，饮用水经胃消化后， 成人吸收可达11%，而儿童吸收高达30%-75%。人饮用这种自来水后，铅积存于体内，直接 对健康造成伤害。
[0003] 铅能通过多种渠道进入人体，而体内的铅含量很少也会对人体造成损伤。即使治 疗后使体内的铅水平下降，但铅已经造成的损伤也是永久性的，不能够恢复原样。目前的研 究发现铅中毒对人体的毒害作用主要体现在以下几个方面:A，影响神经系统，主要表现为 对智力方面的损伤;B，损害血液系统，主要变现为贫血;C，影响泌尿系统，主要表现为对肾 小管的损伤;D，损害心血管系统，主要表现为心肌炎等疾病。
[0004] 市场上传统的两种治疗铅中毒的药物在有效排出体内的铅的同时，带来的副作用 也十分严重。EDTA类金属螯合剂依地酸二钠钙(CaNa2EDTA)，对粘膜、上呼吸道、眼睛、皮肤 均有刺激作用，并具有严重肾毒性，在驱铅的同时也排出了其他人体必需的微量元素 。DMSA 类竞争性解毒剂二巯基丁二酸(DMSA)，经肠道吸收进入人体后有可能引起如上中腹涨痛， 恶心等某些副作用。此外有严重肝功能损害者不能使用DMSA。
[0005] 因此努力探索更加安全，更加有效，同时又经济的方法缓解铅中毒是十分必要的。 特别是对于还处于成长期的儿童，螯合剂疗法会对儿童有很严重的毒副作用，安全有效的 疗法尤为重要。通过益生菌与营养素的联合作用，可以避免、或者降低螯合剂的使用剂量， 降低螯合剂的副作用，更适合于用药，更加有益于身体健康。
[0006] 乳酸菌是益生菌的一种，是人体内的必须菌群之一，广泛存在于人体肠道中。当前 国内外生物学家已证明，乳酸菌有多种重要生理功能，包括调节人体微生态平衡，抑制致病 菌，防治乳糖不耐症，抗肿瘤、调节自身免疫，干预氧化应激、降低胆固醇等。目前多项研究 证实乳酸菌在体外吸附重金属的效率极高，对机体氧化应激的缓解功效十分出色。茶多酚 是茶叶中多酚类物质的总称。目前多项研究证明茶多酚对重金属盐和生物碱中毒有抗解作 用，能极强的清除毒性最强的羟自由基，阻断脂质过氧化过程，提高人体内酶的活性。葡萄 籽提取物提取自葡萄籽，人体内不能合成，能有效清除脂质过氧化产物，也是自然界中发现 的抗氧化、清除自由基能力最强的物质，具有超强的延缓衰老和增强免疫力的作用。多项研 究证明葡萄籽提取物能有效预防治疗铅中毒。
[0007]营养健康理念的不断转变，有病治病，无病强身的乳酸菌微生态制剂产品越来越 受欢迎。然而在乳酸菌微生态制剂中，以液态乳酸菌益生菌制剂更为常见，而片剂形式的益 生菌膳食补充剂并不常见。因此开发出片剂形式的，具有缓解铅中毒效果的，同时还可以有 效清除对人体有害的自由基，延缓衰老的益生菌和植物提取物的膳食补充剂，是一种非常 健康的治疗方案，具有广阔的市场应用前景。
【发明内容】
[0008] 本发明是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的用途，是将该株菌 以冷冻干燥获得的菌粉为主药，辅以植物提取物，添加适宜辅料后制备片剂形式的益生菌 和植物提取物的膳食补充剂，它含有活菌含量大于l〇 9CFU/g的植物乳杆菌CGMCC 5494。该 菌株于2011年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 5494。 [0009]所涉及的植物乳杆菌CGMCC 5494具有以下生物学特性：
[0010] (1)菌体特征：革兰氏染色呈阳性，细胞呈短杆状，菌体约为0.5-1. Ομπι宽，2-4ym 长，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形；
[0011] (2)菌落特征:在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.3-2.0mm之间，圆形，乳白 色，半透明，表面湿润光滑，边缘整齐，不产生色素；
[0012] (3)生长特性:该菌株最低生长温度为20°C，最高生长温度为40°C，在温度30-37°C 下生长最佳，能耐受的最高和最低初始生长pH为9.0和2.5，最适生长初始pH为6.0;本发明 植物乳杆菌菌株的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，12h就达到稳定期。
[0013] 本发明提供的一种同时含有益生菌和植物提取物的膳食补充剂，是以冷冻干燥获 得的益生菌菌粉为主药，辅以植物提取物，添加适宜辅料后以粉末经压片法制备得到的;所 述益生菌为保藏编号为CGMCC 5494的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述益生菌菌粉的制备方法如下：将植物乳杆菌 CGMCC 5494活化后扩大培养、离心、洗涤，然后加入冻干保护剂重悬菌体，使菌体浓度达到 lOUCFU/mL以上，混匀后预冻，然后冷冻干燥。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥是以100-150g/L的海藻糖或者100-250g/L的脱脂乳溶液作为冻干保护剂。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥是以100g/L的海藻糖作为冻干保护 剂。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述冻干菌粉的制备包括以下步骤：
[0018] A.培养基的制备：使用以按培养基总质量计87.7 %的水将10 %酶水解脱脂乳、 0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨与0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8,得到培养基；
[0019] B.冷冻干燥保护剂的制备:使用水与保护剂原料混合制备，分别得到含有lOOg/L 海藻糖的保护剂，含有l〇〇g/L脱脂奶粉的保护剂，含有50g//L山梨醇的保护剂，含有150g/L 蔗糖的保护剂。本发明考虑到尽量简化益生菌和植物提取物的膳食补充剂的非功能组分， 没有对多种冻干保护剂的组合进行实验，仅对单一种类冷冻干燥保护剂的保护效果进行了 比较。
[0020] C.植物乳杆菌CGMCC 5494菌种按所述培养基的质量计以2-4%的接种量接种到在 温度110_120°C下灭菌8-12min后冷却的培养基中，然后在37°C下培养18h，用pH7.2磷酸盐 缓冲液清洗2-4次，用步骤B所述的冷冻干燥保护剂重悬使活菌浓度达10 nCFU/mL，让该悬浮 液在温度37°C下预培养60min，之后进行冷冻干燥得到所述的冻干菌粉。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述膳食补充剂，按重量份数计含有30-50 %的菌 粉，4-8 %的植物提取物，42-66 %的辅料。
[0022]在本发明的一种实施方式中，所述植物提取物是葡萄籽提取物;辅料是一种或多 种在片剂中通常使用的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂。
[0023]所述膳食补充剂，按重量份数计含有37.9-59.7 %的微晶纤维素，4-6 %的低取代 羟丙基纤维素，0.1-0.3%的微粉硅胶，2.5-5%的葡萄籽提取物，1.5-3%的茶多酚，30-50%的菌粉。
[0024]在本发明的一种实施方式中，所述压片法进行压片是经压片机以2.4t压力压片， 得到的片剂重量为250mg±15mg。
[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述膳食补充剂，按重量份数计含有48.9%的微晶 纤维素，5%的低取代羟丙基纤维素，0.1 %的微粉硅胶，3.6%的葡萄籽提取物，2.4%的茶 多酚，40%的菌粉。配方如下表1所示：
[0026] 表1益生菌和植物提取物的膳食补充剂组成及含量
[0028]在本发明的一种实施方式中，所述膳食补充剂中植物乳杆菌CGMCC 5494的活菌含 量达到109CFU/g以上。
[0029] 本发明的一种实施方式中所述的片剂形式的益生菌和植物提取物的膳食补充剂 制作方法如附图1所示。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] (1)首次制备得到的同时含有益生菌和植物提取物的膳食补充片剂；
[0032] (2)本发明的膳食补充剂活性成分含量高、货架期长；益生菌含量可达到8.3 X 109cfu/g，在4°C贮存6个月后活菌数仍大于105CFU/g;花青素含量达29.17mg/g，EGC、EC、 EGCG、ECG 的含量分别可达2 · 6 lmg/g、1 · 23mg/g、7 · 59mg/g、1 · 53mg/g，在 20 °C 贮存6个月后仍 有90%以上保留率；
[0033] (3)本发明的膳食补充剂能够降低小鼠体内肝脏、肾脏、脑等脏器的铅含量及血液 的铅含量，缓解小鼠体内因铅中毒导致的氧化应激损伤、氨基乙酰丙酸脱水酶活性降低、锌 原卟啉含量上升，缓解因铅中毒导致的智力降低，非常具有应用前景。
[0034]生物材料保藏
[0035] 一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，于2011年11月29日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 5494。
【附图说明】
[0036] 图1是益生菌和植物提取物的膳食补充剂制作方法流程；
[0037]图2是不同保护剂对冷冻干燥植物乳杆菌CGMCC 5494菌体活性的保护效果；
[0038]图3是不同浓度海藻糖对冷冻干燥植物乳杆菌CGMCC 5494菌体活性的保护效果； [0039]图4是不同浓度脱脂乳对冷冻干燥植物乳杆菌CGMCC 5494菌体活性的保护效果； [0040]图5是益生菌和植物提取物的膳食补充剂压片过程对植物乳杆菌CGMCC 5494冻干 菌粉存活率的影响；
[0041 ]图6是益生菌和植物提取物的膳食补充剂压片过程对植物乳杆菌CGMCC 5494冻干 菌粉活菌数的影响；
[0042]图7是益生菌和植物提取物的膳食补充剂中原花青素测定标准曲线；
[0043] 图8是表儿茶素 (EC)、表没食子儿茶素 (EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食 子儿茶素没食子酸酯(EGCG)标准物质的高效液相图谱；
[0044] 图9是益生菌和植物提取物的膳食补充剂的高效液相图谱；
[0045] 图10是小鼠脏器、血液铅含量变化；
[0046]图11是小鼠肝脏，肾脏，脑的超氧化物歧化酶(S0D)变化；
[0047]图12是小鼠肝脏，肾脏的过氧化氢酶(CAT)变化；
[0048]图13是小鼠肝脏，肾脏，脑的丙二醛(MDA)变化；
[0049] 图14是小鼠肝脏，肾脏，脑的还原型谷胱甘肽(GSH)变化；
[0050] 图15是小鼠血液中氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)变化；
[0051 ]图16是小鼠血液中锌原卟啉(ZPP)变化；
[0052] 图17是小鼠避暗实验指标潜伏期变化；
[0053] 图18是小鼠避暗实验指标错误次数变化。
【具体实施方式】
[0054] 实施例1:不同冷冻干燥保护剂在冷冻干燥过程中对植物乳杆菌存活率的影响 [0055]将植物乳杆菌CGMCC 5494在MRS液体培养基中活化两代后，按2 %接种量接入1L MRS液体培养基中，置于37°C下恒温扩大培养1811。4°(：下5000g离心15min，弃去上清收集菌 体，菌体用无菌磷酸盐缓冲液(？83,6〇111111 〇1/1，？!16.5)洗涤两次，收集菌体。上述实验重复5 次，收集5份菌体，分别加入25mL的无菌PBS溶液，150g/L蔗糖溶液，100g/L海藻糖溶液，50g/ L山梨醇溶液，100g/L脱脂奶粉溶液作为冷冻干燥保护剂混匀重悬。将含有保护剂的菌悬液 lmL分装在无菌西林瓶中。-80°C下预冻3h。之后进行冷冻干燥，时间为48h，真空度4Pa，冷阱 温度-50°C。以菌落平板计数法对冷冻干燥前后活菌含量检测，冷冻干燥前活菌数量记为 Mo;冷冻干燥后活菌数量记为M，得到存活率=M/M〇X 100%。结果如附图2所示：
[0056]通过图2可知，不同冷冻干燥保护剂的效果差异明显。10%的海藻糖，10%的脱脂 乳溶液效果较好，冷冻干燥后存活率约为40 %。而无菌F>BS溶液保护效果最差，几乎没有作 用。结果表明，在植物乳杆菌CGMCC 5494菌体冷冻干燥过程中，海藻糖、脱脂乳减少了菌体 细胞损伤。选择海藻糖，脱脂乳作为植物乳杆菌CGMCC 5494的冷冻干燥保护剂比较适宜。
[0057]本发明考虑到尽量简化益生菌和植物提取物的膳食补充剂的非功能组分，没有对 多种冻干保护剂的组合进行实验，仅对单一种类冷冻干燥保护剂的保护效果进行了比较。 [0058]实施例2:海藻糖浓度对植物乳杆菌CGMCC 5494菌体冻干活性的影响 [0059]配制海藻糖浓度为10(^/1、15(^/1、20(^/1、25(^/1的不同浓度梯度的保护剂溶 液，按照实施例1的流程进行植物乳杆菌CGMCC 5494的扩大培养、离心、洗涤与冷冻干燥，活 菌计数考察海藻糖的浓度对CGMCC 5494菌体冷冻干燥活性的影响。结果如附图3所示： [0060]通过图3可知，随着海藻糖浓度的提高，保护效果有明显提升。但实验发现，海藻糖 浓度大于150g/L时，冷冻干燥后的菌体粘度较大，无法研磨菌粉，这可能是海藻糖的吸水作 用造成的，由此控制海藻糖浓度为l〇〇g/L较合适。
[0061 ]实施例3:脱脂乳海藻糖浓度对植物乳杆菌CGMCC 5494菌体冻干活性的影响 [0062]配制脱脂乳浓度为10(^/1、15(^/1、20(^/1、25(^/1的不同浓度梯度的冷冻干燥保 护剂溶液，按照实施例1的流程进行植物乳杆菌CGMCC 5494的扩大培养、离心、洗涤与冷冻 干燥，活菌计数考察脱脂乳的浓度对植物乳杆菌CGMCC 5494菌体冷冻干燥活性的影响。结 果如附图4所不：
[0063] 通过图4可知，随着脱脂乳浓度的提高，保护效果有明显提升。但脱脂乳浓度超过 150g/L以后，浓度对保护效果的影响不显著，150g/L，200g/L，250g/L三个浓度脱脂乳的保 护效果几乎相同，无显著差异(P>〇.05)。以各个浓度脱脂乳溶液为保护剂冻干后，对菌体研 磨菌粉无影响。综合考虑冷冻干燥过程存活率、保护剂对菌粉研磨的影响程度以及压片过 程中可能出现的菌粉活性变化等情况，因此选择l〇〇g/L海藻糖溶液以及150g/L脱脂乳溶液 为保护剂制备植物乳杆菌CGMCC 5494冻干菌粉，进一步考察压片过程对益生菌和植物提取 物的膳食补充剂中菌体活性的变化。
[0064] 实施例4:压片压力对益生菌和植物提取物的膳食补充剂硬度的影响
[0065] 益生菌和植物提取物的膳食补充剂制备工艺见附图1。
[0066]按照膳食补充剂的设计配方和设定的工艺，以100g/L海藻糖及150g/L脱脂乳为冷 干保护剂制备的2种冻干植物乳杆菌CGMCC 5494菌粉为主要成分，与植物提取物、辅料以配 研法混匀。以压片机的三个压力档位1.212.紅，3.6七压力分别压片，重量均为25〇!1^± 15mg。将制作好的膳食补充剂以硬度仪检测硬度(普通片3-5kg)，并进行高空掉落实验(取 10片膳食补充剂置于2M高空处，使其自由下落，若膳食补充剂未出现明显裂痕或断裂碎裂， 则说明硬度合格，每片重复3次实验），结果如表2所示，
[0067]表2压片压力对益生菌和植物提取物的膳食补充剂硬度影响
[0069] 注:不同字母代表组别间具有显著性差异(P〈0.05)
[0070] 通过表2可知，以1.2t压力进行压片后，两种菌粉制作的膳食补充剂硬度仅分别为 2.31kg与2.40kg，未达到3-5kg标准。同时高空掉落实验出现了裂片现象，因此1.2t压力不 适于膳食补充剂的制备。而以3.6t压力进行压片后，两种菌粉制作的膳食补充剂硬度均已 超过6.10kg，并超出国家规定3-5kg标准。因此3.6t压力不适于膳食补充剂的制备。而以 2.4t压力进行压片后，两种菌粉制作的膳食补充剂硬度分别为4.20kg、4.29kg，符合要求， 同时高空掉落实验未出现裂片现象。因此，2.4t压力适于膳食补充剂的制备，选择2.4t压力 制备膳食补充剂。
[0071 ]实施例5:压片过程对膳食补充剂中植物乳杆菌CGMCC 5494菌体活性的影响 [0072]益生菌和植物提取物的膳食补充剂压片工艺见附图1。
[0073]按照益生菌和植物提取物的膳食补充剂的配方（表1)和设定的压片工艺，将以 l〇〇g/L海藻糖及150g/L脱脂乳为冷干保护剂制备的2种冻干植物乳杆菌CGMCC 5494菌粉为 主要成分，与植物提取物、辅料以配研法混匀，将混合粉料经压片机以2.4t压力压片，重量 为250mg±15mg。将混合粉料以平板菌落计数法检测活菌数量，记为Wo。压片结束后以平板 菌落计数法对膳食补充剂中的活菌数量进行检测，记为W。则存活率为：存活率= W/W〇X 100%。结果如图5、图6所示：
[0074]压片操作对不同植物乳杆菌CGMCC 5494菌粉的活性和存活率影响较大。通过图5， 图6可知，以150g/L，200g/L，250g/L脱脂乳为保护剂制作的菌粉为主药进行压片后，益生菌 损伤较大，益生菌和植物提取物的膳食补充剂中植物乳杆菌CGMCC 5494存活率均不到3%， 存活量均不足2X109cfu/g。以10%海藻糖为保护剂制作的菌粉为主药进行压片后，益生菌 和植物提取物的膳食补充剂中植物乳杆菌CGMCC 5494存活率可达到18%以上，存活量几乎 可达到8X109cfu/g。比较结果说明，相对于脱脂乳，海藻糖能够为植物乳杆菌CGMCC 5494 提供更有效的保护，减少CGMCC 5494在高压恶劣加工环境下的损伤，以海藻糖作为保护剂 的CGMCC 5494冻干菌粉，更适用于益生菌和植物提取物的膳食补充剂的生产。
[0075] 实施例6:压片过程对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中原花青素的影响
[0076] 原花青素是一种植物黄酮，一般是葡萄籽提取物或是法国海岸松树皮提取物。原 花青素是一种新型的高效抗氧化剂，是目前最强效的自由基清除剂之一。测定方法为铁盐 催化比色法，测定压片前混合粉料与压片后膳食补充剂中原花青素含量。具体如下：
[0077] 20%硫酸铁铵溶液的制备:称取10.(^硫酸铁铵，用2111〇1/1!1(：1溶解定容至50111匕
[0078] 反应混合液的制备:取正丁醇、浓盐酸、20 %硫酸铁铵按体积比85:5:0.4配制。 [0079]样品处理:准确称取140mg压片前混合粉料或压片后膳食补充剂于10ml棕色容量 瓶中，无水乙醇溶解、定容至刻度。超声波振荡提取lOmin，反复2-3次，摇匀。取上清液过 0·22μπι膜，即得到样品液。
[0080]空白样品的制备：直接取无水乙醇定容至刻度。超声波振荡提取lOmin，反复2-3 次，摇匀。取上清液过0.22μπι膜，即得到样品液。
[0081 ]标准曲线的绘制:准确称取原花青素标准品5mg于10ml棕色容量瓶中，用无水乙醇 溶解、定容至刻度，制得浓度为0.50mg/mL的标准液。取适量0.50mg/mL的标准液用无水乙醇 稀释，制成浓度为0、10、25、50、100、150、200、250、30(^8/1^的标准系列使用液。分别吸取各 浓度使用液1. OmL于10mL刻度试管中，加入9. OmL反应混合液，塞紧塞子，摇匀，置于沸水浴 中加热40min后，立即取出用冰水冷却4min-5min，取出，恢复至室温后，正丁醇定容至刻度 线，塞紧塞子，摇匀，在550nm处以试剂空白调零，绘制吸光值-原花青素浓度的标准曲线。标 准曲线见附图7。
[0082]原花青素含量的测定:取样品液1 .OmL于10mL刻度试管中，加入9.OmL反应混合液， 塞紧塞子，摇匀，置于沸水浴中加热40min后，立即取出用冰水冷却4min-5min，取出，恢复至 室温后，正丁醇定容至刻度线，塞紧塞子，摇匀，在550nm处以试剂空白调零，测定吸光度与 标准曲线对比，查出原花青素含量，结果如表3所示：
[0083]表3益生菌和植物提取物的膳食补充剂压片过程对原花青素的影响
[0085] 通过表3可知，压片前混合粉料通过铁盐催化比色法检出量可达29.17mg/g，压片 后膳食补充剂中检出量可达29.52mg/g。压片前后检出率可达101.20 %。说明压片过程对于 原花青素几乎没有影响。
[0086] 实施例7:压片过程对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中茶多酚的影响
[0087] 茶叶中多酚类物质的总称称为茶多酚。儿茶素类化合物是茶多酚的主体成分，主 要包括表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶 素没食子酸酯(EGCG)4种物质。用高效液相色谱法测定压片前混合粉料与压片后膳食补充 剂中EC，EGC，ECG，EGCG含量。具体如下：
[0088] 标准品的处理:混标制作精确称取EC，EGC，ECG，EGCG标准品各1 Omg置入1 OOmL容量 瓶，双蒸水定容至刻度得到混合标准品溶液。单标制作精确称取EC标准品1 Omg置入1 OOmL容 量瓶，双蒸水定容至刻度得到EC标准品溶液。按照此步骤再制作EGC，ECG，EGCG单标。
[0089]样品的处理:精确称取50mg压片前混合粉料或压片后膳食补充剂与2. OmL离心管 中，加入lmL 70°C预热过的50%甲醇溶液，混匀。立即移入70°C水浴中，浸提20min，每隔 5min搅拌一次。冷却至室温后以3500r/min离心10min，取上清液过0.22μηι膜，得到样品处理 液备用。
[0090] 安捷伦四元栗色谱仪，Agilent C18(4.6mmX250mm，5ym)色谱柱，色谱条件如下： [0091] 流动相A相:水(含0.05 %三氟乙酸）。
[0092]流动相B相：乙腈。
[0093]梯度条件：
[0094] ①开始90%A相，10%B相
[0095] ②20min 内 90 % A相，10 % B相-70 % A相，30 % B相
[0096] ③ 70%A 相，30%B 相保持 4min
[0097] ④ lmin 内 70 % A相，30 % B相-90 % A相，10 % B相
[0098] ⑤ 90%4相保持511^11
[0099] 进样量：5yL
[0100] 流速：lmL/min
[0101] 柱温：30 Γ
[0102]检测器:紫外检测器，检测波长:280nm
[0103] 测定单标，混标，以保留时间定性，峰面积定量，测定压片前混合粉料与压片后膳 食补充剂中EC，EGC，ECG，EGCG含量。标准物质图谱见图8，粉料与活菌片剂图谱示例见图9。 实验结果如表4所不：
[0104] 表4膳食补充剂压片过程对茶多酚主要成分的影响
[0106] 通过表4可知，压片前混合粉料EGC，EC，EGCG，ECG检出量分别为2.59mg/g，1.24mg/ g，7 · 68mg/g，1 · 53mg/g。压片后益生菌和植物提取物的膳食补充剂中EGC，EC，EGCG，ECG检出 量分别为2.61mg/g，1.23mg/g，7.59mg/g，1.53mg/g。压片前后检出率分别可达101.20%， 99.19%，98.28%，100.00%。说明压片过程对于茶多酚主要组分几乎没有影响。
[0107] 实施例8:贮存条件对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中植物乳杆菌活性的影 响
[0108] 将实施例5中（以10%海藻糖为保护剂)制作的益生菌和植物提取物的膳食补充剂 以铝箱袋真空热封包装，避光、避湿、避氧，置于4°C和20°C条件下贮存，测定贮存15天、30 天、90天、180天后的植物乳杆菌CGMCC 5494活菌数量，考察贮存温度和贮存时间对益生菌 和植物提取物的膳食补充剂活性的影响。以平板菌落计数法检测益生菌和植物提取物的膳 食补充剂在贮存初始时的活菌数，记为Co。贮存一定时间后，以平板菌落计数法测定益生菌 和植物提取物的膳食补充剂的活菌数，记为C，则贮存存活率为：贮存存活率= C/C〇X 100%。结果如表5,表6所不：
[0109] 表5膳食补充剂在4°C条件下贮存过程中植物乳杆菌CGMCC 5494活性变化
[0111]表6膳食补充剂在20°C条件下贮存过程中植物乳杆菌CGMCC 5494活性变化
[0113]通过表5，表6可知，相比于20 °C条件下贮存，4°C条件下贮存，益生菌和植物提取物 的膳食补充剂的活性下降比较缓慢。贮存1个月后植物乳杆菌CGMCC 5494活菌数仍大于 108CFU/g，|G存6个月后活菌数仍大于105CFU/g。而在20°C条件下益生菌和植物提取物的膳 食补充剂的活性下降更快，贮存1个月后植物乳杆菌CGMCC 5494活菌数仅有105CFU/g，贮存 6个月后活菌数仅剩余103CFU/g，说明低温储存更有利于保持益生菌和植物提取物的膳食 补充剂的活性和延长产品货架期。
[0114] 实施例9贮存时间，贮存温度对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中原花青素的 影响实验
[0115] 将实施例5中（以10%海藻糖为保护剂)制作的益生菌和植物提取物的膳食补充剂 以铝箱袋真空热封包装，避光、避湿、避氧，置于4 °C和20 °C条件下贮存。按照实施例5中的方 法，测定贮存15天、30天、90天、180天后的益生菌和植物提取物的膳食补充剂中原花青素含 量。考察贮存温度和贮存时间对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中原花青素的影响。结 果如表7所示：
[0116] 表7膳食补充剂在4°C、20°C条件下贮存过程中原花青素含量变化
[0118] 注:各组均没有显著性差异
[0119] 通过表7可知，贮存15天后各组间益生菌和植物提取物的膳食补充剂中原花青素 与贮存初始时相比有下降但差异不显著，但随着贮存时间的延长原花青素的含量没有显著 差异，说明原花青素在贮存15至180天过程中没有降解。说明铝箱袋真空热封的包装虽然能 够隔绝氧气，但包装过程中可能残留了些许氧气引起了原花青素的少许降解。但铝箱袋真 空热封的包装，避光，避湿，避氧的保存条件防止了原花青素的继续降解，说明铝箱袋真空 热封的包装，避光、避湿、避氧的保存条件有利于保护益生菌和植物提取物的膳食补充剂中 的抗氧化物质，延长了产品货架期。
[0120] 实施例10:贮存条件对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中茶多酚的影响
[0121] 将实施例5中（以10%海藻糖为保护剂)制作的益生菌和植物提取物的膳食补充剂 以铝箱袋真空热封包装，避光、避湿、避氧，置于4 °C和20 °C条件下贮存。按照实施例6中的方 法，测定贮存15天、30天、90天、180天后的益生菌和植物提取物的膳食补充剂中茶多酚含 量。考察贮存温度和贮存时间对益生菌和植物提取物的膳食补充剂中茶多酚的影响。结果 如表8,表9,表10,表11所不：
[0122] 表8膳食补充剂在4°C、20°C条件下贮存过程中表没食子儿茶素含量变化
[0124] 注:不同字母代表组别间具有显著性差异(P〈0.05)
[0125] 表9膳食补充剂在4°C、20°C条件下贮存过程中表儿茶素(EC)含量变化
[0127] 注:各组均没有显著性差异
[0128] 表10膳食补充剂在4°C、20°C条件下贮存过程中表没食子儿茶素没食子酸酯含量 变化
[0130] 注:不同字母代表组别间具有显著性差异(P〈0.05)
[0131] 表11膳食补充剂在4°C、20°C条件下贮存过程中表儿茶素没食子酸酯(ECG)含量变 化
[0133] 注:不同字母代表组别间具有显著性差异(P〈0.05)
[0134] 通过表8,表9,表10,表11可知，贮存15天后各组间益生菌和植物提取物的膳食补 充剂中EGC、ECG和EGCG的含量与贮存初始时相比有显著下降，EC与贮存初始时相比有下降 但差异不显著，但随着贮存时间的延长EC，EGC，ECG，EGCG的含量没有显著差异，说明EC， EGC，ECG，EGCG在贮存15至180天过程中没有降解。说明铝箱袋真空热封的包装虽然能够隔 绝氧气，但包装过程中可能残留了些许氧气引起了 EC，EGC，ECG，EGCG的少许降解。但铝箱袋 真空热封的包装，避光，避湿，避氧的保存条件防止了 EC，EGC，ECG，EGCG的继续降解，说明铝 箱袋真空热封的包装，避光、避湿、避氧的保存条件有利于保护益生菌和植物提取物的膳食 补充剂中的茶多酚主要成分，延长了产品货架期。
[0135] 实施例11:膳食补充剂对铅暴露小鼠体内铅含量的干预降低作用
[0136] 取体重20-25g的健康雄性C57BL/6小鼠40只，随机分为4组:空白对照组、铅暴露模 型组、益生菌和植物提取物的膳食补充剂干预组、DMSA组，每组10只小鼠。实验为期61天，空 白对照组前56天每天灌胃0.3mL无菌PBS溶液，最后五天不灌胃，给予正常饮水。铅暴露模型 组前56天每天灌胃0.3mL无菌PBS溶液，给予含铅饮水(将醋酸铅溶解于饮用水中，使其浓度 为lg Pb/L，供小鼠自由饮用），最后五天不灌胃，给予正常饮水。益生菌和植物提取物的膳 食补充剂干预组前56天每天灌胃0.3mL益生菌和植物提取物的膳食补充剂溶液(取实施例5 中以10%海藻糖为保护剂制备的一片益生菌和植物提取物的膳食补充剂溶解于0.6mL无菌 PBS溶液中），给予含铅饮水，最后五天不灌胃，给予正常饮水。DMSA组前56天每天灌胃0.3mL 无菌PBS溶液，给予含铅饮水，最后5天每天灌胃0.3mL 5mg/mL的DMSA溶液，给予正常饮水。 实验结束后处死小鼠，取血液，肝脏，肾脏，脑。精密称取血液，肝、肾，脑重量，加入纯硝酸后 放入微波消解炉中消解，时间为20min。得到的消解液采用原子吸收分光光度法测定铅含 量。结果如附图10所示：
[0137] 通过图10可知，对比空白对照组，铅暴露模型组、益生菌和植物提取物的膳食补充 剂干预组、DMSA(传统重金属解毒剂)组的肝脏，肾脏，脑，血液铅含量可知，益生菌和植物提 取物的膳食补充剂，DMSA均能够显著降低小鼠肝脏，肾脏，脑，血液中铅含量。说明益生菌和 植物提取物的膳食补充剂具有降低小鼠体内铅含量的作用。
[0138] 实施例12:膳食补充剂缓解铅暴露小鼠氧化损伤干预
[0139] 按实施例11所述的分组进行动物实验，实验结束后处死小鼠，取血液，肝脏，肾脏， 脑。按照南京建成生物工程研究所试剂盒的方法测定超氧化物歧化酶（SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、还原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的含量或水平。 测试结果如附图11，附图12,附图13,附图14所示：
[0140] 超氧化物歧化酶(S0D)，过氧化氢酶(CAT)是机体内重要的抗氧化酶，也是氧化应 激损伤标志物之一。还原型谷胱甘肽(GSH)是生物体内的一种重要的抗氧化物质。丙二醛 (MDA)是一种脂质过氧化物，其含量可以反映机体的脂质过氧化程度与细胞损伤程度。通过 图11，图12,图13,图14可知，相比于空白对照组，铅暴露模型组的S0D，CAT的活性显著降低， GSH含量显著下降，MDA含量显著上升。而对比铅暴露模型组，益生菌和植物提取物的膳食补 充剂干预组显著恢复了肝脏，肾脏，脑组织中铅暴露引起的S0D活性降低，显著恢复了肝脏， 肾脏组织中CAT的活性降低，显著提高了肝脏，肾脏，脑组织中的GSH含量，降低了 MDA含量。 二巯丁二酸(DMSA)是一类传统重金属竞争性解毒剂，对比DMSA组发现，益生菌和植物提取 物的膳食补充剂在缓解铅暴露导致的氧化应激损伤方面效果比DMSA更强。综合上述结果， 说明益生菌和植物提取物的膳食补充剂有效的缓解了铅暴露导致的氧化应激损伤。
[0141] 实施例13:膳食补充剂缓解铅暴露小鼠体内氨基乙酰丙酸脱水酶活性降低实验
[0142] 按实施例11所述的分组进行动物实验，实验结束后处死小鼠，取血液，4°C静置2h 后3000r/min离心10min，取上层血清。按照上海川翔生物科技有限公司试剂盒的方法测定 氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)活性，测试结果如附图15所示：
[0143] 氨基乙酰丙酸脱水酶直接参与机体血红素的生物合成，与机体造血系统直接相 关。通过图15可知，相比空白对照组，铅暴露模型组ALAD的活性显著降低。而益生菌和植物 提取物的膳食补充剂干预组显著恢复了 ALAD的活性，效果与传统重金属解毒剂DMSA相当。 说明益生菌和植物提取物的膳食补充剂有效的缓解了铅暴露导致的氨基乙酰丙酸脱水酶 (ALAD)的活性损伤。
[0144] 实施例14:膳食补充剂缓解铅暴露小鼠体内锌原卟啉含量上升实验
[0145] 按实施例11所述的分组进行动物实验，实验结束后处死小鼠，取血液，4°C静置2h 后3000r/min离心10min，取上层血清。按照上海川翔生物科技有限公司试剂盒的方法测定 锌原卟啉(ZPP)含量，测试结果如表20所示：
[0146] 血液中锌原卟啉(ZPP)的含量是铅中毒的指标之一。通过表20可知，相比空白对照 组，铅暴露模型组ZPP含量显著上升。而益生菌和植物提取物的膳食补充剂干预组显著降低 了ZPP含量，效果与传统重金属解毒剂DMSA相当。说明益生菌和植物提取物的膳食补充剂有 效的缓解了铅暴露导致的锌原卟啉(ZPP)的含量上升，缓解了铅中毒。
[0147] 实施例15:膳食补充剂缓解铅暴露小鼠智力损伤实验
[0148] 避暗实验利用了小鼠趋暗习性，避暗装置分为光室和暗室。光室照明为25W，暗室 不设置光照，光室暗室之间有3cm通道连接，可随意开启关闭。光室，暗室底部铺满铜栅，暗 室底部铜栅可通电，电压为24V。小鼠进入暗室即遭电击。实验分成训练，正式实验两部分。 训练使小鼠拥有电击记忆，结束24h后进行正式实验，正式实验观测小鼠潜伏期（小鼠第一 次完全进入暗室的时间），进入暗室的错误次数，考察小鼠的学习记忆能力。具体方法如下： 按实施例11所述的分组进行动物实验，在灌胃结束后进行小鼠避暗实验。避暗实验第一天 上午10:00开始训练。训练时间为3min，开始后所有小鼠背对通道，单独放置于明室之中，身 体不正对暗门，光室暗室之间通道关闭。适应lmin后开启光室暗室之间通道，同时开始计 时。小鼠进入暗室后受到电击后立即取出。第二天上午10:00开始正式实验，正式实验时间 为5min，暗室不加电流。实验开始后所有小鼠背对通道，单独放置于明室之中，身体不正对 暗门，光室暗室之间通道关闭。适应lmin后开启光室暗室之间通道，同时开始计时。记录 5min内小鼠潜伏期及进入暗室的错误次数。实验结果如附图17,附图18所示：
[0149] 通过图17,图18可知，相比空白对照组，铅暴露模型组潜伏期明显缩短，错误次数 明显上升。小鼠的学习记忆能力受到了损伤。而益生菌和植物提取物的膳食补充剂干预组 显著恢复了潜伏期缩短，错误次数上升的智力损伤，效果比传统重金属解毒剂DMSA更强。说 明益生菌和植物提取物的膳食补充剂有效的恢复了小鼠的学习记忆能力。
[0150] 实施例16:按以下配比制备同时含有益生菌和植物提取物的膳食补充剂
[0151] (1)以10 %的海藻糖作为冻干保护剂重悬扩培并洗涤后的植物乳杆菌CGMCC 5494，使活菌浓度达10nCFU/mL以上，在温度37 °C下预培养60min后进行冷冻干燥得到冻干 菌粉。
[0152] (2)按重量份数计，将37.9%的微晶纤维素，4%的低取代羟丙基纤维素，0.1%的 微粉硅胶，5 %葡萄籽提取物，3 %的茶多酚，50 %的菌粉，混合，用配研法混匀，得到粉料成 品。
[0153] (3)将上一步得到的粉料直接用压片机以2.4t压力压片，得到的片剂重量为250mg ±15mg 〇
[0154] 按本方法得到的膳食补充剂活性成分含量高、货架期长;益生菌含量可达到8.3 X 109cfu/g，在4°C贮存6个月后活菌数仍大于106CFU/g;花青素含量达29.17mg/g，EGC、EC、 EGCG、ECG 的含量分别可达2 · 6 lmg/g、1 · 23mg/g、7 · 59mg/g、1 · 53mg/g，在 20 °C 贮存6个月后仍 有90%以上保留率；同时能够降低小鼠体内肝脏、肾脏、脑等脏器的铅含量及血液的铅含 量，缓解小鼠体内因铅中毒导致的氧化应激损伤、氨基乙酰丙酸脱水酶活性降低、锌原卟啉 含量上升，缓解因铅中毒导致的智力降低。
[0155] 实施例17按以下配比制备同时含有益生菌和植物提取物的膳食补充剂
[0156] (1)以10 %的海藻糖作为冻干保护剂重悬扩培并洗涤后的植物乳杆菌CGMCC 5494，使活菌浓度达10nCFU/mL以上，在温度37 °C下预培养60min后进行冷冻干燥得到冻干 菌粉。
[0157] (2)按重量份数计，将59.7%的微晶纤维素，6%的低取代羟丙基纤维素，0.3%的 微粉硅胶，2.5%葡萄籽提取物，1.5%的茶多酚，30%的菌粉），混合，用配研法混匀，得到粉 料成品。
[0158] (3)将上一步得到的粉料直接用压片机以2.4t压力压片，得到的片剂重量为250mg ±15mg 〇
[0159] 按本方法得到的膳食补充剂活性成分含量高、货架期长;益生菌含量可达到8.3 X 109cfu/g，在4°C贮存6个月后活菌数仍大于106CFU/g;花青素含量达29.17mg/g，EGC、EC、 EGCG、ECG 的含量分别可达2 · 6 lmg/g、1 · 23mg/g、7 · 59mg/g、1 · 53mg/g，在 20 °C 贮存6个月后仍 有90%以上保留率；同时能够降低小鼠体内肝脏、肾脏、脑等脏器的铅含量及血液的铅含 量，缓解小鼠体内因铅中毒导致的氧化应激损伤、氨基乙酰丙酸脱水酶活性降低、锌原卟啉 含量上升，缓解因铅中毒导致的智力降低。
[0160]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种同时含有益生菌和植物提取物的膳食补充剂，其特征在于，所述膳食补充剂是 以冷冻干燥获得的益生菌菌粉为主药，辅以植物提取物，添加适宜辅料后以粉末经压片法 制备得到的；所述益生菌为保藏编号为CGMCC 5494的植物乳杆菌（Lactobaci Ilus plantarum)，已于2011年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心。2. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，其特征在于，所述膳食补充剂，按重量份数计含 有30-50 %的菌粉，4-8 %的植物提取物，42-66 %的辅料。3. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，其特征在于，所述植物提取物是葡萄籽提取物； 辅料是一种或多种在片剂中通常使用的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂。4. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，其特征在于，所述膳食补充剂，按重量份数计含 有37.9-59.7 %的微晶纤维素，4-6 %的低取代羟丙基纤维素，0.1-0.3 %的微粉硅胶，2.5-5 %的葡萄籽提取物，1.5-3 %的茶多酚，30-50 %的菌粉。5. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，其特征在于，所述冷冻干燥是以100_150g/L的海 藻糖或者100-250g/L的脱脂乳溶液作为冻干保护剂。6. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，其特征在于，所述冷冻干燥是以100g/L的海藻糖 作为冻干保护剂。7. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，所述膳食补充剂中植物乳杆菌CGMCC 5494的活 菌含量达到IO9CFlVg以上。8. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，所述益生菌菌粉的制备方法如下:将植物乳杆菌 CGMCC 5494活化后扩大培养、离心、洗涤，然后加入冻干保护剂重悬菌体，使菌体浓度达到 IoiiCFUAiL以上，混匀后预冻，然后冷冻干燥。9. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，所述压片法进行压片是经压片机以2.4t压力压 片，得到的片剂重量为250mg ± 15mg。10. 根据权利要求1所述的膳食补充剂，所述膳食补充剂，按重量份数计含有48.9 %的 微晶纤维素，5%的低取代羟丙基纤维素，0.1%的微粉硅胶，3.6%的葡萄籽提取物，2.4% 的茶多酚，40%的菌粉。
【文档编号】A23L33/135GK105901741SQ201610168450
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月23日
【发明人】翟齐啸, 陈卫, 田丰伟, 刘洋, 赵建新, 王刚, 张秋香, 刘小鸣, 张灏
【申请人】江南大学