专利名称：人白细胞介素－2用于与抗结核药联合用作药物的新适应症的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人自然白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)与抗结核药联合，用于治疗免疫低下状态中的结核病人的药物的新用途。最重要的是，提出对免疫低下结核病人，低剂量的重组人自然IL-2与传统的抗结核药物联用即可达到甚至优于大剂量抗结核药物的疗效。
IL-2是由T细胞在受抗原刺激后分泌的一种15kD糖蛋白，它对维持机体的正常免疫反应是必需的。IL-2又称T细胞生长因子。虽然只有T细胞分泌IL-2，但它可以剌激所有的类淋巴细胞，通过与细胞表面的特异性IL-2受体的结合，发挥促使细胞增殖和分化的功能。NK细胞可以组成性地表达这些受体，而大多数T和B细胞的IL-2受体的表达则依赖于抗原刺激。IL-2不论对细胞免疫和体液免疫，还是原始和再次免疫反应都是极为重要的。
成熟的人IL-2由133个氨基酸组成，第58和105位的半胱氨酸间形成二硫键，此二硫键为维持IL-2的生物学活性所必需；在美国药物市场上，美国FDA批准的是人IL-2突变体(IL-2/125S)。由于IL-2突变体虽较稳定，但终非人体内原有的天然分子，制剂注入人体后易于产生抗体，使药物失效。在本发明中，人IL-2是由正常人淋巴细胞中克隆而来，具有天然分子的生物学功能，称为重组人自然IL-2与美国投放市场的IL-2/125S不同，因此具有物质新颖性。
在结核杆菌感染机体的免疫反应过程中，T淋巴细胞具有重要作用。结核病患者细胞因子基因表达情况研究结果表明，Th1细胞因子(IL-2和IFNγ＞mRNA的表达明显降低；结核病患者血清中，sIL-2R的浓度升高。在抗结核药物治疗后，血清中sIL-2R的水平恢复正常。
曾有学者探讨过IL-2/125S对抗结核免疫的重要性，他们用小剂量IL-2/125S结合常规多种抗结核药物(MDT)治疗20例肺结核患者，后者包括3种情况1，新诊断的结核病患者，刚开始进行MDT；2，已进行45天MDT的结核病患者，并有治疗反应；3，抗药的结核病患者，已进行MDT至少7个月，但临床无明显改善。IL-2/125S的剂量为12.5微克，每日2次，皮下注射，疗程30天。结果表明，在IL-2/125S和MDT联合治疗30天后全部病人的临床症状改善。所有第一组病人以及第3组7例中有5例的痰液菌检阴转。由此认为，IL-2/125S结合MDT治疗方案是安全的，可以促进抗结核细胞免疫反应。本研究的治疗对象为免疫功能低下的结核病人，与国外报道的不同而具有用途的新颖性。
发明人使用重组人自然IL-2(商品名远策欣，北京远策药业有限公司生产)进行了治疗实验性小鼠结核的研究。结果表明，单纯自然重组IL-2组未见疗效，但与小剂量抗结核药异烟肼与重组人自然1L-2并用，与单纯异烟肼组比较，可显著提高免疫低下小鼠结核的疗效。具体的两批试验情况描述如下。
一，试验的目的观察重组人自然白介素-2单独应用和与异烟脐并用。对正常和免疫低下小鼠结核的治疗作用。
二，受试药物1.重组人自然IL-2由中国预防医学科学院生物技术新药研究中心提供，粉针，每支10万单位，临用前以注射用水溶解和稀释。
2.异烟肼纯药粉北京第二制药厂产品，用蒸馏水溶解。
3.强的松(醋酸泼尼松片)为浙江仙居制药股份有限公司产品(批号970711)，用5％CMC制成混悬液。
4.盐酸左旋咪唑为湖南洞庭制药厂生产的片剂(批号970710)，用5％CMC制成混悬液。
三，试验动物用昆明种小鼠，体重17-19g，雌雄各半，均匀分组，每组20只。北京结核病胸部肿瘤研究所动物房合格证号部发，医动字第01-2043号。
四，试验方法选择选择体内的动物实验性结核病治疗试验。实验一为正常小鼠，实验二为免疫低下小鼠。
五，试验主要方法和步骤(一)实验一(小鼠实验性结核的治疗实验)1.感染取在改良罗氏培养基上生长两周的人型结核分支杆菌H37Rv培养物，用玛瑙乳钵磨成5mg/ml的均匀菌悬液(含0.05％吐温80的灭菌生理盐水溶液)，每只小鼠尾静脉内注射0.2ml(每只小鼠感染菌量为1mg)。
2.给药方法于感染后次日开始，每日给药一次，重组人自然IL-2皮下注射给药，异烟肼灌胃给药，按每只小鼠给药剂量计算，给药体积均为0.3ml。直至空白对照组(给相同体积的水)半数死亡为止3.观察指标和时间及时记录各组动物死亡数，观察8周求得各组的半数动物存活时间(ST50)和8周的存活率，用新药数据处理软件NDST程序进行统计学处理。
4.试验对照除空白对照外，选择异烟肼为已知阳性对照药，并与其并用，进行比较。
5.试验结果各组半数动物存活时间和8周的存活率如表1。
表1各组半数动物存活时间(ST50，天)及8周的存活率组别药物 剂量 途径 ST50(天) p 存活率(％)1 IL-2 0.65万IUIH 10- 02 IL-2 1.30万IUIH 10- 03 IL-2 2.60万IUIH 10- 04 INH0.01mg 灌胃 19＋# 155 INH0.01mg 灌胃 ＞56 * 956 INH0.01mg 灌胃 ＞56 * 957 IL－2＋INH 1.30万IU＋0.01mg IH/灌胃 23+- 258 IL－2＋INH 1.30万IU＋0.02mg IH/灌胃 ＞56 * 859 IL－2＋INH 1.30万IU＋0.04mg IH/灌胃 ＞56 * 9510 水 0.3ml＋0.3ml IH/灌胃 11# 0注-代表p＞0.05+代表P＜0.05*代表P＜0.01#代表参比组实验一结果表明(正常小鼠，大剂量结核菌)1.在本实验条件下未见重组人自然白介素-2对小鼠结核呈显著性治疗作用。
2.异烟肼0.01mg并用重组人自然IL-2 1.30万IU比单异烟肼0.01mg延长了小鼠半数动物存活时间和提高了第8周的存活率，但未呈显著性差别(p＞0.05)本实验动物结核模型是用较大菌量感染，呈急性病变过程。作用于菌体的抗结核化疗药均呈显著性防治作用。但对于免疫增强剂不易呈抗结核活性。对于免疫调节药物可考虑用其它模型和方法进行抗结核实验。
(二)实验二(免疫低下小鼠，小剂量结核菌)
1.感染取在改良罗氏培养基上生长两周的人型结核分支杆菌H37Rv培养物，用玛瑙乳钵磨成3.5mg/ml的均匀菌悬液(含0.05％吐温80的灭菌生理盐水溶液)，每只小鼠尾静脉内注射0.2ml(每只小鼠感染菌量为0.7mg)。
2.给药方法免疫抑制剂(强的松)、免疫调节剂(重组人自然IL-2)和化疗药(异烟肼)同时给药，同时停药。于感染后次日开始。每日给药一次，各实验组均给予相同剂量的强的松(0.25mg/只)。重组人自然IL-2皮下注射给药，异烟肼、强的松和左旋咪唑灌胃给药，按每只小鼠的给药剂量计算。皮下注射的体积为0.3ml，灌胃的总体积为0.5ml。共给药20天。
3.观察指标和时间及时记录各小鼠死亡时间，感染后8周(56天)结束实验，以动物存活率为指标。用新药数据处理软件NDST程序进行统计学处理。
4.试验对照除空白对照外，选择异烟肼为已知阳性对照药，并与其并用，进行比较。免疫调节剂阳性对照药为左旋咪唑。
5.试验结果各组动物第56天的存活率如表2。
表2各组半数动物存活率组别药物剂量途径 存活率(％) p1 IL-2 2.6万IU IH0-2 IL-2 5.2万IU IH0-3 INH0.005mg 灌胃 5+#4 INH0.01mg 灌胃 40 *5 INH0.02mg 灌胃 80 *6IL－2＋INH5.2万IU＋0.005mg IH/灌胃 40 ++7IL－2＋INH2.6万IU＋0.005mg IH/灌胃 40 ++8IL－2＋INH2.6万IU＋0.01mgIH/灌胃 60 *9IL－2＋INH2.6万IU＋0.02mgIH/灌胃 90 * 11 水0.3ml 0.5mlIH/灌胃 5# 注1.-表p＞0.05；＋代表P＜0.05；*代表P＜0.01；#代表参比组2.第1至第12组均同时给予强的松。3.除第12组外均感染。4.第13组不给任何药物实验二结果表明1.在本实验条件下单纯重组人自然IL-2给药组与空白对照组(不给治疗药)比较，对免疫低下结核小鼠的存活率有所提高，但未呈显著性差别(p＞0.05)。
2.单纯异烟肼小剂量(0.005mg/只)未提高免疫低下结核小鼠的存活率，但该小剂量异烟肼与重组人自然IL-2并用则显著提高小鼠的存活率(重组人自然IL-2提高了异烟肼的疗效)(p＜0.05)。
3.中剂量和大剂量异烟肼与重组人自然IL-2并用后。与单纯异烟肼比较，对结核小鼠的存活率均有所提高。但未呈显著性差别(p＞0.05)。
4.阳性对照药左旋咪唑显著提高免疫低下结核小鼠的存活率(p＜0.05)六.试验结论1.单纯重组人自然IL-2未呈现明显的抗结核化疗药效果。
2.小剂量异烟肼与重组人自然IL-2并用，与单纯异烟肼比较。显著提高对免疫低下的小鼠结核的疗效。
权利要求
1.自然重组人白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)与抗结核药联合，用于针对免疫低下状态的结核病人的药物的新用途。
全文摘要
本发明涉及重组人自然白细胞介素－2(inter,leukin－2,IL－2)与抗结核药联合,用于治疗免疫低下状态中的结核病人的药物的新用途。提出对免疫低下结核病人,低剂量重组人自然IL－2与抗结核药物联用即可达到甚至优于大剂量抗结核药物的疗效。
文档编号A61P31/00GK1326783SQ0010936
公开日2001年12月19日 申请日期2000年6月2日 优先权日2000年6月2日
发明者侯云德, 张丽兰 申请人:侯云德, 北京东康龙病毒生物技术工程研究中心