治疗运动诱导型哮喘的方法

专利名称：：治疗运动诱导型哮喘的方法
技术领域：
：本发明包括这样一些化合物它们优先抑制或结合一种命名为4的磷酸二酯酶同功酶(下文称为PDE4)，而同样或者最好较少结合或抑制所述磷酸二酯酶的第二种形式，因此可用于治疗哮喘患者的运动诱导性支气管收缩。认为是这些同功酶形式是同一种酶不可相互转化构象的不同形式，其区别在于其对洛利普兰的结合亲和力，洛利普兰是一种原型(archtypical)PDE4抑制剂。洛利普兰以高亲和力结合到一种形式的位点，但是以低亲和力结合到另一种形式的催化位点。在此一种形式的位点命名为高亲和力洛利普兰结合位点，而另一种形式的位点则为低亲和力洛利普兰结合位点。还公开了通过优先抑制所述PDE4同功酶的低亲和力型催化位点来选择性治疗运动诱导型哮喘(EIA)的方法。也公开了通过给予优先结合到所述低亲和力结合位点的化合物来治疗(EIA)的方法。本发明的靶酶是其所有不同形式而且分布在所有细胞的完整结构域(andinthefulldomainofitsdistributionsinallcells))的PDE4同功酶。它是一种低Km(cAMPKm＝1-5μM)cAMP-选择性酶，对cGMP几乎没有活性(Km＞100μM)。该类同功酶的成员具有以两种或多种不可相互转化或缓慢相互转化的形式存在的有趣特性，所述各种形式以不同等级效力与洛利普兰和其它PDE4抑制剂结合。因此同一基因产物能以一种以上催化活性构象状态存在。重要的是，不同结合型的相对比例可随组织细胞型而改变。例如，炎性细胞可含有较高比例的低亲和力结合洛利普兰的形式，而脑和壁细胞可含有较高比例的高亲和力结合洛利普兰的形式。本发明特别令人感兴趣的是这类同功酶在炎症和气道平滑肌中所起的作用。研究表明其在各种不同炎性细胞(即肥大细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性白细胞和单核细胞)和气道平滑肌中调节cAMP方面起着重要的作用。本发明的实施特别适用于炎性细胞和气道平滑肌；在人类单核细胞中表达的同功酶类型尤其令人感兴趣。这是因为cAMP为抑制炎性细胞的趋化和活化的第二信使。此外，cAMP介导气道平滑肌松弛。该作用与PDE4在cAMP代谢中的主要作用一起为研究PDE4抑制剂提供了基础由于PDE4抑制剂能够提高白细胞和气道平滑肌的cAMP含量，PDE4抑制剂可能具有抗炎和支气管扩张活性。目前用于治疗炎症和用作支气管扩张剂的PDE抑制剂，例如茶碱和己酮可可碱(pentoxyfyllin)药物，普遍抑制所有组织中的PDE同功酶。显然这些化合物因为它们非选择性地抑制所有组织中的所有或绝大部分种类的PDE同功酶而具有副作用。这是评估这些化合物的治疗范围时要考虑的因素。所述疾病状态可用这类化合物有效治疗，但是可能表现出不需要的次要作用，如果这些次要作用可以避免或降至最少，则可增加治疗某些疾病状态的整体治疗效果。总之，这一信息提示伴随着标准非选择性PDE抑制剂使用的副作用可通过使新型同功酶选择性抑制剂针对目标组织或细胞中的主要PDE而降低。尽管理论上同功酶选择性PDE抑制剂优于非选择性抑制剂，但是迄今为止所测试的选择性抑制剂并没有消除因为抑制在不适当或非目标组织中所述目的同功酶的延伸而产生的副作用。例如，选择性PDE4抑制剂洛利普兰(正被开发为抗抑郁剂)的临床研究表明，它具有治疗精神病活性并产生胃肠反应，如胃灼热、恶心和呕吐。表明登布茶碱的副作用可能也包括胃灼热、恶心和呕吐，登布茶碱为另一种用于治疗多发性梗塞性痴呆的PDE4抑制剂。认为这些副作用是因为抑制中枢神经系统和胃肠道系统的特定的PDE4所致。1986年，Schneider和同事介绍在大鼠脑组织匀浆中存在高亲和力、立体选择性[3H]-洛利普兰结合位点并介绍了其特性。尽管假设这些结合位点为大鼠脑“非钙调蛋白依赖性cAMP磷酸二酯酶”(即PDE4)的催化位点，但是数据显然惊人的异常。在尽管不同但相似的实验条件下，数据显示洛利普兰的Kd＝1nM，而其抑制大鼠脑PDE4活性的Ki＝1μM。因此，洛利普兰对结合位点的亲和力相对于其对催化活性的作用有着1000倍的差异。尽管对PDE抑制作用和竞争结合[3H]-洛利普兰的全面结构活性关系(SAR)未确定，但洛利普兰作为PDE4抑制剂的效力相对于其在所述结合位点的效力显著差异似乎对这两种活性均在同一分子部位的假设的正确性提出质疑。由于这一难题，开始进行了几项研究。一项研究寻求确定洛利普兰的高亲和力结合位点是否存在于与所述cAMP催化位点相同的蛋白质上。另一研究寻求确定抑制PDE4的SAR是否与竞争高亲和力洛利普兰结合位点的SAR相同。第三项研究试图阐明如果有的话，这些发现有什么可能的生物学意义，尤其是当它可能涉及开发新的药物疗法时。从数个测定收集到的数据显示，对抑制剂结合的人单核细胞重组PDE4(hPDE4)存在至少两种结合型。对这些观测结果的一种解释是hPDE4以两种不同的形式存在。一种以高亲和力结合洛利普兰和登布茶碱等，而另一种以低亲和力结合这些化合物。在此我们通过将其称为高亲和力洛利普兰结合型(HPDE4)和低亲和力洛利普兰结合型(LPDE4)来区别这两种形式。这一发现的重要性在于，发现与高亲和力洛利普兰结合型(HPDE4)有力竞争的化合物比那些更有力地与LPDE4(低亲和力洛利普兰结合型)竞争的化合物具有更多的副作用或更强的副作用。进一步的数据表明，化合物可以低亲和力结合型PDE4为目标，并且这一形式不同于洛利普兰为高亲和力结合物的结合型。发现作用于高亲和力洛利普兰结合型与低亲和力洛利普兰结合型的抑制剂存在不同的SAR。此外，这两种形式似乎具有不同的功能作用。因此作用于低亲和力洛利普兰结合型的化合物似乎具有抗炎活性，而作用于高亲和力洛利普兰结合型的化合物产生副作用或副作用更强烈。对于这些发现尚未有清楚的解释。然而，提出所述PDE4能以两种不同的三级结构或四级结构状态存在。认为两种形式均具有催化活性。洛利普兰以高亲和力结合一种形式PDE4的催化位点，此处定义为具有少于10毫微摩尔的Ki，以及以低亲和力结合另一种形式PDE4，此处定义为具有大于100毫微摩尔的Ki。这些发现的有用结果是现在有可能鉴定出优先抑制cAMP催化活性的化合物，此时所述酶PDE4是以低亲和力结合洛利普兰的形式，因而减少了副作用，这些副作用显然与抑制以高亲和力结合洛利普兰的形式有关。因此，本发明提供EIA治疗作用相对于副作用的优良治疗指数。运动诱导型哮喘(EIA)定义为剧烈运动后几分钟发生的暂时性气道阻力增加。EIA影响80％的哮喘患者，并且35-40％的过敏性鼻炎患者发生EIA。在EIA患者，运动导致过度换气、呼吸性水份丢失以及气道温度下将，它们触发气道肥大细胞和循环嗜碱性细胞释放化学物质，这些物质在运动期间介导炎症、粘液分泌、平滑肌收缩和血管舒张。除运动以外，其它因素也可引发暂时性气道阻力增加。这些因素包括但不限于污染物(如SO2)和温度变化，尤其是冷空气引起的温度变化。因此，治疗污染物诱导的哮喘(PIA)和冷空气诱导的哮喘(CIA)也在本发明范围之内。PDE4抑制剂用于治疗这一疾病的基本原理是基于环腺苷酸(cAMP)为介导广泛抑制免疫细胞活性和炎性的第二信使作用，同时基于这样的认识，即PDE4是这些平滑肌中的主要cAMP水解同功酶，尽管它似乎在平滑肌中比在炎性细胞中的作用弱。就本发明目的而言，将所述以低亲和力结合洛利普兰的cAMP催化位点称为“低亲和力”结合位点(LPDE4)，而以高亲和力结合洛利普兰的这一催化位点的另一种形式称为“高亲和力”结合位点(HPDE4)。最初的实验是建立并验证[3H]-洛利普兰结合试验。以下实施例1给出了该项工作的细节。为确定高亲和力结合活性和低亲和力结合活性两者是否位于同一基因产物中，将酵母菌用已知方法转化，然后发酵6小时表达重组PDE4。利用直接抗PDE4的抗体的蛋白质印迹(Westernblot)分析显示，PDE4的表达数量随时间而增加，在生长3小时后达到最高。此外，90％以上的免疫反应产物位于高速离心(100,000×g)酵母溶胞产物的上清液中。同蛋白质表达一起监测[3H]R-(-)-洛利普兰的结合活性和PDE的活性。PDE4活性与洛利普兰的结合活性一起表达，表明这两个功能存在于同一基因产物中。与蛋白质印迹分析的结果相似，发现85％以上的携带洛利普兰(rolipram-inhabitable)PDE活性和[3H]-洛利普兰的结合活性存在于酵母的上清部分。总的说来，在这个系统中表达的大部分重组PDE4为LPDE4而仅有小部分为HPDE4。所以，对重组PDE4催化活性的抑制作用主要反映化合物对LPDE4的作用。因此可将对重组PDE4催化活性的抑制作用用作化合物对LPDE4的效能的指标。而化合物对HPDE4的效能可通过检测它们竞争[3H]R-洛利普兰的能力来评估。为了找到低亲和力和高亲和力两种洛利普兰结合位点的结构活性关系(SAR)，用两种测试系统测定选定化合物的效能。将标准化合物的实验结果制成表。正如所料，与另一个位点即洛利普兰为低亲和力结合物的位点比较，某些化合物在已证实的洛利普兰高亲和力结合位点明显更有效地与[3H]-洛利普兰竞争。高亲和力结合和低亲和力结合之间的SAR相关性差，结论是抑制高亲和力[3H]-洛利普兰结合的SAR与抑制结合低亲和力洛利普兰结合位点的SAR不同。表I提供了所述SAR工作的结果。表I登布茶碱是由SmithKlineBeecham制造的7-丙酮基，1，3-二丁基黄嘌呤。罂粟碱是1-[(3，4-二甲氧苯基)甲基]-6，7-甲氧基异喹啉。曲喹辛是2，3，6，7-四氢-2-(萮基亚氨基)-9，10-二甲氧基-3-甲基-4H-普奈米东基(primido)[6，1-α]异喹啉-4-酮。潘生丁的通用名是2，2’，2”，2-[(4，8-二哌啶子基嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2-6-二基)二次氨基]四乙醇。这些结果说明，与高亲和力型相比，某些化合物能选择性地抑制所谓的低亲和力型，反之亦然。这一发现的意义在于以下情况是可行的通过设计或选择化合物将副作用减至最少，该化合物选择性地(优先)抑制一个位点从而影响所需要的反应，而不影响另一不想要的反应，或至少将非目标反应减少到不干扰预定治疗至不可接受程度的程度。尽管这项工作，我们仍没有确定PDE4同功酶中高亲和力洛利普兰结合和低亲和力洛利普兰结合不同SAR的基础，然而发现如果化合物的IC50比值约0.1或更大，则它具有可接受的治疗指数，所述IC50比值为高亲和力洛利普兰结合型的IC50除以低亲和力结合洛利普兰的形式的IC50计算而得。即，人们现在能够成功地治疗各种免疫性疾病和炎症性疾病，同时一点也不影响其它生理现象或不影响至不可接受的程度。在此最优选的实施方案是抑制低亲和力洛利普兰结合位点作为治疗炎症和变应性疾病的手段。化合物本发明包括IC50比值(高/低结合)约0.1或更大的的化合物。包括任何化合物，所述化合物按照本文提出的测试为PDE4抑制剂而且这些测定或类似测定证实所述化合物的比值在所述定义范围内；特别令人感兴趣的是那些有专利权和/或在本申请提交日没有测试或不是已知PDE4抑制剂的化合物。上表1以及美国专利5,448,686、美国专利5,605,923和美国专利5,552,438给出了符合IC50比值标准的化合物的实例。其中每个申请均通过象该文件中提出的那样全文引用结合到本文中。选择有用化合物的优选技术是确定具有约0.1或更大比值IC50值的化合物的技术，其中所述IC50比值是与1nM的[3H]R-洛利普兰竞争结合高亲和力结合洛利普兰的PDE4型的IC50值与抑制使用1μM[3H]-cAMP作为反应物的低亲和力结合洛利普兰的形式的PDE4催化活性的IC50值之比。本发明的优选化合物是IC50比值大于0.5的化合物，尤其是IC50比值大于1.0的化合物。化合物如顺式-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧苯基)环己烷-1-羧酸盐]、2-甲酯基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧苯基)环己烷-1-酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧苯基)环己烷-1-醇]是优先与低亲和力结合位点结合并且IC50比值0.1或更大的结构的实例。本发明化合物和药学上可接受的盐可以治疗指定疾病的标准方式给予，如口服、胃肠外、舌下、皮肤、透皮、直肠、经吸入或经颊部给药。也可使用控释制剂。本发明化合物和口服给予具有活性的药学上可接受的盐，可配制成糖浆、片剂、胶囊剂、控释制剂或锭剂。糖浆制剂通常包括所述化合物或盐在液体载体如乙醇、花生油、橄榄油、甘油或水和调味剂或着色剂中的混悬液或溶液。所述组合物是片剂时，则可使用常规用于制备固体制剂的药用载体。这样的载体的实例包括硬脂酸镁、白陶土、滑石粉、明胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。所述组合物是胶囊剂时，任何常规包胶囊均适用，例如硬明胶胶囊壳的上述载体。所述组合物是软明胶壳胶囊剂时，可考虑任何常规用于制备分散剂或混悬液剂的药用载体，例如水溶胶、纤维素、硅酸盐或油类，并将其掺入软明胶胶囊壳中。典型的胃肠外组合物包括化合物或盐的无菌水或非水性载体溶液或混悬液，该载体任选包括胃肠外可接受的油，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。典型的吸入组合物是溶液、混悬液或乳剂形式，采用常规推进剂如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷，它们可以干粉或气雾剂形式给药。典型的栓剂制剂包含本发明化合物或其以这一方式给药具有活性的药学上可接受的盐，以及粘合剂和/或润滑剂(如聚合二元醇类、明胶、椰子油或其它低熔性植物蜡或脂肪或它们的合成类似物)。典型的皮肤和透皮制剂包括常规水性或非水性赋形剂，例如霜、软膏、洗剂或糊剂或是含药的膏、贴片或膜。优选所述组合物是单位剂型，例如片剂、胶囊剂或计量气雾剂，以便患者可使用一个剂量。口服给予的每个剂量单位适合含有0.3mg-60mg/Kg、优选1mg-30mg/Kg的化合物或其药学上可接受的盐。优选剂量包括10mg和15mg/Kg。胃肠外给予的每个剂量单位适合含有0.1mg-100mg/Kg的所述化合物或其药学上可接受的盐。鼻内给予的每个剂量单位适合含有1-400mg/人，优选10-200mg/人。局部外用制剂适合含有0.01-5.0％的本发明化合物。可每天给予所述活性成分1到6次，足以显示出所需的活性。优选给予所述活性成分约每日一次或两次，更优选每日两次。本发明化合物可用于预防或治疗所述刺激引起的EIA、PIA和CIA，所述疾病是慢性病症以及间歇性发作病症均可。优选本发明化合物用于长期治疗。预期当按照本发明使用本发明的化合物时，没有不可接受的毒性作用。提供下述实施例用以说明如何实施和使用本发明。它们不以任何方式或在任何程度限制本发明的范围。实施例应用下述五类不同测定方法来获得支持选择IC50比值约0.1或0.1以上的数据。这些测定方法有刺激家兔离体体壁腺产酸；抑制FMLP诱导人中性白细胞脱颗粒(释放髓过氧化物酶)；抑制FMLP诱导豚鼠嗜酸性粒细胞形成O2-；抑制LPS诱导人单核细胞产生α肿瘤坏死因子；使狗呕吐；抑制抗原引起的豚鼠支气管收缩；逆转利血平引起的小鼠低体温；以及抑制LPS诱导过继转移到小鼠的人单核细胞产生α肿瘤坏死因子。这些测定法和数据介绍如下。统计学分析为了检验抑制低亲和力结合位点PDE4与这类化合物的抗炎作用有关，而抑制高亲和力结合位点与某些副作用的产生有关的假设，我们测定了各种PDE4抑制剂在体内和体外阻断炎性细胞功能的能力以及这些化合物在体内和体外模型中产生副作用的能力。为了比较PDE4抑制剂产生特定治疗作用或副作用的能力以及其抑制PDE4低亲和力结合位点的能力和其抑制PDE4高亲和力结合位点的能力，我们通过线性相关(r2)或等级(Spearman’sRho)比较，在体内或体外测定法中这些述化合物的效能和其抗分离酶的催化活性或高亲和力结合位点的效能。线性相关性解决化合物抑制低亲和力结合位点或高亲和力结合位点的效能能否用来预测产生特定抗炎作用或副作用的能力。等级相关性测试产生特定抗炎作用或副作用的等级效力是否与抑制低亲和力位点或高亲和力位点的等级效力相似。均用Macintosh计算机的STATViewII计算机程序计算r2和Spearman’sRho。PDEIV与洛利普兰的高亲和力结合实施例1磷酸二酯酶和洛利普兰的结合测定实施例1A检测到分离的人单核细胞PDE4和重组人PDE4主要存在低亲和力型。因此，可采用1μM[3H]cAMP作为底物，利用测定PDE4催化活性的标准方法(Torphy等，1992)来测试受试化合物抗PDE4低亲和力型的活性。大鼠大脑的高速离心上清液用作蛋白质来源。制备比活为25.6Ci/mmol的[3H]-洛利普兰对映体(enantionmer)。根据公开方法修改标准测定条件以使其与PDE测定条件相同，以下的最后cAMP例外50mMTrisHCl(pH7.5)、5mM氯化镁以及1nM的[3H]-洛利普兰(Torphy等，TheJ.ofBiol.Chem.，第267卷，第3期，第1798-1804页，1992年)。所述测定于30℃进行1小时。终止所述反应并用Brandel细胞收获器分离结合配体与游离配体。在与用于测定低亲和力PDE活性的方法相同条件下(除没有[3H]-cAMP以外)，测定对高亲和力结合位点的竞争性。列于第8页的表1中的数据即用描述于实施例1A的方法获得。实施例1B磷酸二酯酶活性的测定应用按照供应商(AmershamLifeSciences)描述的[3H]-cAMP的闪烁亲近测定法(SPA)或[3H]-cGMP的SPA酶学测定法测定PDE活性。在室温下于96孔板中用0.1ml含终浓度为50mMTris-HCl，pH7.5，8.3mM氯化镁，1.7mMEGTA、[3H]cAMP或[3H]cGMP(大约为2000dpm/pmol)、酶和各种不同浓度的抑制剂的反应缓冲液进行反应。将该测定进行1小时并在有硫酸锌的存在下加入50μl的SPA硅酸钇珠终止反应。振摇所述细胞板并置室温20分钟。通过闪烁光谱测定法检测放射标记产物的形成。用0.05μM的[3H]cAMP测定PDE3和PDE7的活性，而PDE4的活性用1μM的[3H]cAMP作底物来测定。用1μM的[3H]cGMP作底物测定PDE1B、PDE1C、PDE2和PDE5的活性。[3H]R-洛利普兰结合测定将Schneider和其同事们的方法[参见Nicholson等，TrendsPharmacol.Sci.，第12卷，第19-27页(1991)以及McHale等，Mol.Pharmacol.，第39卷，第109-113页(1991)]改良后进行[3H]R-洛利普兰结合测定。R-洛利普兰结合PDE催化位点，参见Torphy等，Mol.Pharmacol.，第39卷，第376-384页(1991)。结果对[3H]R-洛利普兰结合的竞争独立证实了未标记竞争物PDE4抑制剂的效能。该测定在30℃、0.5μl的缓冲液中进行1小时，所述缓冲液含有(终浓度)50mM的Tris-HCl，pH7.5、5mM的氯化镁、0.05％的牛血清白蛋白、2nM的[3H]R-洛利普兰(5.7×104dpm/pmol)和各种浓度的未放射标记的抑制剂。加入2.5ml冰冷的反应缓冲液(不含[3H]R-洛利普兰)终止所述反应，并将反应物通过浸泡过0.3％聚氮杂环丙烷的WhatmanGF/B滤膜快速真空过滤(BrandelCellHarvester)。用另外的7.5ml冷缓冲液洗涤所述过滤膜、干燥并通过液闪光谱检测法计数。实施例2氨基比林的蓄积某些甲基黄嘌呤和其它非选择性PDE抑制剂可在多种物种中增加酸的分泌。某些选择性PDE4抑制剂例如洛利普兰和RO20-1724，可使大鼠酸分泌增强，特别是在联合给予腺苷酸环化酶的活化剂如组胺之后。这种酸分泌的增加伴随着组胺引起的cAMP蓄积性增加。对这些报导的信息进行检测以确定这种现象是否存在。化合物引起酸分泌的能力与其抗低亲和力位点或高亲和力位点的能力有关。用于这一工作的实验方法是弱碱即放射性标记的氨基比林的蓄积，过去的报道将放射性标记的氨基比林用作酸分泌增加的生化标志。所述测定方法如下胃腺准备将家兔(雌性或雄性均可)颈脱臼处死并取出胃。从胃体中剖出粘膜；弃去胃的头部和胃窦部。用改良的Berglindh和Obrink(1976)以及Sack和Spenney(1982)描述的方法分离胃腺。然后剪碎粘膜并用胶原酶将其消化分离出胃腺。将经过消化的所述腺体过滤、洗涤并用培养基重悬成1∶15(体积∶体积)的悬浮液，培养基含下述组分氯化钠132.4mM、氯化钾5.4mM、磷酸氢二钠5.0mM、磷酸二氢钠1.0mM、硫酸镁1.2mM、氯化钙1.0mM、碳酸氢钠12.0mM、兔血清白蛋白2mg/ml、葡萄糖2mg/ml；pH7.4。氨基比林的蓄积为了测定酸分泌，按照Sack和Spinney(1982)的方法，将胃腺与[14C]-氨基比林、不同浓度的选择性PDE4抑制剂、和阈值浓度的组胺(0.3-1.0μM)一起于37℃在水平摇床(110转/分)上培养20分钟。然后将试样离心并测定各等分的所述上清部分和沉淀部分的放射活性。按照Sack和Spinney(1982)描述的方法计算氨基比林的比值。数据表示为最大浓度组胺(100μM)产生反应的百分比。应用每一化合物获得的最大反应通过线性内插法测定EC50值。实施例3选择性PDE抑制剂对狗的催吐效能的测定从动物群体获得杂种狗(每组n＝5，雌雄均可)。禁食一夜后，在实验前至少30分钟给所述狗喂饲半罐狗食(BigBet)。在前腿的头侧静脉放置插管用以给予药物。在给予实验化合物之前用1ml等渗盐水(0.9％)冲洗插管。将化合物溶于聚乙二醇和盐水的混合液中，也可将其溶于100％的聚乙二醇中，以1.0-2.0ml/10kg的体积给予。为确保全部剂量进入循环中，用另外的0.5-1.0ml盐水冲洗插管。将所述动物送到笼子中并观察1小时。观察每只狗的干呕或呕吐体征并记录给予化合物后出现干呕或呕吐的时间。观察结束后，将所述狗送回其笼子。各实验日相隔7天。在连续的实验日期中，将每种化合物逐渐增加剂量给予每只狗，直至观察到催吐作用。此时，各个狗停止实验而仅对还未出现反应的狗进行更高剂量的检测。按照关于定量剂量反应曲线(quantaldoseresponsecurve)的文献所述，数据表示为每一剂量下狗反应的累积百分比。用机率分析法计算ED50值。实施例4豚鼠嗜酸性粒细胞的测定嗜酸性粒细胞的分离和纯化雄性(Hartley，Hazelton实验室)豚鼠在使用前用1ml的马血清注射，每周一次持续4-6周。在注射马血清后至少24小时用氯胺酮/赛拉嗪混合物(88mg；12mg/ml；0.4ml/Kg)麻醉动物。诱导麻醉后腹膜腔用50ml温热无菌生理盐水(0.9％)灌洗。使用14G导管将灌洗液收集到50ml塑料锥形离心管中。使所述豚鼠从麻醉复苏，并且在2周休息期后可再次使用。从所述灌洗液中离心(400xg，10分钟)分离出细胞，并再悬浮于35ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，下层为10ml等渗Percoll(1.075g/ml)。将该悬浮液以300xg离心30分钟。将主要含有嗜酸性粒细胞和红细胞的沉淀物用PBS和红细胞溶解液洗涤。将这些细胞再悬浮于含有20％FBS的RPMI1640培养基中，在湿化的5％CO2培养箱中于37℃培养过夜。第二天将细胞用PBS洗涤并再悬浮，以确定细胞活力(台盼蓝排除)和纯度。超氧阴离子生成(O2-)将纯化的嗜酸性粒细胞(活力＞95％和纯度＞90％)以1-2×106细胞/ml浓度再悬浮于含有20mMHEPES缓冲液(pH7.4)和0.1％明胶的PBS中。将嗜酸性粒细胞(1×105)加入96孔板，于37℃培养约1小时。在反应开始前10分钟加入PDE4抑制剂。在有或无60单位超氧化物歧化酶(SOD)存在的情况下，通过加入细胞色素C(160μM)和甲酰蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP)(30nM)起动该反应。在不同时期以630nm参考波长，在DynatechMR7000平板读数仪上于550nm监测细胞色素C的还原。在数个时间点在有或无SOD存在的情况下，利用各孔的净吸光度通过线性回归分析确定O2-生成率。结果以基础释放校正的对照O2-生成的百分比表示。由于观察到的最大抑制是60％，采用浓度的线性内插法并划界为30％来计算logIC30。实施例5豚鼠的支气管收缩通过在1和4天向每侧股部肌肉注射0.35ml的5％(w/v)卵清蛋白/生理盐水溶液(总量0.7ml)致敏雄性Hartley豚鼠(200-250g/4周龄，HazeltonResearch，Denver，PA)。在25天后豚鼠可以使用。实验步骤对卵清蛋白主动敏感的雄性Hartley豚鼠(600-800gHazelton)在外科手术前约10-15分钟用戊巴比妥钠(40mg/kg腹腔注射)麻醉。颈静脉、颈动脉和气管插管(DeseretIntracathVialon聚合树脂不透射线导管(DeseretMedical，Inc.，Sandy，UT)，分别为22GA和19GA，以及PE管260)分别用于给药、监测血压和通气。进行双侧迷走神经切断术将胆碱能干扰减至最小。将动物麻痹(巴夫龙，0.1mg/Kgi.v.)并经由HarvardRodent呼吸机(683型，HarvardApparatus，SouthNatick，MA)通气(45次呼吸/分钟)。经由侧臂气管插管用Elcomatic传感器(BuxcoElcomatics，Sharon，CT)测定气道压力改变。将通气量设置为产生8cm水柱侧臂压力(约5cc室内空气)。用StathamP23XL物理压力传感器(Viggo-Spectramed，Oxnard，CA)测定血压。将压力记录在GrassModel7D多种波动描记仪上(GrassInstrumentCo.，Quincy，MA)。在整个实验中将所述动物放在加热台上保暖以维持体温。在抗原刺激前10分钟将受试化合物或赋形剂经由静脉注射途径给予。在0时间点，将0.1mg/kg卵清蛋白经静脉注射途径给予。在抗原反应高峰时，给予另一剂量的抗原，0.2mg/kg卵清蛋白。在对累积0.3mg/kg卵清蛋白的抗原反应达到高峰以后，给予饱和KCl溶液(1cc/kg，i.v.)，它能引起最大的支气管收缩。实施例6对LPS诱导人类单核细胞产生TNFα的抑制作用体外研究为了确定TNFα抑制是否与LPDE4或HPDE4的抑制有关，对一系列针对LPDE4和HPDE4的各种效能的PDE4抑制剂，筛选其抑制体外脂多糖类(LPS)刺激人类单核细胞产生TNFα的能力。已知不同物种似乎在炎性细胞中LPDE4和HPDE4对cAMP水解的相对作用显著不同，因此认为初级人细胞用于该筛选是非常重要的。方法用人周围血单核细胞评估对TNFα产生的抑制作用，所述单核细胞从正常人供体血液新鲜获得的血沉棕黄层或血浆去除的残余物中纯化获得(Collata)。单核细胞在24孔多孔板中以1×106个细胞/ml培养基/孔的浓度平板培养。使所述细胞附壁1小时，然后吸出上清液并加入1ml新鲜培养基(含有1％胎牛血清和10U/ml的青霉素/链霉素的RPMI-1640)。在有或无浓度范围为1nM-1mM受试化合物存在的情况下将所述细胞培养45分钟，然后加入LPS(E.coli.055B5，SigmaChemicals)达到100ng/ml终浓度。受试化合物用50∶50浓度的二甲亚砜/乙醇溶解稀释，以使在单核细胞培养基中的最终溶剂浓度为0.5％二甲亚砜和0.5％乙醇。在37℃/5％CO2培养14-16小时后从所述单核细胞移去培养上清液，并以100xG离心去除细胞碎片。既可立即进行细胞因子分析，也可将培养上清液储存在-70℃以备分析用。采用ELISA(Winston)检测TNFα水平，使用小鼠单克隆抗人TNFα抗体(见下文)作为俘获抗体以及多克隆兔抗人TNFα作为第二抗体。为了检测，加入过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体(BoehringerMannheim，Cat.#605222)，随后加入过氧化物酶底物(1mg/ml邻苯二胺和0.1％过氧化脲)。用在大肠杆菌中产生的重组人TNFα绘成的标准曲线来计算样品中的TNFα水平。用改良的Kohler和Millstein(Nature，第256卷，第495-497页，1975)方法，从以重组人TNFα免疫的BALB/c小鼠的脾脏中制备单克隆抗人TNFα抗体。通过用完全弗氏佐剂乳化的重组人TNFα重复免疫新西兰大白兔来制备多克隆兔抗人TNFα抗体。在过继性腹膜炎模型中人TNFα产生的体内抑制方法从未使用任何药物的健康受试者抽取一半单位的肝素化静脉全血。通过在25℃以800xg离心30分钟在Histopaque-1077上分层所述血液来分离多形核白细胞。于25℃以1000rpm离心10分钟，收获淋巴细胞/单核细胞部分并用不含Ca2+和Mg2+的DPBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲生理盐水)洗涤两次。将沉淀物再悬浮于5ml的不含Ca2+和Mg2+的DPBS中，用不含血清的RPMI1640培养基制备的5mlPercoll溶液上于25℃分层，并且在25℃以550xg离心30分钟。取出单核细胞浮层并在25℃用不含Ca2+和Mg2+的DPBS以1000rpm离心10分钟洗涤两次。在25℃将最终洗涤的单核细胞分离物以6-10×106个细胞/ml悬浮于不含Ca2+和Mg2+的DPBS中。通过同样步骤也可从SourceLeukocytes包分离单核细胞。所述单核细胞制品含有65-90％单核细胞并且细胞活力＞97％(台盼兰排除)。将雄性BALE/c小鼠(CharlesRiver实验室，Wilmington，MA)以4或5组饲养在设有持久屏障的设施中。采用轻压有23ga针头注射器的方法将0.5ml的6-10×106个单核细胞/ml注射进入18-25g体重相同年龄的小鼠腹腔内，以使所述单核细胞承受最小的剪切力和应力。在接受单核细胞2分钟内，所述小鼠通过口服给予赋形剂或化合物处理15分钟。然后向所述动物腹腔注射(i.p.)0.2ml溶于不含Ca2+和Mg2+的DPBS中的125mg/ml的内毒素(大肠杆菌，W型，Difco)。2小时后，所述动物用二氧化碳窒息处死，腹腔注射1.5ml不含Ca2+和Mg2+的DPBS(4℃)。轻轻按摩腹部，取出冲洗液并置于冰浴中的聚丙烯试管中。通过离心(4℃12，500xg5分钟)使所述样品澄清。将上清液轻轻倒入新的试管(可储存于-20℃)并通过ELISA进行人和鼠TNFα分析。用标准方法计算ED50值。实施例7人类中性白细胞的方法分离和纯化使用Ficoll(Histopaque1077)梯度离心从肝素化的血液中分离中性白细胞(PMN)，随后通过右旋糖酐沉淀去除红细胞。任何残留红细胞用水溶解30秒，并使用10XDB-PBS(不含Ca2+或Mg2+)恢复等渗。离心分离PMN，用1XDB-PBS再洗涤一次，然后测定细胞数和活力(台盼兰染料排斥)。根据各个供体将细胞数调整为0.75-1.5×106个细胞/ml。脱颗粒(髓过氧化物酶的释放)在37℃震摇水浴中，将上述细胞悬液的等分试样(0.1ml)在含有20mMHEHES缓冲液(pH＝7.4)和0.1％明胶的Earles平衡盐溶液中于5μg/ml的细胞松弛素B存在的情况下培养5分钟。在加入fMLP(30nM)前，再将细胞用各种浓度的选择性PDE4抑制剂和PGE2(3-10nM)预处理5分钟。加入fMLP并连续培养30分钟。通过将所述样品置于冰上终止该反应，随后离心。取出上清液部分并冷冻储存(-30℃)直至测试髓过氧化物酶活性。髓过氧化物酶活性的测定采用邻联茴香胺作为底物和辣根过氧化物酶作为标准品测定髓过氧化物酶活性。将上清液的等分试样(50μl)与100μl底物(邻联茴香胺，0.53mM；H2O2，0.147mM；终浓度)一起在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中温育。加入50μl的4MH2SO4终止该反应。通过在410nm测定吸光度来确定产物生成，而通过与使用辣根过氧化物酶的标准曲线比较测定活性。数据以对照(在PGE2单独存在时髓过氧化物酶释放量)的百分比表示。由于观察到大多数化合物的最大抑制是30％，所以采用浓度划分为15％的线性内插法计算log(IC15)值。实施例8利血平诱导的小鼠低体温的逆转将雄性CF-1或BALB/c小鼠单独隔离在铁丝笼中。在用利血平(10mg/kg，i.p.)预处理之前记录每只鼠的直肠温度。在给予利血平后4小时记录直肠温度，并且每个动物给予不同剂量(口服)的受试化合物、赋形剂或洛利普兰(10mg/kg)。然后每30分钟记录直肠温度共2小时。数据以从给予利血平后4小时观察到的温度的改变(温度降低至基础水平以下约10-15℃)表示。利用处理后90或120分钟记录的温度改变构建剂量反应曲线。通过6-9只动物的均数的几率分析或线性回归分析来确定ED50值。为了比较各化合物逆转利血平诱导的低体温的能力和它们抑制低亲和力结合或高亲和力结合的能力，所述ED50和IC50值以-log(值)表示。实施例9生物学功能和PDE4抑制之间的关系为了确定PDE4抑制的某些生物学作用是否伴随着所述LPDE4或HPDE4的抑制，采用线性和级系相关确定化合物产生作用的能力和化合物抑制LPDE4或HPDE4的能力之间的比较。几个因素能够影响这些相关性1)化合物的稳定性；2)化合物进入细胞的能力；3)在体内研究中，化合物的生物利用度；4)相关值，特别是该线性相关对效能差异敏感，效能值的范围越大，越易于测得显著的线性相关。当用各种测试系统分析和总结LPDE4或HPDE4的抑制和生物功能之间的相关性时应考虑这些警示。利用分离的炎性细胞，单核细胞TNFα生成的抑制和豚鼠嗜酸性粒细胞过氧化物生成的抑制与LPDE4(而非HPDE4)的抑制有较好的相关性。而且，在体内抗原诱导的支气管收缩的阻止同LPDE4的抑制有着更好的相关性(与HPDE4相比)。在这一体内模型中，PDE4抑制剂可能通过阻止肥大细胞脱颗粒而起作用(Underwood等，出版中)。然而，炎性细胞功能的抑制并不总是伴随着LPDE4的抑制，因为发现中性白细胞脱颗粒的抑制同HPDE4的抑制有着更好的相关性(与LPDE4相比)。因此似乎是一些但不是所有炎性细胞活性的抑制伴随LPDE4的抑制。相反，酸分泌的增强、呕吐的产生以及利血平诱导的低体温的逆转(测定PDE4抑制剂治疗精神病潜力)则与HPDE4(而非LPDE4)的抑制有较好的相关性。因此这类化合物的大部分潜在副作用与HPDE4的抑制有关。因此这些发现提示优先抑制LPDE4的化合物将产生有益的抗炎作用并减少潜在的引起不需要的副作用。因此，就以高亲和力结合洛利普兰的PDE4催化型的IC50除以低亲和力结合洛利普兰的形式的IC50(HPDE4/LPDE4)而言，选择具有约0.1或更大的IC50比值的化合物将使它们的治疗指数增加，即将有益作用增至最大而将有害作用减至最小。为了确定这一选择导向是否确实能鉴定出治疗指数改善的化合物，评估比较治疗作用和副作用的三种模型。这包括体外化合物抑制分离的人单核细胞产生TNFα的能力与它们刺激分离的兔壁细胞腺体酸分泌的能力之间的比较，以及两个体内试验比较验证化合物在豚鼠体内阻止抗原诱导的支气管收缩的能力和在狗体内引起呕吐的能力以及化合物在小鼠的过继转移模型中抑制TNFα产生的能力和它们在小鼠中逆转利血平诱导的低体温的能力。具有等于或大于0.1的选择性比值(HPDE4/LPDE4)的PDE4抑制剂在它们的治疗指数方面显示出明显的改善。例如，与原型PDE4抑制剂R-洛利普兰相比，所有具有≥0.1的选择性比值的顺式-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧苯基)环己烷-1-羧酸盐]、2-甲酯基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧苯基)环己烷-1-酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧苯基)环己烷-1-醇]均证明在它们的治疗指数方面有着100倍的改善。因此，这就证明了使用HPDE4IC50/LPDE4IC50≥0.1的选择导向可鉴定体外比较治疗指数增加的化合物。就治疗EIA而言，将所述化合物顺式-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧苯基)环己烷-1-羧酸盐]给予患有EIA的人。这些患者的炎症减轻、支气管舒张和肺的神经性调节。运动激发研究为了在EIA患者中评估顺式-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧苯基)环己烷-1-羧酸盐]的效能、安全性和耐受性，进行了一项随机、双盲、安慰剂对照、两期交叉研究。27例EIA患者随机接受所述化合物、10mgBID立即释放片剂或安慰剂，使用7天后休息7天，再交替治疗7天。在第1天和第7天单个剂量后(用药前和用药后3小时)进行运动激发试验。所述患者群由患有EIA、年龄为18-60岁的不吸烟男性或女性组成，这样使得a)他们在1秒钟内的用力呼气量(FEV1)大于或等于预计正常值的70％，b)在筛选访问时的运动试验反应证明FEV1下降大于或等于15％，和c)他们没有使用吸入的皮质类固醇或其它控制哮喘的药物。所述运动激发方案如下。患者以目标心率在机动踏车上运动六分钟。将速度和斜度调整至使每个患者均达到目标心率，该目标心率是预期的年龄调整的最大值的85％。测试期间患者通过面罩呼吸压缩空气(0％湿度，室温)。在完成所述测试后1、5、10、15、20、30和45分钟进行肺功能试验(KoKopneumotach)，并且如果FEV1没有返回到基线的10％以内则继续进行肺功能试验。主要的效能变量是运动影响下FEV1最大降低百分率(MPD)。结果表明，给予一剂所述化合物后MPDFEV1显著改善，MPD平均值从32.88％降到23.57％。给药7天后，化合物作用增强，MPDFEV1平均值进一步改善，降到21.8％。治疗一周后，接受所述化合物的40％患者在运动后FEV1降至低于或等于15％。所述化合物安全且有很好的耐受性，无与治疗相关的严重的不良反应或撤药。同时参见Am.J.Resp.Crit.CareMed.1998157；A413，将其全文通过引用结合到本文中。所有出版物，包括但不限于本说明书引用的专利和专利申请书，通过引用结合到本文中，正如具体个别指出每个出版物均完全通过引用结合到本文中。权利要求1.一种预防或治疗哺乳动物可能罹患或罹患的运动诱导型哮喘、冷空气诱导型哮喘或空气污染物诱导型哮喘的方法，该方法优先抑制以低亲和力结合R-洛利普兰的PDE4催化型，该方法包括给予其需要患者有效量的IC50比值约0.1或更高的化合物，所述IC50比值为以高亲和力结合R-洛利普兰的PDE4型的IC50除以以低亲和力结合R-洛利普兰的PDE4催化型的IC50。2.权利要求1的方法，其中IC50比值为0.5或0.5以上。3.权利要求1的方法，其中IC50比值为1.0或1.0以上。4.按照权利要求1的方法，其中所给予的所述化合物是作为立即释放或控释口服制剂给予的顺式-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧苯基)环己烷-1-羧酸盐]。5.按照权利要求1或4的方法，其中所述预防或治疗的病症是运动诱发型哮喘。6.PDE4-特异性抑制剂用于生产用于预防或治疗哺乳动物可能罹患或罹患的运动诱导型哮喘、冷空气诱导型哮喘或空气污染物诱导型哮喘的药物的用途，其中所述抑制剂是一种能够抑制以低亲和力结合R-洛利普兰的PDE4催化型的抑制剂，所述方法包括给予其需要患者有效量的IC50比值约0.1或更高的化合物，所述IC50比值为以高亲和力结合R-洛利普兰的PDE4型的IC50除以以低亲和力结合R-洛利普兰的PDE4催化型的IC50。7.按照权利要求6的生产用途，其中所述IC50比值为0.5或0.5以上。8.按照权利要求6的生产用途，其中所述IC50比值为1.0或1.0以上。9.按照权利要求6-8任一项的生产用途，其中所用的所述化合物是顺式-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧苯基)环己烷-1-羧酸盐]，并且生产为口服立即释放制剂或口服控释制剂。全文摘要本发明公开了应用PDE4抑制剂治疗运动诱发型哮喘的方法。文档编号A61K31/275GK1350453SQ00806928公开日2002年5月22日申请日期2000年3月1日优先权日1999年3月1日发明者R·尼曼,T·托尔菲,S·克里斯滕森申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司