无/低副作用的抗结核病药物复方的制作方法

无/低副作用的抗结核病药物复方的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种无/低副作用的抗结核病的药物组合物，其中包含药学有效量的选自异烟碱酰胺、立复霉素、丙基硫异烟酰胺和乙酰胺醇中的一种或多种，以及药学有效量的可降低抗结核病药物副作用的物质。
【专利说明】
无/低副作用的抗结核病药物复方
技术领域
[0001] 本发明涉及一种无/低副作用的抗结核病药物复方。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织(WHO)估计，全球大约有三分之一的人口感染肺结核，每年约有 八百万新增病例；而台湾新登记的肺结核病患人数最近几年也不停爬升，每十万人口有六 十多人感染肺结核，但其中只有大约四分之三的人接受完整治疗;根据卫生署的统计，台湾 每天至少有4.2个人死于肺结核;在这么多接受肺结核药物治疗的病患中，临床上最常见的 药物副作用即为肝毒性和神经系统病变(如：听神经和视神经病变），其中又以肝毒性最为 常见。再加上台湾又是B型及C型肝炎的盛行区，感染肺结核的肝炎患者也不在少数，假设每 年有14，000名新增的肺结核病患，粗略估计至少有2，000名到3，000名慢性肝病患者需接受 抗结核药物治疗，因此在这些病患身上所可能发生的肝毒性是吾人不可忽视的医源性疾 病。
[0003] 多数的第一线抗结核药物，例如:异烟碱酰胺(isoniazid，俗称敌痨克星）、丙基硫 异烟酰胺(pyrazinamide，俗称敌痨新迈)及立复霉素(rifampin)等都有导致肝毒性发生的 潜在不良反应;其中异烟碱酰胺(isoniazid)是目前最有效的单一抗结核药物，也最容易引 起服用者产生肝毒性;在60年代末期陆续有异烟碱酰胺（isoniazid)造成肝毒性的报告;异 烟碱酰胺(isoniazid)所造成具有临床症状的肝毒性约0.1-1 %，而在10-20%的病患中，则 可观察到无症状的肝功能异常，这些肝功能异常通常于服药后两个月内发生。
[0004] 如图1所示，异烟碱酰胺（isoniazid)在肝脏中主要经由氮-乙酰氨基转移酶0_ acety 1 transf erase，NAT )的帮助而乙酰化，产生的中间产物乙酰化异烟碱酰胺 (acetylisoniazid)迅速被水解成乙酰化联胺(acetylhydrazine);乙酰化联胺可以再经由 氮-乙酰氨基转移酶（N-acetyl transf erase )被乙酰化成无毒性的双乙酰化联胺 (diacetylhydrazine)，或者经由细胞色素 P450 2E1(CYP 450 2E1)氧化成具有肝毒性的分 子，其中包括乙酰化偶氮(acetyldiazene)、乙酰铵离子(acetylonium ion)、乙酰自由基 (acetylradical)、乙稀酮(ketene)等，另外在有氧及NADPH存在时，乙酰化联胺会被细胞色 素 P450 2E1反应生成自由基而造成氧化压力，导致细胞死亡；此外，异烟碱酰胺 (isoniazid)亦可经由酰胺水解酶(amidase)直接水解成有毒性的联胺(hydrazine )，或者 由上述乙酰化联胺（acetylhydrazine)经酰胺水解酶（ami dase)水解成有毒性的联胺 (hydrazine)〇
[0005] 近来有研究显示，联胺(而非异烟碱酰胺或乙酰化联胺)是在兔及鼠体内造成异烟 碱酰胺引起的肝毒性（INH-induced hepatotoxicity)最可能的主因，研究者认为异烟碱酰 胺引起的肝毒性的严重性与血浆中联胺的浓度成正相关;1999年Sarich等人的报导则认为 对硝基苯酸磷酸二酯(bis-p-nitrophenyl phosphate ,ΒΝΡΡ，为一种酰胺水解酶的抑制剂） 可预防异烟碱酰胺引起的肝毒性的伤害，其保护机制应是通过抑制异烟碱酰胺产生联胺。
[0006] 细胞色素 Ρ450 2E1(CYP2E1)在肝脏中会持续的表现，并负责许多异物质（如:肝毒 素四氯化碳(CC14)以及乙酰氨酚(acetaminophen))的代谢生物反应;然而，CYP2E1在异烟 碱酰胺引起的肝毒性中所扮演的角色并不明确，异烟碱酰胺本身即为CYP2E1的一种诱导 物;有些研究认为肝脏内的CYP2E1与异烟碱酰胺引起的肝毒性的机制有关。在体外试验中， 双硫仑(disulf iram，DSF)及其代谢物二乙基二硫代氨基甲酸（diethyldithiocarbamate) 均被确认为老鼠及人类肝脏微粒体CYP2E1的选择性抑制剂(selective mechanism-based inhibitors)，Brady等人的试验则显示老鼠服用单一口服剂量的双硫仑(DSF)后，会造成免 疫反应肝容量（immunoreactive hepatic content)以及CYP2E1催化活性快速且完全的下 降。
[0007] Sodhi等人则在1997年的报导指出，氧化压力是造成幼鼠体内异烟碱酰胺及立复 霉素引起的肝毒性的因素之一。有许多的研究想要找出适当的生物标记(biomarker)以评 估体内氧化伤害的速率，目前可能适用的生物标记可分为三类，分别为对脂质、蛋白质、核 酸氧化伤害的标记；8-异构前列腺素？2<1(8-丨8〇11'08七381311(1；[11?2€[，8-丨80-?6?2€[)是一种 自由基引起花生四稀酸(arachidonic acid)发生脂质过氧化作用的产物，其化学性质稳 定，8-is0-PGF2a含量可作为判断活体内脂质过氧化的新指标，该脂质过氧化反映可能与体 内自由基的产生、氧化性的伤害（oxidative damage)及抗氧化剂的缺乏（antioxidant deficiency)有关；目前有许多方法可用来测量8-is0-PGF2a含量，包括酵素免疫分析法 (enzyme immunoassay)、放射免疫分析法（radioimmunoassay)、气相层析质谱仪（gas-chromatography mass spectrometry)以及液相层析质谱仪（1 iquid chromatography mass spectrometry)等;此外，人类尿液中的8_is0-PGF2a及其代谢物2，3-dinor-8_iso-PGF2a含量可利用C18固相萃取(C18 solid phase extraction,SPE)准备样品后，再以液相 层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析。
[0008] 利用侵入式及非侵入式方法测试大鼠（rat)肝功能，以监测肝损害的发展以及筛 选肝脏疾病，其中最常使用的方法包含测量血清中的天门冬氨酸转胺酶（aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸转胺酶（alanine aminotransferase，ALT)以及喊性磷酸 酶(alkaline phosphatase)数值，以及测量肝细胞产物如：胆红素（bilirubin)、白蛋白 (albumin)，以及利用量测前凝血素时间（prothrombin time)来检测凝血因子 (coagulation factors)等;肝功能定量测试是根据几乎只经过肝脏代谢的受质在血清中 的浓度而定，这些受质的清除是依肝门静脉、肝动脉血流量以及由肝细胞对这些受质的作 用而定，肝脏血流量与提供给肝脏的受质量有关，反之，该受质的清除则决定于肝脏代谢的 能力。
[0009] 半乳糖(galactose)是一种具有高萃取率(extraction ratio)、90%在肝脏中代 谢的醣类，在肝脏中，半乳糖是由半乳糖激酶(galactokinase)经过差向立体异构化反应 (6口；[1]161^231：；[011)，将之转换成1-磷酸葡萄糖(61110086-111108口1^七6) ;半乳糖激酶的作用 反应为肝细胞中半乳糖代谢途径的速率决定步骤(rate-1 imiting step)。半乳糖的高萃取 率使得依赖肝脏血流量及肝脏功能的半乳糖代谢作用成为检测肝功能最主要的方式，目前 并无一定的规则来评估大鼠的残余肝功能(residual liver function)，量测确切化合物 (如:半乳糖）的代谢能力，可推测肝脏中代谢作用的速率决定步骤，亦可能取得残余肝功能 的代表数质。
[0010] 以半乳糖清除能力（galactose elimination capacity，GEC)作为人类肝功能定 量测试已行之有年，然而，半乳糖清除能力测试需取得多个血液样本以建立标准曲线，在临 床应用上有其困难度，因此有许多研究使用半乳糖单点法(Galactose Single Point，GSP) 以评估人类肝功能;本发明发明人以半乳糖单点法测试慢性肝炎、肝硬化以及肝癌病患，结 果显示半乳糖单点法可精确测出这些肝脏疾病;半乳糖单点法已被成功的应用到测试肝病 患者排除如丙嗪(promazine)及抗生素头孢酮(cefoperazone)等药物的剩余肝功能。此外， 半乳糖单点法已在美国食品药物管理局(FDA)所出版的指南(Guidance for Industry)中 成为建议采用测试肝功能的方法之一。
[0011]由此可见，上述现有抗结核药物异烟碱酰胺(isoniazid)仍有诸多缺失，实非良好 的设计，而亟待加以改良。

【发明内容】

[0012]本发明的目的即在于提供一种无/低副作用的抗结核病药物新复方药物组合，内 含药学有效量的异烟碱酰胺（isoniazid，INH)，或再并用药学有效量的立复霉素 (rifampin，RIF)，或再并用药学有效量的丙基硫异烟酰胺(pyrazinamide，PZA)，或再并用 药学有效量的乙酰胺醇(Ethambutol，EMB)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使 用药学有效量的细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂，以降 低由异烟碱酰胺(INH)所引起的肝毒性等副作用。
[0013]可达成上述发明目的的无/低副作用的抗结核病药物新复方，内含药学有效量的 异烟碱酰胺(isoniazid，INH)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使用药学有效量 的细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂，其中CYP2E1抑制剂 或amidase抑制剂选自于下列化合物所组成群组：正二轻愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)、（-)_表儿茶素没食子酸酯（（-)-Epigallocetechin-3-gallate)、茵陈色原酮 (Capillarisin)、山奈HKKaempferol)、根皮素(Phloretin)、橙皮素(Hesperetin)、6_姜辣 醇（6_6；[叫61'01)、没食子酸（8311；[03(^(1)、异甘草素（180119111'；[1^8611；[11)、柚皮素 (Narigenin)、二氢化槲皮素（（ + )-Taxifolin)、汉黄苳素（Wongonin)、原儿茶酸 (Protocatechuic acid)、儿茶素（（ + )_Catechin)、β_奈黄酮（β-naphthoflavone)、恩贝素 (Embelin)、反式肉桂酸（trans-Cinnamic acid)、表儿茶酸（（-)-Epicatechin)、根皮苷 (Phloridzin)、鲸錯醇聚氧乙稀醚、聚氧乙稀硬脂酸酯、聚氧乙稀月桂醚、聚氧乙稀去乙水 山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚乙二 醇PEG 2000、聚乙二醇PEG 400、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLUR0NIC F-68、聚乙二醇PEG 4000、反式肉桂醛（1^3118-(^1111311^1(16117(16)、大豆甘元（03丨(126；[11)、异牡荆素 (Isovitexin)、β-香叶稀（β-Myrcene)、懈皮素（Quercetin)、（ + )-梓檬稀（（ + )-Limonene)、 杨梅素(Myricetin)、懈皮(Quercitrin)、木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-Glucoside)、 桑叶素(101"；[11)、新橙皮苷(此01168?61^(1；[11)、橙皮苷(!168?61^(1；[11)、（-)-表没食子儿茶素 ((-)-Epigallocatechin)、木犀草素（Luteolin)、金丝桃苷(Hyperoside)、十四烧酸乙酯 (Ethyl Myristate)、怪柳素（Tamarixetin)、黄零素（Baicalein)、芸香素（Rutin)、黄零 (Baicalin)、序菜素(Apigenin)、（ + )-表儿茶素（（ + )-Epicatechin)、（-)-表儿茶素没食子 酸酯（（-)^^；^3七6(311；[11-3-83113七6)、水飞蓟宾(5；[1713；[11)、牡荆素(>；^61；[11)、金雀异黄酮 (Genistein)、异鼠李素（Isorhamnetin)、香叶木素（Diosmin)、葛根素（Puerarin)、或伞形 花内酯(Umbelliferone)、高良姜素(Galangin)、非瑟酮(fisetin)、聚氧乙稀蓖麻油、十二 烷基硫酸钠、微晶纤维素、二水磷酸氢钙、甘露醇Manni to 1、聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油、蔗 糖素、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸树脂Eudragit S100、交联羧甲基纤维素钠、薄荷脑、邻磺酰苯酰亚胺、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、葡萄糖 结合剂、柠檬酸、气相二氧化硅、聚乙二醇PEG 8000、山梨酸、柠檬油、羟丙基纤维素、苯甲酸 钠、乙酰磺胺酸钾、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、甲基纤维素、环己氨基磺酸钠、 乳糖单水合物、麦芽糖糊精、甘油二十二烷酸酯、氧化铁红、单硬脂酸甘油酯、共聚维酮K28、 淀粉乙酸酯、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、聚维酮K-30、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基 苯甲酸丙酯、聚乙二醇硬脂酸酯15、丁基羟基茴香醚。
[0014] 更进一步，本发明的无/低副作用的抗结核病药物新复方包括药学有效量的丙基 硫异烟酰胺(PZA)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使用药学有效量的酰胺水解 酶（amidase )抑制剂，其中amidase抑制剂选自于下列化合物所组成群组：懈皮素 (Quercetin)、高良姜素（Galangin)、桑叶素(Morin)、非瑟酮(fisetin)、异甘草素、杨梅素 (Myricetin)、木犀草素(Luteolin)、山奈酸(Kaempferol)、茵陈色原酮(Capillarisin)、聚 氧乙烯蓖麻油、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯、鲸蜡醇聚氧乙烯醚， 以降低由丙基硫异烟酰胺(PZA)所引起的肝毒性等副作用。
[0015] 本发明所提供的无/低副作用的抗结核病药物新复方，亦可加入药学上可接受的 赋形剂至该复方，该赋形剂可为稀释剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等，例如:聚氧乙烯 去乙水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸 酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯月桂醚、鲸蜡醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLUR0NIC F-68、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物PLUR0NIC F-127、聚乙 二醇PEG 400、聚乙二醇PEG 2000、聚乙二醇PEG 4000、山梨醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐单油 酸酯、S-40聚氧乙烯(40)单硬脂酸酯、聚乙二醇PEG 8000、乙酰氨基磺酸钾、气相二氧化硅、 胶态二氧化硅、丁基羟基茴香醚、玉米淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、二 水磷酸氢钙、乙二胺四乙酸二钠、乳糖、乳糖单水合物、乳糖S.G、低取代羟丙基纤维素、麦芽 糖糊精、甘露醇Mannitol、薄荷脑、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、瓜 尔胶、黄原胶、预胶化淀粉、聚维酮K-30、羧甲基淀粉钠、十二烷基硫酸钠、蔗糖素、聚乙二醇 硬脂酸酯15、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油、环己氨基磺酸钠、聚维酮K90F、 氧化铁红、羟丙基甲基纤维素、樱桃、柠檬油、山梨酸、苯甲醇、甘草素、苯甲酸钠、淀粉乙酸 酯、梓檬酸、山梨糖醇、膜衣Opadry white、葡萄糖结合剂、硬脂酸镁、褐藻酸、丙稀酸树脂 E90、丙烯酸树脂E、甘油二十二烷酸酯、月桂酸聚乙二醇甘油酯、共聚维酮K-28、氢氯酸、羥 乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、丙烯酸树脂100、麦芽糖、丙烯酸树脂S100、聚 乙二醇PEG 1450、共聚维酮K-90、磷酸85%、聚氧乙烯醚-40氢化蓖麻油(RH 40)、聚氧乙烯 (35)蓖麻油(EL 35)、磷酸二氢钠、蔗糖素、枸橼酸三乙酯、柠檬酸三钠或其余列于美国Π)Α Generally Recognized as Safe(GRAS)中的常用成分。
[0016] 本发明发明人鉴于现有抗结核药物异烟碱酰胺（isoniazid)所导致肝毒性等副作 用的缺点，以及承袭本实验室先前专利案(低副作用的INH新复方，案号096101545)及(含异 烟碱酰胺（Isoniazid，INH)的低副作用新复方(2)，案号097141522)的发明。另外，在本发明 发明人先前专利申请案，PCT申请案号PCT/CS2008/001353(低副作用的异烟碱酰胺新复方） 发明中，虽已揭示INH单方并用部分本实验室揭露的CYP2E1抑制剂的药学组合物，可降低 INH所导致肝毒性等副作用，但后续发明人的研究，发现并不是任意的剂量组合都可以于体 内达到去除INH肝毒性的效果，例如，在动物体内实验发现，小鼠每日合并使用山奈酚 (1^611^^6仍1)3.781^/1^与1顺/1?正50/10〇1^/1^腹腔注射持续3周，可显着抑制1順所导致 的肝毒性，控制组（INH/RIF 50/100mg/kg)的相关肝功能指针GOT、GPT和GSP值为571 土 295U/L、364 ± 192U/L 和 866 ± 339mg/L，而并用山奈酚 3 · 78mg/kg 组的 GOT 值则为 89 ± 19U/L、 48 ± 211VL和245 ± 98mg/L，接近正常值，然而山奈酚使用剂量调整为1.89mg/kg后，各项相 关肝功能指针相较于控制组所下降的幅度均未达并用山奈酚3.78mg/kg所获得的成效。由 以上动物试验结果可知当合并使用CYP2E1抑制剂时，对INH所导致肝毒性确实具有改善效 果，但必须限定其使用剂量，因此基于实验结果，本发明着重于抑制剂使用剂量的决定。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018] 1.本发明所提供的含异烟碱酰胺（IS〇niazid，INH)的无/低副作用新复方，与单独 使用异烟碱酰胺（INH)，异烟碱酰胺（INH)和/或立复霉素（rifampin，RIF)、异烟碱酰胺 (INH)和/或丙基硫异烟酰胺（pyrazinamide ,ΡΖΑ)的试验结果相互比较时，在生化分析 (ALT、AST值）、病理学分析、剩余肝功能的量测(GSP值、GEC值）以及氧化压力的指标(血浆中 8-is〇-PGF2a的浓度)等各方面的分析结果，都有明显减少使用异烟碱酰胺(INH)所造成的肝 毒性副作用的功效。
[0019] 2.本发明所提供的含异烟碱酰胺（IS〇niazid，INH)的无/低副作用新复方，其中亦 提供可作为细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂的中药药 弓丨，相较现有细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂，本发明所 提供者是从天然中药药引萃取，无生理、化学毒性，且对于人类肝脏的细胞色素 P450 2E1活 性有明显的抑制活性。
【附图说明】
[0020] 图1为异烟碱酰胺(INH)在肝脏中的代谢途径图；
[0021] 图2为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠，天门冬氨 酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean±SD，*表示各试验组与 对照组比较后P〈〇. 05者；
[0022]图3为对照组（图3A及C)与INH组（图3B及D)大鼠肝脏切片：图3A，对照组相对正常 肝组织的型态(HE染色，400X);图3B，INH组在周围中央静脉(V)的肝细胞呈现碎裂及空泡化 (HE染色，400X);图3C，以电子显微镜检视对照组大鼠肝切片，Nu:细胞核(9,000X);图3D，以 电子显微镜检视INH组大鼠肝切片，相较于图3C对照组的肝细胞切片，INH组大鼠肝细胞的 粗内质网(rER)明显增加，Nu:细胞核(9,000X);
[0023] 图4为8-is〇-PGF2a-d4(A)与8-is〇-PGF2a(B)的分子结构以及子离子光谱；
[0024]图5为含有250pg 8-is〇-PGF2a-d4(A)的内标准品溶液、含有 100pg 8-is〇-PGF2a(B) 的标准品溶液与空白样本(C)，在多重反应监测模式(MRM)侦测下的液相层析串联式质谱仪 (LC/MS/MS)色谱，质荷比(m/z)357/197以及质荷比(m/z)353/193的离子偶（ion pairs)分 别被用来监测8-is〇-PGF2a-d4(A)(作为内标准品）以及8-is〇-PGF 2a(B)(作为标准品）；波峰 1:空白血浆;波峰2:注入标准品的空白血浆；
[0025] 图6为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中8-is〇-PGF 2a的浓度，数值的计算为mean 土 SD，*表示试验组与对照组比较后P〈0.001者;#表示 各试验组与INH组比较后P〈0.05者。
[0026] 图7为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖单 点法(GSP)值，数值的计算为mean 土 SD，*表示试验组与对照组比较后P〈0.001者;#表示各试 验组与INH组比较后P〈0.001者严表示各试验组与INH组比较后P〈0.005者；
[0027] 图8为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖清 除能力(GEC)值，数值的计算为mean土SD，*表示试验组与对照组比较后P〈0.001者; #表示各 试验组与INH组比较后P〈0.005者严表示各试验组与INH组比较后P〈0.05者；
[0028] 图9为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组各组半乳糖单 点法(GSP)值与血浆中8-is〇-PGF 2a的浓度具有高度相关的统计图；
[0029] 图10为对照组、INH组、BNPP-INH组、DSF-INH组以及BNPP-DSF-INH组各组半乳糖单 点法(GSP)值与半乳糖清除能力(GEC)值具有高度相关的统计图；
[0030] 图11为对照组、PZA组、BNPP-PZA组及BNPP组大鼠，天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨 酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean土SD，*表示各试验组与对照组比较后P〈0.05 者；
[0031] 图12为对照组（图12A)与PZA组（图12B)大鼠肝脏切片：图12A，对照组相对正常肝 组织的型态(HE染色，400X);图12B，PZA组在周围中央静脉(V)的肝细胞呈现碎裂及空泡化 (Η E染色，400X);
[0032]图13为PZA组、BNPP-PZA组大鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean 土 SD;
[0033] 图 14 为对照组、INH-RIF 组、INH-RIF-PZA 组、Kaempferol-INH-RIF 组、Quercetin-INH-RIF组、Kaempferol-INH-RIF-PZA组及Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠，天门冬氨酸转 胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean 土 SD;
[0034] 图 15 为对照组、INH-RIF 组、INH-RIF-PZA 组、Kaempferol-INH-RIF 组、Quercetin-INH-RIF 组、Kaempferol-INH-RIF-PZA组及Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠半乳糖单点法 (GSP)值，数值的计算为mean ± SD;
[0035] 图 16 为空白对照组(A)、INH-RIF-PZA 控制组（B)、Quercetin-INH-RIF-PZA 组（C)、 Kaempf erol-INH-RIF-PZA组(D)，于实验3周小鼠肝脏切片；
[0036] 图 17 为空白对照组（A)、INH-RIF 控制组（B)、Quercetin-INH-RIF 组（C)、 Kaempferol-INH-RIF组(D)，于实验3周小鼠肝脏切片；
[0037] 图 18 为对照组(A)、INH-RIF 组(B)、MH-INH-RIF 组（C)、MM-INH-RIF(D)组及 ML-INH-RIF组(E)，于实验3周小鼠肝脏切片；
[0038] 图 19为Chiorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone 于健康受试者血中浓度图；实心方块为Rifamate控制组，给予Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate(INH/RIF 150/300mg);空心圆形为 HUCHE033 实验组，给予 Chlorzoxazone(500mg) +Rifamate(INH/RIF 150/300mg)+甘露醇Mannitol lOOrng;
[0039] 图20为Chiorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone 于健康受试者血中浓度图；实心方块为Rif amate控制组，给予Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate(INH/RIF 150/300mg);空心圆形为 HUCHE033 实验组，给予 Chlorzoxazone(500mg) +Rifamate(INH/RIF 150/300mg)+甘露醇Mannitol lOOmg。
【具体实施方式】
[0040]本发明将就下列实施例作进一步说明，然该等实施例仅为例示说明之用，而不应 被解释为实施本发明的限制。
[0041 ] 实施例1异烟碱酰胺（INH)合并使用CYP2E1抑制剂双硫仑(DSF)及/或硝基苯酚磷 酸二酯(BNPP)的动物试验 [0042] 一、材料与方法 [0043] 1.试验材料
[0044] 所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司（Fairfield，OH，USA)，INH， 8陬？，03?以及玉米油则购自3丨8!11&化学公司（3七丄〇11丨8，10 1^六），8-丨8〇-?6?2〇1以及放射线标 定的8-is〇-PGF2a-d4则得自Cayman化学公司(Ann Arbor，MI，USA)，半乳糖注射溶液由南光 化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统 以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
[0045] 2.试验动物
[0046] 体重为320-350公克的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心（台 湾），动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的大鼠均置于空气/湿度调节环境下， 光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间大鼠体重均持续监测，所有的大鼠 均以使用50毫克/公斤体重剂量的戊巴比妥钠 （sodium pentobarbital)进行腹腔麻醉 (in trap eritoneal ly anesthetized)，将聚乙稀导管置于大鼠右颈内静脉（internal jugular vein)内以施打半乳糖，导管以切入穿刺(cut-down technique)插入，该导管的末 端置于大鼠颈后切口的皮肤下方，手术完成后，恢复期间使大鼠禁食一夜(约16小时），但水 分照常供给。
[0047] 3.试验处理
[0048] 试验动物随机分成5组，每组包括3种处理，第一种处理为注射25mg/kg BNPP或 BNPP的基剂(vehicle，VEHl，即食盐水），BNPP溶于加热至60°C的食盐水(0.9%NaCl)，冷却 后以lml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第二种处理为则注射100mg/kg DSF或DSF 的基剂(VEH2,即玉米油），DSF溶于玉米油中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内； 第三种处理为注射150mg/kg INH或INH的基剂（VEH3,即食盐水），INH溶于食盐水（0.9% NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第一组(BNPP或VEH1)较第三组（INH 或VEH3)早30分钟处理，第二组(DSF或VEH2)比第三组（INH或VEH3)早15分钟处理。
[0049] 上述5组试验共包含：
[0050] (1)对照组（normal control group,NC，n = 12):正常的大鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2以及VEH3 (施行腹腔内注射)共21天；
[0051 ] (2)INH组（INH，η = 7):正常的大鼠每天注射1次INH、VEH1以及VEH2(施行腹腔内注 射)共21天；
[0052] (3)ΒΝΡΡ-ΙΝΗ 组（ΒΝΡΡ-ΙΝΗ，η = 7):正常的大鼠每天注射 1 次 ΒΝΡΡ、ΙΝΗ 以及 VEH2(施 行腹腔内注射)共21天；
[0053] (4)DSF-INH组(DSF-INH，n = 7):正常的大鼠每天注射1次DSF、INH以及VEH1 (施行 腹腔内注射)共21天；以及
[0054] (5)BNPP-DSF-INH组（BNPP-DSF-INH，η = 7):正常的大鼠每天注射 1 次BNPP、DSF以 及ΙΝΗ(施行腹腔内注射)共21天；
[0055] 半乳糖单点法于第21天处理后16小时进行测试。
[0056] 4.血液样本
[0057] 处理完毕后，大鼠以乙醚麻醉牺牲，血液由大鼠背部主动脉抽取，置于含有EDTA的 试管中，血浆（plasma)以13,000g于4°C离心15分钟，分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并置于_80°C中储存。
[0058] 5.生化分析
[0059] 肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以 进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，以Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments，美国）。
[0000] 6.光学显微镜与电子显微镜
[0061] 大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析;肝脏样本以10%磷酸缓冲液配制的福尔马 林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片样本以苏木精（hematoxylin)与伊红（eosin)染色，并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切 片以二甲胂缓冲液（〇&(3 〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂（Spurr resin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰（uranyl acetate)及梓檬酸铅（lead citrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）观察。
[0062] 7.8-is〇-PGF2a 的萃取与量测
[0063]所有PGF2cc的同分异构物（isomers)均以适当体积的酒精溶解或稀释以制备原液， 并分装于小管中储存于-70°C，取0.5ml血衆至玻璃管中，加入10ng内标准品（internal standard,即8-is〇-PGF2a-cU)，混勾后的血衆以C18固相萃取管柱（Solid-Phase Extraction cartridge,J.T.Baker，MA,美国）纯化，样本流洗液以氮气蒸发干燥后，以50μ1 乙睛:水(&〇6切11丨廿丨16 :册七6115:85￥八)溶液回溶并震荡30秒，取1(^1回溶后的萃取物注 射至LC/MS/MS系统进行分析。
[0064] 8.液相层析串联式质谱仪(LC/MS/MS)分析
[0065] HPLC系统包括2个岛津LC-10ADvP栗（Shimadzu LC-10ADvP pumps)、l个岛津系统 控制器（Shimadzu system control)以及 1 个岛津自动样本机（Shimadzu autosampler)(岛 津科学仪器，日本），以C18管柱(颗粒大小5-μπι，内径50X2.1mm)进行HPLC分离，并使用含有 2mM醋酸铵（ammonium acetate)及乙睛（acetonitrile，ACN)之梯度流洗液（t = 0min，15% ACN; t = 6min，70%ACN; t = 7min，90%ACN; t = 8min，90%ACN; t = 8 · 5min，15%ACN)流洗， LC/MS/MS的流速均维持在200μ1/π?η，整个HPLC进行时间为13.5分钟;该HPLC系统与一三层 四极质谱仪（triple stage quadrupo 1 e mass spectrometer,AP13000,Applied Biosystem,Foster City,CA,美国）介接，配备有TurboIonSpray离子源（TurboIonSpray ionization source)，并使用负电电喷雾（negative electrospray)作为电离 (ionization)的方法；该质谱仪通过扩散200 ng/ml 8-is〇-PGF2a或8-is〇-PGF2a-d4标准 液以多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进行最佳化，m/z 353/193 以及m/z 357/197离子偶（ion pair)则个别用来监测8-is〇-PGF2a以及8-is〇-PGF2a-d4;测 量后，计算6个8_iso_PGF2a浓度(C)的线性标准曲线（linear calibration curve)对8-iso_PGF2a 比 8-is〇-PGF2a-cU比值的区域（Y)，得到相关系数（r, correlation coeff icient)值为0.999;血浆中8-is〇-PGF2a的线性范围在〇. 1-2.5ng/ml之间，其回归方 程式(regression equation)为Y = -〇 .0517C+0.823ng/ml;所测得的结果均对照重氢化8-iso_PGF2a(deuterated 8-iso_PGF2a)内标准品计算，标准曲线的批间精密度以及准确度 是以标准浓度样品分别测试6次后，经由反向计算法(Back-Calculation)来评估，其相对误 差(relative errors)范围在-5.06%至3.13%之间。
[0066] 9.肝功能的定量测试
[0067]所有的大鼠均进行半乳糖单点法(GSP)及半乳糖清除能力(GEC)测试，大鼠接受在 30秒内的快速静脉注射，注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后5、10、15、30、45以 及60分钟各采血一次，血液样本取自尾部静脉；以半乳糖脱氢酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试浓度范围为50至1，000μg/ml，每个浓度 的日内差异(within-day variation)由标准偏差（standard deviation)以及变异系数 (coefficient of variation,CV)百分比计算，最大容许的变异系数为10%CV;日间差异 (day-to-day variation)则由比较校正曲线（calibration curves)的斜率及截距来检验； 半乳糖清除能力(GEC)由下列公式计算，该公式是由Tygstrup's方程式修改而来：
[0069] 其中D为半乳糖注射量;Tc=o为半乳糖浓度达到0所需要的时间，是由注射(通常为 2.22mmol/l)后20至60分钟的血液浓度-时间曲线的线性回归推得;7为依经验法则修正体 内不均匀分布的校正值;半乳糖单点法(GSP)则为30秒注射停止后60分钟时血液中半乳糖 浓度。
[0070] 10.统计分析
[0071] 所有的数据皆以平均±标准偏差（SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (AN0VA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性（least significant difference)方法做多重比较，以 确认族群间的显着差异;族群平均的显着差异为P〈〇. 05。
[0072] 二、结果
[0073] 1.生化分析结果
[0074]试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显 着差异;生化分析结果如图2所示，只有INH组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转 胺酶(ALT)活性明显高于对照组(对照组血浆中的AST活性为116 ± 11IU/L; INH组血浆中的 AST活性为129±1011]/1，？〈0.05;对照组血浆中的厶1^活性为44±611]/1;1順组血浆中的八1^ 活性为52±3IU/L，p〈0.05)，显示INH组产生生化上的肝损伤;对照组、BNPP-INH、DSF-INH以 及BNPP-DSF-INH组血清中转胺酶浓度则为正常。
[0075] 2.组织病理学
[0076]经过为期三周施行腹腔注射150mg/kg/day INH的大鼠，其体内成功的产生肝毒 性;相对的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图3A所示，对照组大鼠肝实质（liver parenchyma)内的肝细胞系排列于自肝小叶中央静脉辐射排列的网状平板内，肝血窦 (hepatic sinusoids)则在两肝板(anastomosing plates)之间被发现；INH组大鼠的组织 切片则如图3B所示，INH组大鼠中央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化，然而并无看到 肝细胞坏死(necrosis)的征兆；以电子显微镜观察的结果显示，相较于对照组（如图3C所 示），INH组大鼠肝细胞内的粗内质网（rER)明显增加(如图3D所示）。根据文献报导，INH是一 个强效的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)的诱导物，而CYP2E1会导致超氧基（superoxide)以及 氢氧自由基(hydroxyl radicals)的产生，并且会引发内质网的增加，因此本试验的结果与 先前研究相符。而其它试验组:BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的肝损害程度 与对照组相较，并无明显区别（未显示结果）。
[0077] 3 ·血液样本中8-i so_PGF2a的量测
[0078] 在负电电喷雾模式下，8_iso_PGF2a最大量的分子离子为质荷比(m/z)353的离子， 8-is〇-PGF2a-d4最大量的分子离子为质荷比(m/z)357的离子，这些负电荷分子离子经过大 量碰撞诱导而产生游离，这两个目标化合物的分子结构以及产生的离子光谱如图4所示;除 了 8_i s〇-PGF2a_d4的子离子(daughter ions)恒较8_i so_PGF2a的子离子高四个单位之外，8-iso_PGF2a以及8_is〇-PGF2a_d4两者的碎裂模式（fragmentation patterns)很相似，这显示 大多数稳定的子离子是由A链产生而来，该A链上标示有4个氖原子(deuterium atoms) ;8_ is〇-PGF2a最密集的子离子为质荷比(m/z)193的离子，8-is〇-PGF2a-d4最密集的子离子为质 荷比（m/z)197之离子。图5所示为在多重反应监测模式(MRM)侦测下，含有100pg 8-iso-PGF2a与250pg/ml 8-is〇-PGF2a-d4的标准溶液，以及血液样本的典型LC/MS/MS色谱，在注入 lng 8-is〇-PGF2a-d4作为内标准品后，该标准溶液与该血液样本均经过相同的固相萃取 (SPE)纯化，并以前述LC/MS/MS规程分析。
[0079] 4.血浆中 8-i so-PGF2a的浓度
[0080] 血衆中的8-is〇-PGF2a是一种氧化压力(oxidative stress)的指标，如图6所示，相 较于对照组，INH组大鼠血浆中8-i s〇-PGF2a的浓度明显增加（INH组大鼠血浆中8-i s〇-PGF2a 的浓度为151±26pg/ml;对照组大鼠血浆中8-is〇-PGF2a的浓度为110±15pg/ml，p〈0.001); 与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组三组则明显降低由INH引起肝脏的 8-is〇-PGF2a 产生（BNPP-INH 组大鼠血浆中 8-is〇-PGF2c^浓度为 128±29pg/ml;DSF-INH 组 大鼠血浆中8-is〇-PGF2a的浓度为126±2(^8/1111;8陬？-〇5?-1順组大鼠血浆中8-丨8〇-?6卩2〇 1 的浓度为 123±17pg/ml;INH 组大鼠血浆中 8-is〇-PGF2a 的浓度为 151±26pg/ml，p〈0.005); 值得注意的是，对照组、BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间，大鼠血浆中8-is〇-PGF 2a的浓度无显着差异，与BNPP-INH组及DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF并不 会进一步减少血浆中8-is〇-PGF 24^浓度。
[0081 ] 5.剩余肝功能的量测
[0082]如图7所示，对照组与INH组大鼠的半乳糖单点法(GSP)值具有高度的显着差异(对 照组大鼠的GSP值为384 ± 69μg/ml; INH组大鼠的GSP值为565 ± 87μg/ml，p〈0 · 001)，此外， BNPP-INH 组、DSF-INH 组、BNPP-DSF-INH 组大鼠之 GSP 值各为 401 ± 70μg/ml、449 ± 45μg/ml、 388 ± 53μg/ml，与INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GSP值各与 INH组大鼠具有高度的显着差异(其p值各为p〈0.001，p〈0.005，and p〈0.001);单独施用INH 的大鼠的GSP值明显增加;然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP与DSF的大鼠则可抵抗这 种改变;另一方面，与DSF-INH组相较，INH合并施用BNPP与DSF显示可以降低INH引起的肝毒 性，虽然两者之间的差异未达到统计上的差异(p = 〇. 1)，而对照组、BNPP-INH组、DSF-INH 组、BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的GSP值无显着差异存在。
[0083]相似的结果在使用半乳糖清除能力(GEC)方法上也可观察的到，如图8所示，与对 照组相较，INH组大鼠的GEC值明显减少（INH组大鼠的GEC值为3.4±0.6mg/min.kg;对照组 大鼠的GEC值为4 · 9 ± 0 · 8mg/min · kg，p〈0 · 001)，此外，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH 组大鼠的 GEC 值各为4 · 5 ± 0 · 6mg/min.kg、4.3±0.4mg/min · kg、4 · 7 ± 0 · 5mg/min · kg;与 INH组相较，BNPP-INH组、DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组大鼠的GEC值各与INH组大鼠具有高度 的显着差异(其P值各为p〈〇. 005，p〈0.05，and p〈0.005);单独施用INH的大鼠之GEC值明显 减少;然而，在INH合并施用BNPP或DSF或BNPP与DSF的大鼠则可恢复这种改变;与DSF-INH组 相较，INH合并施用BNPP与DSF者有增加 GEC值的倾向（DSF-INH组与BNPP-DSF-INH组大鼠的 GEC值各为4 · 3 ± 0 · 4mg/min · kg、4 · 7 ± 0 · 5mg/min · kg，p = 0 · 29);此外，对照组、BNPP-INH组、 DSF-INH组、BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的GEC值无显着差异存在。
[0084] 为了确定AST、ALT、血浆中8-is〇-PGF2a的浓度，以及定量肝功能测试(如:GSP以及 GEC)是否相关，以数种相关分析计算后，发现GSP值与血浆中8-is〇-PGF2a的浓度具有高度相 关（如图9所示），相关系数为0.836;GSP值与GEC值具有高度相关(如图10所示）（p〈0.001)， 相关系数为-0.822;GEC值也与血浆中8-i SO-PGF2α的浓度具有高度相关（相关系数为-0.743，p〈0.001，如表l所示）；而GSP值、GEC值以及血浆中8-iso-PGF 2α的浓度则与AST及ALT 均无明显相关(如表1所示）。
[0085] 表1、GSP、GEC以及8-is〇-PGF2a与生化测试的相关性
[0086]
[0087] 以皮尔森氏相关系数(Pearson's correlation coefficient)作为统计计算，*p〈 0.001
[0088] 实施例2细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选-
[0089] cDNA合成微粒体细胞色素 P450 2E1。
[0090] 一、材料与方法
[0091] 1.试验材料
[0092] 本实施例是使用细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组（CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit,BD Bioscience,美国）针对22种中药药引及 10种 赋形剂进行细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选;该CYP2E1抑制剂的筛选套组的作用 原理为：在含有细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)以及其荧旋旋光性受质1?以7,6认(^7-4-trifluoromethyl coumarin)的环境下加入测试样品作用后，再侦测CYP2E1代谢物标准品 HFC(7-Hydroxy-4_trifluoromethyl coumarin)的生成量，并以对照组（(3〇11奸〇1)的耶〇生 成量为基准，计算测试样品的CYP 2E1抑制率。
[0093] 各测试样品均溶于乙腈(acentoitrile)，测试不同浓度的中药药引（66μΜ，33μΜ， 16.5μM)及赋形剂(0.167%，0.08%，0.042%，w/v)对CYP2El的抑制率，所测试的中药药引 及结果如表3所列，所测试的赋形剂及结果如表4所列。
[0094] 另外，本实施例使用的细胞色素 Ρ450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组（CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美国）所需的药剂如下：
[0095] (1)CYP2E1+P450 Reductase+Cytochrome b5：100 mM potassium phosphate(pH 7.4)含有1.3醒〇1?450以及口-附奸〇口11611〇1水解酶。
[0096] (2)Control Protein: 15 mg/mL Control Protein溶于 100 mM Potassium Phosphate(pH 7.4)中。
[0097] (3)Buffer Solution：0.5M Potassium Phosphate(pH 7.4)〇
[0098] (4)Stop Solution:0.5M Tris Base。
[0099] (5)Cofactors:含有1.3mM NADP+、66mM MgCl2以及66mM Glucose 6_Phosphate〇
[0100] (6)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase:40 units/ml溶于5mM Sodium Citrate Buffer(pH 7.5)〇
[0101] (7)MFC(7-Methoxy-4_trifluoromethyl coumar in ):焚旋旋光性受质 (fluorescence substrate)，50mM MFC溶于乙臆(acetonitrile) 〇
[0102] (8)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid):CYP2E1选择性抑制剂（阳性对照组）， 20mM DDTC溶于乙臆(acentoitrile)。
[0103] (9)HFC(7-Hydroxy-4-trifluoromethy 1 coumarin): CYP2E1代谢物标准品 (metabolite standard)，。.25 mM HFC溶于0.1M Tris(pH 9.0)。
[0104] (10)NADPH_Cofactor Mix:于 14 · 56ml无菌水中加入187 · 5μ1 Cofactors、150μ1 G6PDH(Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及 100μ1 Control Protein〇
[0105] (ll)Cofactor/acetonitrile mix:于9.93ml NADPH-Cofactor Mix中加入66μ1 Acetonitrile〇
[0106] (12)Enzyme/Substrate Mix:于4ml Buffer Soultion中加入5.94ml无菌水、50μ1 HTS-706 (CYP2E1 ,2μΜ P450 content)以及28μ1 50 mM MFC ( 7-Me thoxy-4-trif luoromethyl coumarin，焚方定方定光性受质）。
[0107] 2.细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选
[0108] 使用细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选套组（CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit，BD Bioscience，美国）进行中药药引及赋形剂的筛选，实验步 骤如下所述：
[0109] (1)制备对照组：
[0110] a.于96孔盘上第 1 孔井(well)内加入 149μ1 NADPH-Cofactor Mix以及ΙμL 20mM DDTC并混合均匀；
[0111] b.于该96孔盘上第2至 12孔井内各加入100μΙ Cofactor/acetonitrile mix，第 1 至8孔井为阳性对照组(positive control);第9与第10孔井为对照组(control);第11与第 12孔井为空白对照组(blank);
[0112] c.于该第1至8孔井内做连续稀释动作：自第1孔井内取50μ1液体加入第2孔井内混 匀，再自第2孔井内取50μ1液体加入第3孔井内混匀，以此类推，至第8孔井时去除多余的50μ 1 液体，以得到连续稀释浓度66·6、22·2、7·4、2·47、0·82、0·27、0·091、0·03μΜ。
[0113] (2)制备试验组：
[0114] a.于96孔盘上第1行的第1及第2孔井内各加入149μ1 NADPH-Cofactor Mix，以及1 μL 20mM中药药引测试样品或ΙμL 25%(w/v)赋形剂测试样品，并混合均匀；
[0115] b.再自该第1行的第1及第2孔井内各取50μ1液体加入第3孔井内混匀（即每一测试 样品均为三重复）；
[0116] (3)反应起始与终止：
[0117] a.将上述对照组与试验组置于37 °C静置10分钟；
[0118] b.除了该空白对照组之外，其它孔井内均加入100μΙ Enzyme/Substrate Mix混 匀；
[0119] c.将所有对照组与试验组置于37 °C静置40分钟；
[0120] d.所有的孔井内均加入75μ1 Stop Solution混匀；
[0121 ] e.紧接着于该空白对照组内加入100μΙ Enzyme/Substrate Mix混勾；
[0122] f.将所有对照组与试验组以萤冷光仪(Fluoroskan Ascent FL,Thermo Electron Corporation，芬兰）读取结果，所使用的激发光（excitation)波长为405 nm，发散光 (emission)波长为538 nm〇
[0123] (4)结果分析：测得的荧光讯号数值换算成为CYP2E1代谢物标准品HFC生成量 (pmol)后，以对照组(control)为基准，即对照组的CYP 2E1抑制率为0%，以下列公式计算 各阳性对照组及试验组的CYP 2E1抑制率：
[0125] 二、结果
[0126] 1.阳性对照组
[0127] 阳性对照组(DDTC)所测出的CYP 2E1抑制率如表2所示，由表2可知当DDTC的浓度 为66.6μΜ(即为0.167%，w/v)时，CYP 2E1抑制率可达97.55%，是以66.6μΜ作为中药药引最 高测试浓度，以0.167% (w/v)作为赋形剂最高测试浓度。
[0128] 表2阳性对照组的CYP 2E1抑制率
[0129]
[0130] 2.试验组CYP 2E1抑制率
[0131] 中药药引所测出的CYP 2E1抑制率如表3所示，由结果可知各中药药引于不同浓度 (66μΜ，33μΜ，16.5μΜ)的条件下，对细胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μ Μ正二轻愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果最佳(97·99±0·66% ) 〇
[0132] 表3中药药引的CYP 2Ε1抑制率
[0134]
[0135] *最小有效剂量:最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
[0136] 赋形剂所测出的CYP 2E1抑制率如表4所示，由结果可知各赋形剂于不同浓度 (0.167 %，0.08 %，0.042 %，w/v)的条件下，对细胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效 果，其中以0.167%鲸蜡醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳(97.75±0.66 %)。
[0137] 表4赋形剂的CYP 2E1抑制率
[0138]
[0139] *最小有效剂量:最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
[0140] 实施例3细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选-人肝微粒体细胞色素 P450 2E1
[0141] -、材料与方法
[0142] 1.试验材料
[0143] 本实施例是使用人类肝脏所制备微粒体，针对细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)与39种 中药药引及10种赋形剂进行细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选，以筛选出对于人类 肝脏的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)有效抑制剂;该CYP2E1抑制剂的筛选作用原理为:利用 人类肝脏所制备微粒体中细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)与其受质Chlorzoxazone反应，加入 测试样品作用后，再侦测CYP2E1代谢物标准品6-OH-CZX (6-Hydroxy-Chl orzoxazone)的生 成量，并以对照组(control)的6-OH-CZX生成量为基准，计算测试样品的CYP 2E1抑制率。
[0144] 各测试样品均溶于10%甲醇(methanol)或是二次水中，测试不同浓度的中药药引 (66μΜ，33μΜ，16·5μΜ)及赋形剂（0·167%，0·08%，0·042%，w/v)对CYP2El的抑制率，所测试 的中药药引及结果如表6所列，所测试的赋形剂及结果如表7所列。
[0145] 本实施例所利用人类肝脏细胞色素 Ρ450 2E1(CYP2E1)抑制剂筛选所需的药剂如 下：
[0146] (1 )CYP2E1:100mM potassium phosphate(pH 7 · 4)含有10mg/ml Ρ450 protein concentration〇
[0147] (2)Control Protein: lOmg/mL P450 Protein溶于lOOmM Potassium Phosphate (pH 7.4)中。
[0148] (3)Buffer Solution:。·5M Potassium Phosphate(pH 7·4)〇
[0149] Stop Solution：ice-acetonitrile〇
[0150] (4)Cofactors:含有lOOmM NADP+以及lOmM Glucose 6-Phosphate〇
[0151] (5)Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase:2000 units/ml溶于无菌水。
[0152] (6) Chlorzoxazone:受质（substrate)，16mM Chlorzoxazone 溶于10% 甲醇 (Methanol)〇
[0153] (7)DDTC(Diethyldithiocarbamic acid):CYP2E1选择性抑制剂（阳性对照组）， 20mM DDTC容于 10% 甲醇（Methanol)。
[0154] (8)NADPH_regenerating System:于3.42ml中加入530μ1 Cofactors、40yl G6PDH (Glucose6_Phosphate Dehydrogenase Solution)以及 100μ1 Control Protein。
[0155] 2.细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)抑制剂的筛选
[0156] 使用人类肝脏微粒体细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)进行细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂筛选的实验步骤如下所述：
[0157] (1)在4°C冰浴环境下，0 · 1M磷酸缓冲液(pH = 7 · 4)包含0 · 5mg/ml人肝微粒体、5mM MgCl2静置15分钟；
[0158] (2)此时实验组加入细胞色素 P450 2E1反应基质药物16mM Chlorzoxazone以及浓 缩中药药引萃取液;对照组以甲醇:无菌水= 1:1取代中药药引；阳性对照组则以DDTC取代；
[0159] (3)最后加入辅酶ImM NADP+、10mM G6P与2IU G6PD。将反应液转移至37°C水浴预 温(pre-incubation) 1分钟，活性测试实验的反应时间为30分钟；
[0160] (4)反应完后以500L acetonitrile终止反应，样品静置1分钟后加入内部标准品 (5g/mL4-hydroxy-tobutamide)，离心后取上层液20L以甲醇:无菌水作稀释十倍动作，取5L 回溶液注入LC/MS/MS系统进行分析。
[0161] (5)结果分析：将L C / M S / M S测得的讯号数值换算成为C Y P 2 E1代谢物标准品6 -Hydroxy-Chlorzoxazone生成量(pmol)后，以对照组（control)为基准，即对照组的CYP 2Ε1 抑制率为0%，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的CYP 2E1抑制率：
[0163]二、结果
[0164] 1.阳性对照组
[0165] 阳性对照组(DDTC)所测出的CYP 2E1抑制率如表5所示，由表5可知当DDTC的浓度 为100μM时，CYP2El抑制率可达87.56%。
[0166] 表5阳性对照组的CYP 2E1抑制率
[0167]
[0168] 2.试验组CYP 2E1抑制率
[0169] 中药药引所测出的CYP 2E1抑制率如表6所示，由结果可知各中药药引于不同浓度 (66μΜ，33μΜ，16.5μΜ)的条件下，对细胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以66μ Μ正二轻愈疮酸(Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果（96 · 98±0 · 19% )及66μΜ反式肉桂 酸(Trans-Cinnamaldehyde)抑制效果（92 · 81 ±0 · 53% )最佳。
[0170] 表6中药药引的CYP 2E1抑制率

[0173]
[0174] *最小有效剂量:最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
[0175] 赋形剂所测出的CYP 2E1抑制率如表7所示，由结果可知各赋形剂于不同浓度 (0.167 %，0.08 %，0.042 %，w/v)的条件下，对细胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效 果，其中以0.167%鲸蜡醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳(91.24 ±1.33%)。
[0176] 表7赋形剂的CYP 2E1抑制率



[0181]
[0182] *最小有效剂量:最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
[0183] 实施例4酰胺水解酶(amidase)抑制剂的筛选-鼠肝微粒体酰胺水解酶(amidase)
[0184] 一、材料与方法
[0185] 1.试验材料
[0186] Isonicotinic acid以高效能液相层析仪(HPLC-UV)分析定量。所有的有机溶剂均 为HPLC等级，购自 Tedia有限公司（Fairf ield，0H，USA)，isoniazid、isonicotinic acid与 nicotinic acid(内在标准品，internal standard)购自 Sigma化学公司（St · Louis，M0 USA)〇
[0187] 2.试样处理
[0188] 本实验拟以鼠肝微粒体溶液作为amidase酵素来源，isoniazid作为amidase代谢 模式药物，定量isoniazid经amidase代谢生成的代谢物isonicotinic acid(INA)，作为 amidase活性测量的标的，建立amidase体外活性抑制剂筛选平台，HPLC系统包括1个岛津 LC-10AD栗（Shimadzu LC-10AD pump)、1 个岛津系统控制器（Shimadzu system control)以 及1个岛津自动样本机(Shimadzu autosampler)(岛津科学仪器，日本），以C18管柱(颗粒大 小5μπι，内径50父4.6111111，25〇11)并使用含有70%甲醇和30%甲酸铵(5011114!1=2.5)的移动相 进行HPLC分离，实验步骤简述如下：
[0189] (1)鼠肝酵素微粒体溶液制备及蛋白浓度测定。
[0190] (2)取鼠肝微粒体溶液150yL加入100yL isoniazid溶液(3mM溶于)35yL 67mM磷酸 钾缓冲溶液(KH2P03，pH=7)及15yL amidase抑制剂(控制组加入去离子水)混合均匀。
[0191] (3)置于37 °C水浴槽反应30分钟。
[0192] (4)加入300yL 乙晴(acetonitrile，ACN)混匀后静置 6 分钟。
[0193] (5)加入30yL过氯酸混匀后静置6分钟。
[0194] (6)以13000g的转速离心6分钟。
[0195] (7)取100yL离心后上清液注射入HPLC。
[0196] (8)以甲醇：甲酸铵(5〇11^，？!1=2.5) = 70:30(￥/￥)为移动相，控制流速为11111/1^11， 以波长270nm紫外光检测。
[0197] (9)结果分析：将HPLC-UV测得的讯号数值换算成为amidase代谢物标准品 isonicotinic acid生成量(ng/mL)后，以对照组（control)为基准，即对照组的amidase抑 制率为〇%，以下列公式计算各阳性对照组及试验组的amidase抑制率：
[0198]
[0199] 二、结果
[0200] 中药纯成份及赋形剂所测出的Amidase抑制率如表8及表9所示，由结果可知各中 药纯成分及赋形剂于不同浓度的条件下，对Amidase酵素具有不同程度的抑制效果，其中以 100μΜ HUCHE033抑制效果最佳(75·5±2·2%)。
[0201 ] 表8体外筛选中药纯成份所测出的Amidase抑制率
[0202]



[0206]
[0207] *最小有效剂量:最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
[0208] 表9体外筛选赋形剂所测出的Amidase抑制率
[0209]
[0210] *最小有效剂量:最低筛选浓度(mg/L)X人肝肠体积(3L)
[0211]实施例5丙基硫异烟酰胺(PZA)合并使用酰胺水解酶(amidase)抑制剂硝基苯酸磷 酸二酯（BNPP)的动物试验 [0212] -、材料与方法
[0213] 1.试验材料
[0214] 所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司（Fairfield，OH，USA)，PZA， BNPP则购自Sigma化学公司（St. Louis, MO USA)，硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)为文献普遍使用 的酰胺水解酶(amidase)抑制剂，半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备，是将 400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注 射使用。
[0215] 2.试验动物
[0216] 体重为320-350公克的雄性SD( Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心（台 湾），动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行，所有的大鼠均置于空气/湿度调节环境下， 光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在试验期间大鼠体重均持续监测。
[0217] 3.试验处理
[0218] 试验动物随机分成3组，每组包括2种处理，第一种处理为注射50mg/kg BNPP或 BNPP的基剂(vehicle，VEHl，即食盐水），BNPP溶于加热至60°C的食盐水(0.9%NaCl)，冷却 后以lml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第二种处理为注射500mg/kg PZA或PZA的 基剂(VEH2，即食盐水），PZA溶于食盐水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至 大鼠体内；第一种处理(BNPP或VEH1)较第二种处理(PZA或VEH2)早15分钟处理。
[0219] 上述3组试验共包含：
[0220] (1)对照组（normal control group，NC，n= 10):正常的大鼠每天注射1 次VEH1 及 VEH2 (施行腹腔内注射)共49天；
[0221] (2)PZA组（INH，η = 10):正常的大鼠每天注射1次PZA及VEH1 (施行腹腔内注射)共 49天；
[0222] (3)ΒΝΡΡ-ΡΖΑ组(ΒΝΡΡ-ΡΖΑ，η = 10):正常的大鼠每天注射1次ΒΝΡΡ及ΡΖΑ(施行腹腔 内注射)共49天；
[0223] 半乳糖单点法于第49天处理后16小时进行测试。
[0224] 4.血液样本
[0225] 处理完毕后，大鼠以乙醚麻醉牺牲，血液由大鼠背部主动脉抽取，置于含有EDTA的 试管中，血浆（plasma)以13,000g于4°C离心15分钟，分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并置于_80°C中储存。
[0226] 5.生化分析
[0227] 肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以 进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments，美国）。
[0228] 6.光学显微镜与电子显微镜
[0229] 大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析;肝脏样本以10%磷酸缓冲液配制的福尔马 林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片样本以苏木精（hematoxylin)与伊红（eosin)染色，并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切 片以二甲胂缓冲液（〇&(3 〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂（Spurr resin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰（uranyl acetate)及梓檬酸铅（lead citrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）观察。
[0230] 7.肝功能的定量测试
[0231] 所有的大鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，大鼠接受在30秒内的快速静脉注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉； 以半乳糖脱氢酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试 浓度范围为50至1，000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以及变异系数（coefficient of variation,CV)百分比计算，最大 容许的变异系数为10 % CV ;日间差异（day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验;半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分 钟时血液中半乳糖浓度。
[0232] 8.统计分析
[0233]所有的数据皆以平均±标准偏差（SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (AN0VA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性（least significant difference)方法做多重比较，以 确认族群间的显着差异;族群平均的显着差异为P〈〇. 05。
[0234]二、结果
[0235] 1.生化分析结果
[0236] 试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显 着差异;生化分析结果如图11所示，PZA组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺 酶(ALT)活性明显高于对照组(对照组血浆中的AST活性为109±27IU/L;PZA组血浆中的 AST活性为179 ± 10IU/L，p〈0.005;对照组血浆中的ALT活性为43 ± 9IU/L; PZA组血浆中的 ALT活性为91 ± 11IU/L，p〈0.005)，显示PZA组产生生化上的肝损伤;BNPP-PZA血清中转胺酶 浓度则显着低于PZA组。
[0237] 2.组织病理学
[0238]经过为期7周施行腹腔注射500mg/kg/day PZA的大鼠，其体内成功的产生肝毒性； 相对的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图12A所示，对照组大鼠肝实质（liver parenchyma)内的肝细胞排列于自肝小叶中央静脉辐射排列的网状平板内，肝血窦 (hepatic sinusoids)则在两肝板(anastomosing plates)之间被发现;PZA组大鼠的组织 切片则如图12B所示，PZA组大鼠中央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化，然而并无看 到肝细胞坏死(necrosis)的征兆。而BNPP-PZA组大鼠的肝损害程度与对照组相较，并无明 显区别（未显示结果）。
[0239] 3.剩余肝功能的量测
[0240]如图13所示，对照组与PZA组大鼠的半乳糖单点法(GSP)值具有高度的显着差异 (对照组大鼠的 GSP 值为 260±50μg/ml;PZA 组大鼠的 GSP 值为 776±65μg/ml，p〈0.005)Jb 外，BNPP-PZA组大鼠的GSP值为293 ± 61μg/ml，与PZA组相较，具有高度的显着差异（p〈 0.005);单独施用PZA的大鼠的GSP值明显增加;然而，在PZA合并施用BNPP的大鼠则可抵抗 这种改变;而对照组与BNPP-PZA组之间大鼠的GSP值无显着差异存在。
[0241]实施例6异烟碱酰胺（INH)及/或立复霉素(RIF)及/或丙基硫异烟酰胺(PZA)合并 使用CYP2E1抑制剂山奈酚（Kaempferol)或酰胺水解酶（amidase)抑制剂懈皮素 (Quercetin)的动物试验
[0242] 一、材料与方法
[0243] 1.试验材料
[0244] 所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司（Fairfield，OH，USA)，INH、 RIF、PZA、Kaempferol、Quercetin购自 Sigma化学公司（St .Louis，MO USA)，半乳糖注射溶液 由南光化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖（Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶 液系统以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
[0245] 2.试验动物
[0246] 体重为18-25公克的129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授Dr.Gonzalez(美 国），引进公鼠3只，母鼠4只后，自行配对繁殖，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有的小鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在 试验期间小鼠体重均持续监测，所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉，并以眼窝方式进行半 乳糖注射给药，60分钟后由尾静脉采血测GSP值。
[0247] 3.试验处理
[0248] 试验动物随机分成7组，每组包括5种处理，第一种处理为注射Kaempferol 3.78mg/kg或其基剂(vehic 1 e，VEH1，即食盐水），以lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体 内；第二种处理为则注射Quercetin 3.02mg/kg或其基剂(VEH2，即食盐水），Quercetin溶于 食盐水(0.9 %NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第三种处理为注射 50mg/kg INH或INH的基剂(VEH3，即食盐水），INH溶于食盐水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的体 积进行腹腔内注射至小鼠体内；第四种处理为注射l〇〇mg/kg RIF或其基剂(VEH4，即食盐 水），RIF溶于食盐水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第五种 处理为注射250mg/kg PZA或其基剂（VEH5，即食盐水），PZA溶于食盐水（0.9 %NaCl)中，以 lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内。
[0249] 上述5组试验共包含：
[0250] (1)对照组（normal control group,NC，n = 10):正常的小鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2、VEH3、VEH4以及VEH5 (施行腹腔内注射)共21天；
[0251] (2)INH-RIF组（INH-RIF，n=10):正常的小鼠每天注射l次INH、RIF、VEHl、VEH2以 及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
[0252] (3)1(&611^^61'〇1-1順-1?正组（1(&611^^61'〇1-1順-1?正，11=10):正常的小鼠每天注射1 次Kaempferol、INH、RIF、VEH2以及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
[0253] (4)Quercetin_INH-RIF组(Quercetin_INH-RIF，n = 10):正常的小鼠每天注射1次 Quercetin、INH、RIF、VEHl以及VEH5(施行腹腔内注射)共21天；
[0254] (5)INH-RIF-PZA组（1順-1?正-?2厶，11=10):正常的小鼠每天注射1次1順、1?正、？2八、 VEH1以及VEH2 (施行腹腔内注射)共21天；
[0255] (6)Kaempferol-INH-RIF-PZA 组（Kaempferol-INH-RIF-PZA，n = 10):正常的小鼠 每天注射1次Kaempferol、INH、RIF、PZA以及VEH2(施行腹腔内注射)共21天；
[0256] (7)Quercetin-INH-RIF-PZA组（Quercetin-INH-RIF-PZA，η = 10):正常的小鼠每 天注射1次QuerCetin、INH、RIF、PZA以及VEHl(施行腹腔内注射)共21天；
[0257] 4.血液样本
[0258] 处理完毕后，，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心脏采血，置于含有Heparin的试管 中，血衆(plasma)以13,000g于4°C离心10分钟，分离后的血衆分装到微量小管(Eppendorf tube)中并置于_80°C中储存。
[0259] 5.生化分析
[0260] 肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以 进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments，美国）。
[0261] 6.光学显微镜与电子显微镜
[0262] 小鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析;肝脏样本以10%磷酸缓冲液配制的福尔马 林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片样本以苏木精（hematoxylin)与伊红（eosin)染色，并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切 片以二甲胂缓冲液（〇&(3 〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂（Spurr resin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰（uranyl acetate)及梓檬酸铅（lead citrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）观察。
[0263] 7.肝功能之定量测试
[0264] 所有的小鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，小鼠接受在30秒内的快速眼窝注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉； 以半乳糖脱氢酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试 浓度范围为50至1，000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以及变异系数（coefficient of variation,CV)百分比计算，最大 容许的变异系数为10 % CV ;日间差异（day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验;半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分 钟时血液中半乳糖浓度。
[0265] 8.统计分析
[0266] 所有的数据皆以平均±标准偏差（SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (AN0VA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性（least significant difference)方法做多重比较，以 确认族群间的显着差异;族群平均的显着差异为P〈〇. 05。
[0267]二、结果
[0268] 1.生化分析结果
[0269] 试验结束时，测量试验小鼠的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显 着差异；生化分析结果如（图14及表10)所示，当小鼠以50/100mg/kg/day连续给予3周INH/ RIF后，INH/RIF控制组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性明显高 于空白对照组(空白对照组血浆中的AST活性为90 ± 15IU/L; INH/RIF控制组血浆中的AST活 性为571 ± 295IU/L，p〈0.001;空白对照组血浆中的ALT活性为40 ± 5IU/L; INH/RIF控制组血 浆中的ALT活性为364±19211]/1，？〈0.001)，显示1順/1?1?的确对小鼠造成生化程度上的肝 损伤；而以50/100/250mg/kg/day连续给予3周INH/RIF/PZA的小鼠，INH/RIF/PZA控制组血 浆中的AST和ALT活性分别为702±172IU/L及464±72IU/L，显着高于空白对照组及INH/RIF 控制组，显示INH/RIF/PZA的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤，且损伤程度高于INH/RIF 造成的伤害；同时给予CYP2E1抑制剂Kaempferol或酰胺水解酶抑制剂Quercetin的 Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF、Que;rcetin-INH-RIF-PZA、Kaempfe;rol-INH-RIF-PZA实验组血清中转胺酶浓度则接近正常值。
[0270]表 10 对照组、INH-RIF组、KH-1NH-RIF组、KM-1NH-RIF组、KL-1NH-RIF组、ΜΗ-1NH-RIF组、MM-INH-RIF组及ML-INH-RIF组Total HAI score、天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸 转胺酶(ALT)活性分析，数值的计算为mean 土 SD。
[0272] Data are shown as mean土SD.
[0273] *p〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·005:Study compare to control group.
[0274] 2.组织病理学
[0275] 经过为期三周施行腹腔注射50/100mg/kg/day INH/RIF及50/100/250mg/kg/day INH/RIF/PZA的小鼠，其体内确实成功的产生肝毒性;相对的，在空白对照组小鼠体内的肝 结构则较正常；相较于INH-RIF-PZA组，Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF、 Kaempferol-INH-RIF-PZA组和Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠中央静脉周围肝细胞较为完 整，空泡明显较少，发炎细胞亦较少。
[0276] 在评估肝脏病理组织切片严重程度的HAI-score方面，小鼠在连续给予INH/RIF或 INH/RIF/PZA 3周后，确实在Intralobular Degeneration and Focal Necrosis与 I nf 1 amma t i on这两个项目得到积分，且在I NH-R IF及I NH-R IF-PZA控制组中发现有 Piecemeal necrosis，而Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol_INH_ RIF-PZA组和Quercetin-INH-RIF-PZA组与INH/RIF控制组相比则有明显的改善（图16、图 17)。
[0277] 1.剩余肝功能的量测
[0278] INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组的半乳糖单点法(GSP)值有随着INH/RIF给药时间 愈长而愈高的趋势；空白对照组与INH-RIF及INH-RIF-PZA控制组小鼠的GSP值具有高度的 显着差异（空白对照组小鼠的GSP值为177 ± 22mg/L;给药3周后，INH-RIF及INH-RIF-PZA小 鼠的GSP 值各为866±339mg/L，p〈0·001与858±172mg/L，p〈0·001，此外，在Kaempferol-INH-RIF组、Quercetin-INH-RIF、Kaempferol-INH-RIF-PZA组和Quercetin-INH-RIF-PZA组 小鼠之GSP 值为 401 ± 178mg/L、203 ± 76mg/L、273 ± 6 lmg/L、216 ± 67mg/L，与 INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制组小鼠具有高度的显着差异(p〈0.001);显示施用INH-RIF及INH-RIF-PZA控制 组小鼠的GSP值明显增加;然而，并用Kaempferol或Quercetin的小鼠则可抵抗这种改变，空 白对照组与Kaempferol或Quercetin实验组相比时，小鼠之间的GSP值无显着差异存在（图 15)〇
[0279] 实施例7异烟碱酰胺（INH)及立复霉素（RIF)合并使用CYP2E1抑制剂山奈酚 (Kaempferol)、甘露醇Mannitol、邻磺酰苯酰亚胺、鹿糖素 、Dicalcium phosphate、交联聚 乙烯吡咯烷酮的动物试验
[0280] 一、材料与方法
[0281] 1.试验材料
[0282] 所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司（Fairf ie 1 d，0H，USA)，INH、 RIF、Kaempferol、甘露醇Mannitol、邻磺酰苯酰亚胺、鹿糖素、Dicalcium phosphate、交联 聚乙烯吡咯烷酮购自Sigma化学公司（St. Loui s，M0 USA)，半乳糖注射溶液由南光化学制药 股份有限公司制备，是将400克半乳糖（Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张 盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
[0283] 2.试验动物
[0284] 体重为18-25公克的129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授Dr.Gonzalez(美 国），引进公鼠3只，母鼠4只后，自行配对繁殖，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有的小鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在 试验期间小鼠体重均持续监测，所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉，并以眼窝方式进行半 乳糖注射给药，60分钟后由尾静脉采血测GSP值。
[0285] 3.试验处理
[0286] 试验动物随机分成13组，每组包括3种处理，第一种处理为口服Kaempferol 1.67mg/kg，以0· lml/kg的体积给药；或为口服Kaempferol 4.27mg/kg，以0· lml/kg的体积 给药;或为口服Kaempferol 8 · 33mg/kg，以0 · lml/kg的体积给药;或为口服甘露醇Mannitol 0· 17mg/kg，以0· lml/kg的体积给药;或为口服甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，以0· lml/kg的 体积给药;或为口服甘露醇Mannitol 1.67mg/kg，以0. lml/kg的体积给药;或为口服邻磺酰 苯酰亚胺〇.83mg/kg，以0· lml/kg的体积给药;或为口服鹿糖素1.67mg/kg，以0· lml/kg的体 积给药；或为口服邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg+甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，或为口服 Dicalcium phosphate 0·83mg/kg，或处理为口服交联聚乙稀吡略烧酮2·83mg/kg，第二种 处理为注射50mg/kg INH或INH的基剂(VEH1，即食盐水），INH溶于食盐水(0.9%NaCl)中，以 lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第三种处理为注射100mg/kg RIF或其基剂 (VEH2，即食盐水），RIF溶于食盐水(0.9 %NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠 体内。
[0287] 上述5组试验共包含：
[0288] (1)对照组（normal control group,NC，n = 10):正常的小鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2 (施行腹腔内注射)共21天；
[0289] (2)INH-RIF组（INH-RIF，n=10):正常的小鼠每天注射1次INH、RIF(施行腹腔内注 射)共21天；
[0290] (3)KL-INH-RIF组(η = 8):正常的小鼠每天口 服一次Kaempferol 1 · 67mg/kg，注射 1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0291] (4)疆-1順-1?正组(11 = 6):正常的小鼠每天口服一次1^611^^61〇14.1711^/1^，注射 1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0292] (5 )KH-INH-RIF组(η = 6):正常的小鼠每天口 服一次Kaempf erol 8 · 33mg/kg，注射 1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0293] (6)ML-INH-RIF组(n = 8):正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 0.17mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0294] (7)MM-INH-RIF组(n = 6):正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 0.83mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0295] (8)MH-INH-RIF 组(n = 6):正常的小鼠每天口服一次甘露醇 Mannitol 1.67mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0296] (9)SA-INH-RIF组(n = 4):正常的小鼠每天口服一次邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg， 注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0297] (lO)SU-INH-RIF组(n = 4):正常的小鼠每天口服一次蔗糖素1.67mg/kg，注射1次 INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0298] (11 )SAM-INH-RIF组(n = 4):正常的小鼠每天口服一次邻磺酰苯酰亚胺0.83mg/kg +甘露醇Mannitol 0.83mg/kg，注射1次INH、RIF(施行腹腔内注射)共21天；
[0299] (12)D_INH_RIF组（η = 4):正常的小鼠每天口服一次Dicalcium phosphate 0.83mg/kg，注射1次INH、RIF (施行腹腔内注射)共21天；
[0300] (I3)c-INH-RIF组(n = 4):正常的小鼠每天口服一次交联聚乙烯吡咯烷酮2.83mg/ kg，注射1次INH、RIF (施行腹腔内注射)共21天；
[0301] 4.血液样本
[0302] 处理完毕后，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心脏采血，置于含有Heparin的试管中， 血衆（plasma)以13，000g于4°C离心10分钟，分离后的血衆分装到微量小管（Eppendorf tube)中并置于-80 °C中储存。
[0303] 5.生化分析
[0304]肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性以 进行定量，AST与ALT活性是肝脏毒性常用的指标，是以Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments，美国）。
[0305] 6.光学显微镜与电子显微镜
[0306]小鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析;肝脏样本以10%磷酸缓冲液配制的福尔马 林(phosphate-buffered formalin)固定，随后脱水并包埋于石錯(paraffin)中，以5μηι厚 度切片，切片样本以苏木精（hematoxylin)与伊红（eosin)染色，并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain，PAS)，染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切 片以二甲胂缓冲液（〇&(3〇(171&以131^化1〇.11?!17.4)清洗，以20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定1小时，以酒精连续脱水后包埋于Spurr树脂（Spurr resin)中，并以钻石刀切取超薄切片，以醋酸铀酰（uranyl acetate)及梓檬酸铅（lead citrate)作双重染色，并以穿透式电子显微镜（Transmission Electron Microscope, Hitachi 600，Hitachi Co·,日本）观察。
[0307] 7.肝功能的定量测试
[0308] 所有的小鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，小鼠接受在30秒内的快速眼窝注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉； 以半乳糖脱氢酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试 浓度范围为50至1，000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以及变异系数（coefficient of variation,CV)百分比计算，最大 容许的变异系数为10 % CV ;日间差异（day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验;半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分 钟时血液中半乳糖浓度。
[0309] 8.统计分析
[0310] 所有的数据皆以平均±标准偏差（SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (AN0VA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性（least significant difference)方法做多重比较，以 确认族群间的显着差异;族群平均的显着差异为P〈〇. 05。
[0311] 二、结果
[0312] 1.生化分析结果
[0313]试验结束时，测量试验小鼠的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显 着差异；生化分析结果如表11所示，当小鼠以50/100mg/kg/day连续给予3周INH/RIF后， INH/RIF控制组血浆中的天门冬氨酸转胺酶(AST)与丙氨酸转胺酶(ALT)活性明显高于空白 对照组（空白对照组血浆中的AST活性为80±13IU/L;INH/RIF控制组血浆中的AST活性为 420±66IU/L，p〈0.001;空白对照组血浆中的ALT活性为46± 10IU/L; INH/RIF控制组血浆中 的ALT活性为358 ±67IU/L，p〈0.001)，显示INH/RIF的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤； 同时给予CYP2E1抑制剂Kaempferol、甘露醇Mannitol各剂量实验组、血清中转胺酶浓度皆 显着低于INH/RIF控制组。
[0314] 2.组织病理学
[0315]经过为期三周施行腹腔注射50/100mg/kg/day INH/RIF的小鼠，其体内确实成功 的产生肝毒性;相对的，在空白对照组小鼠体内的肝结构则较正常;相较于INH-RIF组，甘露 醇Mannitol各剂量实验组小鼠中央静脉周围肝细胞较为完整，空泡明显较少，发炎细胞亦 较少(图18)。
[0316] 在评估肝脏病理组织切片严重程度的HAI-score方面，小鼠在连续给予INH/RIF 3 周后，Kaempferol、甘露醇Mannitol各剂量实验组与INH/RIF控制组相比则有明显的改善。 [0317] 3.剩余肝功能的量测
[0318] INH-RIF控制组的半乳糖单点法(GSP)值有随着INH/RIF给药时间愈长而愈高的趋 势；空白对照组与INH-RIF控制组小鼠的GSP值具有高度的显着差异(空白对照组小鼠3周的 GSP值为 192 ± 18mg/L;给药3周后，INH-RIF小鼠的GSP值为666 ± 126mg/L，p〈0 · 001，然而， Kaempferol、甘露醇Mannitol、邻磺酰苯酰亚胺、鹿糖素 、Dicalcium phosphate各剂量实验 组的小鼠则可抵抗这种改变，其中空白对照组与KH-INH-RIF组、KM-INH-RIF组、MH-INH-RIF 组、MM-INH-RIF组、SU-INH-RIF组相比时，小鼠之间的GSP值无显着差异存在(如表11)。
[0319] 表 11、为对照组、INH-RIF组、KH-1NH-RIF组、KM-1NH-RIF 组、KL-1NH-RIF组、MH-INH-RIF 组、MM-INH-RIF 组、ML-INH-RIF 组、SA-INH-RIF 组、SU-INH-RIF 组、SAM-INH-RIF 组、 D-INH-RIF组及C-INH-RIF组小鼠半乳糖单点法(GSP)值，数值的计算为mean土SD。
[0320]
[0321] Data are shown as mean土SD.
[0322] *p〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·005:Study compare to control group.
[0323] 实施例8异烟碱酰胺（INH)及立复霉素（RIF)及丙基硫异烟酰胺（PZA)合并使用 CYP2E1抑制剂甘露醇Mann i to 1的动物试验
[0324] 一、材料与方法
[0325] 1.试验材料
[0326] 所有的有机溶剂均为HPLC等级，购自Tedia有限公司（Fairfield，0H，USA)，INH、 RIF、PZA、甘露醇Mannitol购自Sigma化学公司（St.Louis，M0 USA)，半乳糖注射溶液由南光 化学制药股份有限公司制备，是将400克半乳糖(Sigma)溶于1公升含有适当缓冲溶液系统 以及等张盐类的蒸馏水中，供作注射使用。
[0327] 2.试验动物
[0328] 体重为18-25公克的129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授Dr.Gonzalez(美 国），引进公鼠3只，母鼠4只后，自行配对繁殖，动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有的小鼠均置于空气/湿度调节环境下，光照与黑暗各12小时，水及饲料的供给不限，在 试验期间小鼠体重均持续监测，所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉，并以眼窝方式进行半 乳糖注射给药，60分钟后由尾静脉采血测GSP值。
[0329] 3.试验处理
[0330] 试验动物随机分成3组，每组包括4种处理，第一种处理为口服为口服甘露醇 Mannitol 1 · 67mg/kg，以0 · lml/kg的体积给药；第二种处理为注射50mg/kg INH或INH的基 剂(VEH1，即食盐水），INH溶于食盐水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至小 鼠体内；第三种处理为注射l〇〇mg/kg RIF或其基剂（VEH2,即食盐水），RIF溶于食盐水 (0.9%NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第四种处理为注射250mg/kg PZA或其基剂(VEH3，即食盐水），PZA溶于食盐水(0.9%NaCl)中，以lml/kg的体积进行腹腔 内注射至小鼠体内。
[0331] 上述3组试验共包含：
[0332] (1)对照组（normal control group,NC，n = 10):正常的小鼠每天注射1 次VEH1、 VEH2、VEH3 (施行腹腔内注射)共21天；
[0333] (2)1順-1?正-?2六组（1順-1?1?，11 = 6):正常的小鼠每天注射1次1順、1?正、？2六(施行 腹腔内注射)共21天；
[0334] (3)M-INH-RIF-PZA组(n = 6):正常的小鼠每天口服一次甘露醇Mannitol 1.67mg/ kg，注射1次INH、RIF、PZA (施行腹腔内注射)共21天。
[0335] 4.血液样本
[0336] 处理完毕后，，小鼠以乙醚麻醉，血液由小鼠心脏采血，置于含有Heparin的试管 中，血衆(plasma)以13,000g于4°C离心10分钟，分离后的血衆分装到微量小管(Eppendorf tube)中并置于-80 °C中储存。
[0337] 5.肝功能的定量测试
[0338]所有的小鼠均进行半乳糖单点法(GSP)测试，大鼠接受在30秒内的快速眼窝注射， 注射0.4g/ml BW半乳糖溶液0.5g/kg;自注射后60分钟采血一次，血液样本取自尾部静脉； 以半乳糖脱氢酶比色法（colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量，测试 浓度范围为50至1，000μg/ml，每个浓度的日内差异(within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以及变异系数（coefficient of variation,CV)百分比计算，最大 容许的变异系数为10 % CV ;日间差异（day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验;半乳糖单点法(GSP)为30秒注射停止后60分 钟时血液中半乳糖浓度。
[0339] 6.统计分析
[0340] 所有的数据皆以平均±标准偏差（SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (AN0VA)测试法来计算是否具有统计上的显着差异，使用Statistical Package of the Social Science program(Version 13，SPSS Inc.)软件包来计算；随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性（least significant difference)方法做多重比较，以 确认族群间的显着差异;族群平均的显着差异为P〈〇. 05。
[0341] 二、结果
[0342] 1.剩余肝功能的量测
[0343] INH-RIF-PZA控制组的半乳糖单点法(GSP)值有随着INH/RIF给药时间愈长而愈高 的趋势；空白对照组与INH-RIF-PZA控制组小鼠的GSP值具有高度的显着差异（空白对照组 小鼠 3周的GSP值为570 ± 293mg/L;给药3周后，INH-RIF-PZA小鼠的GSP值为948 ± 236mg/L，p 〈0.001，然而，甘露醇Mannito 1实验组的小鼠则可抵抗这种改变(如表12)。
[0344] 表12、为对照组、INH-RIF-PZA组、M-INH-RIF-PZA组小鼠半乳糖单点法(GSP)值，数 值的计算为mean 土 SD 〇
[0345]
[0346] Data are shown as mean土SD.
[0347] *p〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·005:Study compare to control group.
[0348] 实施例9低副作用INH/RIF剂型于健康受试者体内对INH相关代谢酶的影响研究
[0349] 一、材料与方法
[0350] 1.试验处理
[0351] 利用CYP2E1 phenoytping药物Chlorzoxazone 500mg与Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)并服CYP2E1抑制剂甘露醇Mannitol 100mg，于健康受试者进行药 动学比较研究。试验过程中，监测受试者血浆中Chl〇rz〇XaZ〇ne(CZX)及其代谢物的变化情 形，并掌握ALT、AST及GSP值等生化值变化，进而评估健康受试者在有无并服CYP2E1抑制剂 下，研究CYP2E1在健康受试者体内的活性变化情形。
[0352] 2.试验分组
[0353] 本试验全程于三军总医院临床研究中心执行，试验共有2次阶段性给药，每次试验 间隔一周。第1次给药，口服给予国外原厂Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)与 Chlorzoxazone(500mg)，第1次给药后一周，同一批受试者进行第2次给药，给予国外原厂 Rifamate(Isoniazid 150mg/Rifampin 300mg)+甘露酉享Mannitol(100mg)与Chlorzoxazone (500mg)。
[0354] 3 ·评估及统计方法
[0355] 受试者的试验数据及统计分析结果将会作一个整合性概述，药物动力学数据以平 均值及标准差描述，试验中所得到的药动学参数及数据上的显着差异，将会以ONE WAY AN0VA或其它更适切的统计分析方法进行分析。
[0356] 二、结果
[0357] 1.血液分析结果
[0358] 已完成 18人次临床试验，控制组（Chlorzoxazone 500mg+Isoniazid 300mg)9人次 与实验组（Chlorzoxazone 500mg+Isoniazid 300mg+HUCHE033 180mg)9人次。结果显不，并 用HUCHE033组，Chlorzoxazone原型药的药物动力学参数未有显着影响，但其经CYP2E1代谢 的代谢物6H3H Chlorzoxazone的Cmax显着较低，其6-〇H_Chlorzoxazone/Chlorzoxazone代 谢比亦显着低于控制组（图19、图20及表13)。
[0359] 表 13 Chlorzoxazone+Rifamate并服或不并服甘露醇Mannitol，Chlorzoxazone及 其代谢物6-OH Chlorzoxazone于健康受试者的药物动力学参数，数值的计算为mean土SD
[0360]
[0361] Data represent mean土S.D. .\<0.05，^<0.01，^^〈0.005
[0362] *Metabolic Ratio :AUCt6〇H-czx/AUCtczX
[0363] 上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本 发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，例如：异烟碱酰胺（INH)、细胞色素 P450 2E1抑制剂、酰胺水解酶(amidase)抑制剂施用的浓度及比例，以及细胞色素 P450 2E1 抑制剂或酰胺水解酶(amidase)抑制剂选用的种类等变化的等效性实施例，均应包含于本 案的专利范围中。
【主权项】
1. 一种无/低副作用的抗结核病药物复方，其特征在于，包含： (a) 抗结核病药物，其是立复霉素、或丙基硫异烟碱酰胺、或乙酰胺醇、或前述任两种以 上的组合；以及 (b) 至少一种医药上可接受的降低抗结核病药物副作用的物质，其特征在于，所述降低 抗结核病药物副作用的物质选自于下列化合物所组成的群组:正二羟愈疮酸，所述正二羟 愈疮酸的含量为17毫克至10克、（-)-表没食子儿茶素，所述(-)-表没食子儿茶素的含量为 25毫克至10克、茵陈色原酮，所述茵陈色原酮的含量为17毫克至10克、山奈酚，所述山奈酚 的含量为16_克至10克、根皮素，所述根皮素的含量为15晕克至10克、橙皮素，所述橙皮素 的含量为17毫克至10克、6-姜辣醇，所述6-姜辣醇的含量为16毫克至10克、没食子酸，所述 没食子酸的含量为9毫克至10克、异甘草素，所述异甘草素的含量为18毫克至10克、柚皮素， 所述柚皮素的含量为9毫克至10克、二氢化槲皮素，所述二氢化槲皮素的含量为17毫克至10 克、汉黄芩素，所述汉黄芩素的含量为16毫克至10克、原儿茶酸，所述原儿茶酸的含量为8毫 克至10克、儿茶素，所述儿茶素的含量为16毫克至10克、β-奈黄酮，所述β-奈黄酮的含量为 15毫克至10克、恩贝素，所述恩贝素的含量为16毫克至10克、反式肉桂酸，所述反式肉桂酸 的含量为8毫克至10克、表儿茶酚，所述表儿茶素的含量为16毫克至10克、根皮苷，所述根皮 苷的含量为24毫克至10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量为7毫克至10克、大豆苷元， 所述大豆苷元的含量为14毫克至10克、异牡荆素，所述异牡荆素的含量为24毫克至10克、β-香叶烯，所述香叶烯的含量为8毫克至10克、懈皮素，所述懈皮素的含量为0.9毫克至10 克、(+) _朽1檬稀，所述(+)_朽1檬稀的含量为7晕克至10克、杨梅素，所述杨梅素的含量为17_ 克至10克、懈皮，所述懈皮的含量为24毫克至10克、木犀草素-7-葡萄糖苷，所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量为24毫克至10克、桑叶素，所述桑叶素的含量为16毫克至10克、新橙皮 苷，所述新橙皮苷的含量为33毫克至10克、橙皮苷，所述橙皮苷的含量为33毫克至10克、 (-)_表没食子儿茶素，所述(-)_表没食子儿茶素的含量为17毫克至10克、木犀草素，所述木 犀草素的含量为16毫克至10克、金丝桃苷，所述金丝桃苷的含量为25毫克至10克、柽柳素， 所述柽柳素的含量为17毫克至10克、黄芩素，所述黄芩素的含量为15毫克至10克、芸香素， 所述芸香素的含量为15毫克至10克、黄芩，所述黄芩的含量为24毫克至10克、芹菜素，所述 序菜素的含量为15毫克至10克、（ + )_表儿茶素，所述( + )_表儿茶素的含量为16毫克至10克、 (-)_表儿茶素没食子酸酯，所述(-)_表儿茶素没食子酸酯的含量为24毫克至10克、牡荆素， 所述牡荆素的含量为24毫克至10克、金雀异黄酮，所述金雀异黄酮的含量为15毫克至10克、 异鼠李素，所述异鼠李素的含量为14毫克至10克、香叶木素，所述香叶木素的含量为33毫克 至10克、葛根素，所述葛根素的含量为23毫克至10克、或伞形花内酯，所述伞形花内酯的含 量为9毫克至10克、高良姜素，所述高良姜素的含量为0.8毫克至10克、非瑟酮，所述非瑟酮 的含量为0.8毫克至10克。2. 如权利要求1所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方还加入 药学上可接受的赋形剂。3. 如权利要求2所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述赋形剂为稀释剂、填充剂、 结合剂、崩解剂或润滑剂。4. 如权利要求1所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方的剂型 为口服锭剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、芳香水剂、糖浆剂、醑剂、酏剂、酊剂、流浸 膏剂、软膏、乳霜剂、糊剂、注射剂或栓剂。5. -种无/低副作用的抗结核病药物复方，其特征在于，包含： (a) 抗结核病化合物，其是异烟碱酰胺合併选自于由立复霉素、丙基硫异烟碱酰胺以及 乙酰胺醇所组成的群组；以及 (b) 至少一种医药上可接受的降低抗结核病药物副作用的物质，其特征在于，所述降低 抗结核病药物副作用的物质选自于下列化合物所组成的群组:正二羟愈疮酸，所述正二羟 愈疮酸的含量为17毫克至10克、（-)_表儿茶素没食子酸酯，所述(-)_表儿茶素没食子酸酯 的含量为25毫克至10克、茵陈色原酮，所述茵陈色原酮的含量为17毫克至10、山奈酚，所述 山奈酚的含量为16毫克至10克、根皮素，所述根皮素的含量为15毫克至10克、橙皮素，所述 橙皮素的含量为17毫克至10克、6-姜辣醇，所述6-姜辣醇的含量为16毫克至10克、没食子 酸，所述没食子酸的含量为9毫克至10克、异甘草素，所述异甘草素的含量为18毫克至10克、 柚皮素，所述柚皮素的含量为9毫克至10克、二氢化槲皮素，所述二氢化槲皮素的含量为17 毫克至10克、汉黄芩素，所述汉黄芩素的含量为16毫克至10克、原儿茶酸，所述原儿茶酸的 含量为8毫克至10克、儿茶素，所述儿茶素的含量为16毫克至10克、β-奈黄酮，所述β-奈黄酮 的含量为15毫克至10克、恩贝素，所述恩贝素的含量为16毫克至10克、反式肉桂酸，所述反 式肉桂酸的含量为8毫克至10克、表儿茶素，所述表儿茶素的含量为16毫克至10克、根皮苷， 所述根皮苷的含量为24毫克至10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量为7毫克至10克、 大豆苷元，所述大豆苷元的含量为14毫克至10克、异牡荆素，所述异牡荆素的含量为24毫克 至10克、β-香叶烯，所述β-香叶烯的含量为8毫克至10克、懈皮素，所述懈皮素的含量为0.9 晕克至10克、（+)-朽 1檬稀，所述(+)-朽1檬稀的含量为7晕克至10克、杨梅素，所述杨梅素的含 量为17毫克至10克、懈皮，所述懈皮的含量为24毫克至10克、木犀草素-7-葡萄糖苷，所述木 犀草素-7-葡萄糖苷的含量为24毫克至10克、桑叶素，所述桑叶素的含量为16毫克至10克、 新橙皮苷，所述新橙皮苷的含量为33毫克至10克、橙皮苷，所述橙皮苷的含量为33毫克至10 克、（-)_表没食子儿茶素，所述(-)_表没食子儿茶素的含量为17毫克至10克、木犀草素，所 述木犀草素的含量为16毫克至10克、金丝桃苷，所述金丝桃苷的含量为25毫克至10克、柽柳 素，所述柽柳素的含量为17毫克至10克、黄芩素，所述黄芩素的含量为15毫克至10克、芸香 素，所述芸香素的含量为15毫克至10克、黄芩，所述黄芩的含量为24毫克至10克、芹菜素，所 述序菜素的含量为15毫克至10克、（ + )_表儿茶素，所述(+)_表儿茶素的含量为16毫克至10 克、（-)_表儿茶素没食子酸酯，所述(-)_表儿茶素没食子酸酯的含量为24毫克至10克、牡荆 素，所述牡荆素的含量为24毫克至10克、金雀异黄酮，所述金雀异黄酮的含量为15毫克至10 克、异鼠李素，所述异鼠李素的含量为14毫克至10克、香叶木素，所述香叶木素的含量为33 毫克至10克、葛根素，所述葛根素的含量为23毫克至10克、或伞形花内酯，所述伞形花内酯 的含量为9毫克至10克、高良姜素，所述高良姜素的含量为0.8毫克至10克、非瑟酮，所述非 瑟酮的含量为0.8毫克至10克。6. 如权利要求5所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方还加入 药学上可接受的赋形剂。7. 如权利要求6所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述赋形剂为稀释剂、填充剂、 结合剂、崩解剂或润滑剂。8. 如权利要求5所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方的剂型 为口服锭剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、芳香水剂、糖浆剂、醑剂、酏剂、酊剂、流浸 膏剂、软膏、乳霜剂、糊剂、注射剂或栓剂。9. 一种化合物用於制备无/低副作用的抗结核病药物复方用途； 该抗结核病药物是立复霉素、或丙基硫异烟碱酰胺、或乙酰胺醇、或前述任两种以上的 组合； 该化合物係选自于下列物质所组成的群组:正二羟愈疮酸、（-)_表没食子儿茶素、茵陈 色原酮、山奈酚、根皮素、橙皮素、6-姜辣醇、没食子酸、异甘草素、柚皮素、二氢化槲皮素、汉 黄芩素、原儿茶酸、儿茶素、奈黄酮、恩贝素、反式肉桂酸、表儿茶酚、根皮苷、反式肉桂醛、 大豆苷元、异牡荆素、β-香叶烯、懈皮素、（ + )_柠檬烯、杨梅素、懈皮、木犀草素-7-葡萄糖苷、 桑叶素、新橙皮苷、橙皮苷、（-)_表没食子儿茶素、木犀草素、金丝桃苷、柽柳素、黄芩素、芸 香素、黄芩、芹菜素、（ + )_表儿茶素、（-)_表儿茶素没食子酸酯、牡荆素、金雀异黄酮、异鼠李 素、香叶木素、葛根素、伞形花内酯、高良姜素、非瑟酮。10. 如权利要求9所述的用途； 该化合物的特征为，所述正二羟愈疮酸的含量为17毫克至10克、所述(-)-表没食子儿 茶素的含量为25毫克至10克、所述茵陈色原酮的含量为17毫克至10克、所述山奈酚的含量 为16毫克至10克、所述根皮素的含量为15毫克至10克、所述橙皮素的含量为17毫克至10克、 所述6-姜辣醇的含量为16毫克至10克、所述没食子酸的含量为9毫克至10克、所述异甘草素 的含量为18_克至10克、所述柚皮素的含量为9晕克至10克、所述二氢化槲皮素的含量为17 毫克至10克、所述汉黄芩素的含量为16毫克至10克、所述原儿茶酸的含量为8毫克至10克、 所述儿茶素的含量为16毫克至10克、所述β-奈黄酮的含量为15毫克至10克、所述恩贝素的 含量为16_克至10克、所述反式肉桂酸的含量为8晕克至10克、所述表儿茶素的含量为16晕 克至10克、所述根皮苷的含量为24毫克至10克、所述反式肉桂醛的含量为7毫克至10克、所 述大豆苷元的含量为14毫克至10克、所述异牡荆素的含量为24毫克至10克、所述β-香叶烯 的含量为8_克至10克、所述懈皮素的含量为0.9晕克至10克、（ + )-梓檬稀，所述( + )-梓檬稀 的含量为7毫克至10克、所述杨梅素的含量为17毫克至10克、所述懈皮的含量为24毫克至10 克、所述木犀草素-7-葡萄糖苷的含量为24毫克至10克、所述桑叶素的含量为16毫克至10 克、所述新橙皮苷的含量为33毫克至10克、所述橙皮苷的含量为33毫克至10克、所述(-)-表 没食子儿茶素的含量为17毫克至10克、所述木犀草素的含量为16毫克至10克、所述金丝桃 苷的含量为25毫克至10克、所述柽柳素的含量为17毫克至10克、所述黄芩素的含量为15毫 克至10克、所述芸香素的含量为15毫克至10克、所述黄芩的含量为24毫克至10克、所述芹菜 素的含量为15毫克至10克、所述( + )_表儿茶素的含量为16毫克至10克、所述(-)-表儿茶素 没食子酸酯的含量为24毫克至10克、所述牡荆素的含量为24毫克至10克、所述金雀异黄酮 的含量为15_克至10克、所述异鼠李素的含量为14晕克至10克、所述香叶木素的含量为33 毫克至10克、所述葛根素的含量为23毫克至10克、所述伞形花内酯的含量为9毫克至10克、 所述高良姜素的含量为0.8毫克至10克、所述非瑟酮的含量为0.8毫克至10克。
【文档编号】A61K31/192GK105832738SQ201610140172
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2011年4月20日
【发明人】胡幼圃, 杨东和, 熊正辉, 张温良, 石东原, 何欣恬
【申请人】国防教育研究基金会