专利名称：糖尿肾病和微蛋白尿的治疗方法
背景技术：
糖尿肾病的数量大约占到长期接受肾透析和晚期肾病病人的一半(Robbins，S.L.，et al.“Basic Pathology”，2nd ed.Ch.13W.B.Saunders，Philadelphia，PA 1976)。微蛋白尿是糖尿肾病的前兆(Abbott，K.C.et al.Arch.Intern.Med.154146～153，1994；Neil，A.et al.，Diabetes Care 16996～1003，1993；Mattock，N.B.etal.Diabetes 41736～741，1992)。医疗处理的策略，如，降低血糖处理，抗高血压治疗以及低蛋白进食，能够缓解糖尿肾病和微蛋白尿的临床症状。但是，这样医疗处理必须过细地监视病人，代价昂贵，而且经常招致有害的副作用，特别是当患者的糖尿肾病的状态或者微蛋白尿已经存在一段时间并且蛋白质的摄入已经难于控制时，这样的医疗处理效果降低。由此，需要开发新的、改进的、且有效的治疗糖尿肾病和微蛋白尿的方法。
在另一实施方案中，本发明涉及使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)，丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或者其成分，制备医疗处理糖尿肾病病体的医药。
在再一实施方案中，该方法包括制备中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)或者丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的抽提物步骤，该抽提物用于糖尿病肾病的病体。在可取的实施方案中，抽提物通过煮沸中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)和丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)制备。
在进一步的实施方案中，所说方法包括确定糖尿病体尿中蛋白质的水平，将糖尿病体尿中蛋白质的水平与控制水平进行比较，给予中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)，丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)或者其成分，以使糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。在一可取的实施方案中，给予糖尿病体使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)或者丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的抽提物。
仍是在实施方案中，医疗方法通过确定糖尿病体尿中蛋白质的水平，将其与控制水平进行比较，以评价糖尿肾病的病体，然后确定，为将病体尿中蛋白质的水平降低到控制水平，所给予糖尿病体的中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)，丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)或者其成分的量。
另一实施方案包括，将精酸无机盐给予糖尿肾病病体。
在另一实施方案，本发明涉及使用精酸无机盐或者精酸模拟物的盐制备治疗糖尿肾病的药品。
在另一实施方案，本发明包括确定糖尿病体尿中蛋白质的水平，将其与控制水平相比较，再给予精酸无机盐，以使糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到控制水平。在一可取的实施方案中，本发明的方法中，使用的精酸无机盐是精酸B的镁盐或者精酸B模拟物的镁盐。
本发明的方法能够医疗处理，依赖胰岛素的病体和不依赖胰岛素病体的糖尿肾病。
本发明还涉及通过给予中草药丹参(Salviae MiltiorrhizaeRadix herb)，丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radixmimic)或者其成分，医疗处理微蛋白尿。
在另一实施方案，本发明涉及使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)，丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或其成分，或者中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)，丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的抽提物制备医疗处理微蛋白尿的药品。
在实施方案中，方法包括制备中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)或丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的抽提物，以及将抽提物给予表现微蛋白尿的病体。在一可取的方案中，抽提物是用煮沸中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)或丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)制备。
在本发明另一实施方案，表现微蛋白尿病体尿中蛋白的水平先被确定，再将尿中蛋白水平与控制水平进行比较。给予表现微蛋白尿病体使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)，丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)或者其成分，以使其尿中蛋白的水平恢复到接近控制水平。
在另一实施方案，方法还包括制备中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)或丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)抽提物的步骤。在可取的反案中，抽提物是通过煮沸中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)或丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)制备。
在一实施方案中，本发明涉及，通过确定糖尿病体尿中蛋白质的水平，将其与控制水平相比较，医疗评价糖尿肾病病体的方法。确定给予糖尿病体使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)，丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或者其成分的数量，以使病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
另一方案包括，通过给予表现微蛋白尿的病体使用精酸无机盐医疗处理微蛋白尿。
本发明的实施方案也涉及到使用精酸无机盐制备医疗处理微蛋白尿病体的药品。
在实施方案中，处理病体微蛋白尿的方法包括，确定病体尿中蛋白的水平，将尿中蛋白的水平与控制水平比较，给予病体使用精酸无机盐，以使表现微蛋白尿病体尿中蛋白的水平恢复到接近控制水平。
在另一实施方案，医疗评价微蛋白尿病体的方法包括，确定病体尿中蛋白的水平，将尿中蛋白的水平与控制水平相比较，然后确定将病体尿中蛋白的水平恢复到控制水平所使用精酸无机盐的量。
还有一实施方案，本发明涉及给予糖尿病体使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)的代谢物，以治疗糖尿肾的方法。
在另一实施方案，本发明涉及使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)，丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或者其成分的代谢物，制备治疗病体糖尿肾的药品。
在进一步的实施方案中，发明涉及治疗糖尿病体糖尿肾的方法。确定糖尿病体尿中蛋白质的水平，然后将尿中蛋白质的水平与控制水平比较。给予糖尿病体使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)的代谢物，以使糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
在另一实施方案，方法涉及通过确定糖尿病体尿中蛋白质的水平以及将此尿中蛋白质的水平与控制水平比较，医疗评价糖尿肾病的病体。然后，为使病体尿中蛋白质的水平降低到控制水平，给予糖尿病体使用的中草药丹参(Salviae MiltiorrhizaeRadix herb)，丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radixmimic)或者其成分代谢物的量得到确定。
在又一实施方案，本发明涉及通过给予病体使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)代谢物，治疗病体微蛋白尿的方法。
本发明的另一实施方案是，使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)、丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或其成分、或者中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)或丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的抽提物的代谢物，制备治疗病体微蛋白尿的药品。
在另一实施方案，本发明涉及，通过形成中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)的代谢物以及给予病体使用该代谢物，治疗病体微蛋白尿的方法。
在进一步的实施方案，发明涉及治疗病体微蛋白尿的方法，该方法要确定病体尿中蛋白的水平，将该蛋白水平与控制水平比较，然后再给予病体使用中草药丹参(Salviae MiltiorrhizaeRadix herb)的代谢物，以使病体尿中蛋白的水平恢复到接近控制水平。
在另一实施方案，本发明涉及医疗评价微蛋白尿病体的方法，该方法通过确定病体尿中蛋白的水平，尿中蛋白水平与控制水平比较，然后确定，使病体尿中蛋白水平恢复到接近控制水平，给予病体使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)、丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)或者其成分的代谢物的量。
本发明的叙述提供了医疗处理糖尿病肾和微蛋白尿的方法。举例来说，要求权利的发明的先进性包括，按有价值效果的方式医疗处理病体的糖尿病肾和微蛋白尿，没有明显有害副作用，特别是，病体已经处于长期患病状态，而且医者的策略也难于再有增补的情况。要求权利的方法提供了有效的方法，治疗和减轻糖尿病体肾病的严重性和最后肾衰竭。
所以，使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)医疗处理，能够有效延缓、逆转或者消灭糖尿病肾或者微蛋白尿的发展，因此提高了生活质量，延长生命预期，没有肾渗透和器官移植那样的侵入性的医疗干扰。
本发明附图的简单说明
图1图解说明，无糖尿病的对照(-●-)、没有医疗处理的糖尿病(-■-DM)、以及用精酸无机盐医疗处理的糖尿病(-▲-DM-Tx)每天尿蛋白排泄率(mg/d)。导致糖尿病8周后，如箭头所示，再用精酸无机盐医疗处理。
图2图解说明，对高葡萄糖(HG)导致肾小球细胞中蛋白质活化酶C(PKC)增加，用精酸无机盐(25或50微克/毫升)医疗处理的效果。
图3图解说明，对高葡萄糖(HG)导致肾小球细胞TGF-beta分泌物增加，用精酸无机盐(25或50微克/毫升)医疗处理的效果。
图4图解说明，对高葡萄糖(HG)导致从肾小球分泌纤维结合蛋白，用精酸无机盐(25或50微克/毫升)医疗处理的效果。
图5图解说明，对高葡萄糖(HG)导致肾小球细胞中磷酸化的细胞外信号调节活化酶(ERK-P)增加，用精酸无机盐(25或50微克/毫升)医疗处理的效果。
图6图解说明，对在高葡萄糖条件培养的肾小球细胞中总ERK(ERK-T)合成，用精酸无机盐(25或50/毫升)处理的效果。
图7图解说明，对在高葡萄糖条件培养的肾小球细胞中磷酸化的促分裂活化蛋白酶(MEK-P)合成，用精酸无机盐(25或50微克/毫升)处理的效果。
图8图解说明，对高葡萄糖导致肾小球细胞中磷酸化和非磷酸化的MEK(MEK-T)，用精酸无机盐(25或50微克/毫升)处理的效果。
本发明的详细叙述在权利要求书中，更具体地描述和指出，即包括本发明的步骤也包括其组合的特征和详情。应当理解，本发明具体的实施方案旨在说明本发明，并不限定本发明。不脱离本发明的范围，在各种实施方案中都可以使用本发明的主要特征。
本发明涉及到这一发现，使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)医疗处理，降低了表现为糖尿肾病的病体尿中蛋白质的水平。特别是发现，该中草药的煮沸抽提物降低表现糖尿病肾的糖尿病人尿中出现的总蛋白质。
“糖尿肾病”是指肾脏疾病或紊乱，使肾脏功能发展到、或者就是部分糖尿病的条件。糖尿病肾可以是肾脏或者其它器官有害影响肾脏完成生理功能的能力的主要病理的结果。肾脏疾病直接和/或间接影响糖尿病肾。
糖尿病肾可以用，糖尿病体的尿蛋白质的水平大于0.15克/24小时指示。使用常规医疗标准，本领域技术人员能够诊断表现糖尿病肾的病体。“糖尿病体”是指这样的个体，其没有胰岛素依赖性糖尿病mellitus(NIDDM)，或者有胰岛素依赖糖尿病mellitus(IDDM)。此处所说“个体”是指任何哺乳动物。哺乳动物可以是啮齿动物，如鼠类，几尼猪；家庭动物，如狗，猫；反刍动物，如马，牛；或者灵长动物，如猿或者人。本文中人体也称作“患者”。
词字“IDDM”可以替换成1-型糖尿病，“NIDDM”可以认为等同2-型糖尿病(Principles of Internal Medicine，Fauci，A.S.et al.，eds.，14 ed.，McGraw-Hill，New York，1988)。1-型糖尿病可以在生命的前20年出现，在病体的任何年龄发展。1-型糖尿病表现出的特征是，多尿、食欲增加、体重减轻、血浆胰岛素水平低和不断的酮酸中毒，beta-胰脏细胞破坏，胰岛素治疗和限制饮食。2-型糖尿病经常是逐渐发作的缓和型糖尿病，一般见于35岁以上的肥胖个体。2-型糖尿病的血浆胰岛素水平是正常～高，但是相对血浆葡萄糖的水平仍然偏低，罕见酮酸中毒。但是可能出现高渗透性血清导致的昏迷。2-型糖尿病对限制饮食或者口服降低血糖剂有回应，但是糖尿病的并发症和退化性的变化还是继续发展。为将糖尿病患者分成胰岛素依赖、非胰岛素依赖所建立的医疗标准是众所周知的(如，World Health Organization，WHO Expert Committee onDiabets Mellitus.Second Report.Ggeneva.Tech.Rep.No.6461980)。
中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)可以广泛提供。该中草药也用于治疗人类的其它疾病，如月经紊乱、经期延长、月经过多、失眠、血液循环疾病、胸绞疼、感染炎症、以及某些肾病《见Pharmacopoeia Committee of the HealthMinistry of the People’s Republic of China(ed.)“pharmacopoeia ofPeople’Republic of China”Vol.1，page 62～63，Guang DongScientific Technologic Publisher，Guangdong，(1995)；Chiang SuNew Medicinal College(ed.)，“Dictionary of Chinese Crude Dtrugs”Shanghai Scientific Technologic Publisher，Shanghai，pages478～482(1977)；Namba T.，“The Encyclopedia of Wakan-YaKu(Traditional Sino-Japanese Medicines)With Color Pictures”Vol..1，page 24～25，Hoikusha Publishing Co.Ltd，Osaka(1993)；Yokozawa，T.et al Nippon Jinzo Gakkai Shi 37105～111(1995)；Yokozawa，T.et al Nippon Jinzo Gakkai Shi 32893～898(1990)；Yokozawa，T.et al Nippon Jinzo Gakkai Shi 311091～1098(1989)；Guoji Y.et al，Phytotherapy Research 8337～341(1994)；Jin，et al，J.Chinese Materia Medica(China)22236～238(1997)；K.et al.JP07048265(1995)；Yokozawa，T.et al，Natural Medicine51287～292(1997)》。所引用文献全部并于此处。另外，人体消耗所用中草药是安全的。
名词“中草药丹参”是西文“Salviae Miltiorrhizae Radixherb”，也可以互相变换使用西文“Salviae Miltiorrhizae Bunge”或者“dry root of Salviae Miltiorrhizae Bunge”以及“Danshen”。
丹参模拟物的西文是“Salviae Miltiorrhizae Radixmimic”，它也是指草药，如此处所述，其与丹参有相同的生物活性。本文中名词“生物活性”是指中草药丹参的能力减轻了糖尿病体的症状，或者说减轻了与糖尿病肾相关的特征，例如，减少了尿蛋白。因此，丹参模拟物与使用丹参后观察到的(减少尿中蛋白)相同，也至少减轻与糖尿病肾相关的一种症状的严重性。
当对所说中草药或者其模拟物来说，“有效量”定义为按其数量或剂量给予糖尿肾病的病体，该量是足够产生治疗效果，也就是该量足够减少糖尿肾病病体尿中蛋白质的水平。在一实施方案中，丹参和其模拟物是作为一次剂量供给；而在另一实施方案中，丹参或其模拟物是作为多次剂量供给。
本发明还涉及，使用中草药丹参(Salviae MiltiorrhizaeRadix herb)、丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radixmimic)或者其成分，制备治疗糖尿病体的糖尿肾病的药品。
本发明的方法包括，给予有效量的丹参或者丹参模拟物水基抽提物，例如甲醇、乙醇、水，以减轻糖尿病体的糖尿肾病。具体讲，该方法包括给予煮沸的水基抽提物。
此处的名词“煮沸的水基丹参抽提物”也指“中草药抽提物”或“抽提物”，是中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)、丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)的制剂，其制备包括将干燥的丹参或其模拟物与溶剂混合，溶剂的实例有蒸馏水、甲醇，生理缓冲溶液。抽提物通过适当的装置过滤，将固体颗粒从液体中分离，适用的过滤装置有纱网，Whatman滤纸、尼龙66膜过滤器。抽提物的体积可以通过适当的方法减少，例如沸腾、减压蒸发，旋转蒸发、或冷冻干燥。为在本发明的方法中使用，也可以将抽提物进一步加工，得到其组分，即精酸无机盐，如精酸B的镁盐。
在一可取的实施方案中，按照重量/体积为1∶6～2∶10的比例将中草药与蒸馏水混合，然后，将混合物在常压下煮沸1～3小时，直到液体体积减少40～80％，制备出煮沸的水基抽提物。然后，将抽提物冷却到室温(18～25℃)，再利用重力通过适当的滤器过滤，适用滤器的实例有纱网、WhatmanNol滤器和尼龙66膜过滤器。另外水基抽提物也可以通过真空灭菌过滤，例如使用Nalgene 0.2微米滤器。煮沸水基抽提物分成三等分，每天三次给予患者，例如早、午、晚饭前给药。可以每天制备新鲜的水基抽提物，也可以制备一周消耗的水基抽提物，在4℃贮存备用。
本发明的另一方面涉及，对糖尿病肾者尿中蛋白质水平进行确定，以及将此蛋白质水平与控制的尿中蛋白质水平进行比较。这样，制成的中草药抽提物按有效量给予糖尿病体，将糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。在用中草药或其抽提物治疗前、治疗中、和/或治疗后，可以在一个或者多个时间点测定尿中蛋白质的水平。
此处定义的“控制”水平是指，年龄、性别、种族及健康史与被治疗的病体相配的、没有糖尿病肾体的尿蛋白水平，也就是目标水平。例如，控制水平可以是所期待的个体的尿蛋白质水平。按本发明的方法治疗，所期待的尿蛋白水平可以是没有糖尿肾病体正常水平，也可以是，比没有糖尿肾病体的正常水平高、但是又比糖尿肾病体的低、的水平。所期待的水平也可以是低于治疗以前的任何尿中蛋白质水平。对于糖尿肾病患者，尿中蛋白的“目标水平”可以根据糖尿病体发展成糖尿肾病以前的尿中蛋白质水平、或者与没有糖尿肾病者的尿蛋白水平比较，进行选择。
中草药的抽提物给予糖尿病体后，测定尿蛋白的水平，再与控制水平比较。如果需要，为了对照控制水平降低尿蛋白水平，可以给糖尿病体增加中草药抽提物的剂量。用所说中草药或者其抽提物正在治疗的病体尿中蛋白质的水平与控制水平比较后，再决定治疗进程和进一步所需要的剂量。
这样，当治疗后观察到的水平接近目标水平时，治疗后的尿中蛋白质水平是在接近控制水平，与从没有糖尿肾病的个体观察到的水平比较，或者偏高，或者偏低。总之，与治疗前相比，用所说中草药、或其抽提物，或其模拟物治疗后，病体尿中蛋白质水平是降低了。
使用本领域众所周知的常规试验，测定典型的尿中蛋白质水平。适用的方法包括，测尺，免疫沉淀，浊度(磺基水杨酸、三氯乙酸、benzethonium chloride)试验，染色结合试验(如，Coomassie Blue，Ponceau)，Biuret(如，用Tsuchiya试剂沉淀)试验，以及Folin-Lowry试验(参见”Oxford Textbook of ClinicalNephrology”eds.Davison，A.M.，et al.2nd edition，OxfordUniversity Press，New York，1998；“Primer on Kidny Diseases”ed.Greenberg，A.，2nd edition，Academic Press，Mew York 1998)。
在另一实施方案，本发明涉及医疗评价有糖尿肾病的糖尿病体的方法。测定糖尿病体尿中蛋白质水平，再将尿中蛋白质水平与控制水平比较。然后，确定为了使病体尿中蛋白质水平降低到接近控制水平，给予糖尿病体的中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)、丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或者其成分的量。
也在本发明的一实施方案中，糖尿肾病是通过给予糖尿病体使用有效量的精酸无机盐，以减轻糖尿肾病，进行治疗。在另一个实施方案中，本发明涉及，使用精酸无机盐或者精酸的模拟物盐制备治疗糖尿病体的糖尿肾病所用医药。
名词“精酸无机盐”及参照此处的“精酸”在本文定义为一组合物的组分，其来源是先制成中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)或者丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的水基抽提物，再按照修正后的前文所述的方法色谱分馏得到。参见文献所述(Tanaka，T.et al.Chem.Pham.Bull.37340～344，1998；Yokozawa，T.et al.Jap.J.Nephrol.311091～1098，1989；Yokozawa，T.et al.Nephron7588～93，1997)，所引用文献全部并于此处。举例来说，精酸无机盐可以是钠、钾、钙、铵、镁盐，或者其任何组合盐。如实施例所说明，精酸无机盐减少了胰岛素依赖和非胰岛素依赖糖尿病体尿中的蛋白质。
丹参的水基抽提物与醇型溶剂混合，接着再用有机抽提和色谱分馏，得到精酸无机盐。具体来说，中草药按1∶3～1∶10的重量/体积比与50～95％的甲醇混合后，于室温，18～25℃，放置2～5天。再将得到的混合物过滤，如用Whatman No.1滤器重力过滤、或者用尼龙66膜滤器真空过滤，得到固体颗粒部分和液体抽提物部分。含中草药抽提物的液体部分经历减压(5～10mmHg，18～25℃，15分钟～2小时)，减小了体积，除掉了甲醇，由此生成水基抽提物。水基抽提物再用己烷、二乙醚、二氯甲烷和乙酸乙酯抽提，每种溶剂四次，每次200～400毫升，除掉可溶性有机物。水相可以通过冷冻干燥浓缩，得到可见固相材料。从100克丹参中能抽提出约10～30克固相材料。得到的固相材料还可再悬浮到适当溶液中，例如，缓冲溶液(PBS，HEPES)或者色谱洗脱液(v/v/v＝3∶1∶3的异丙醇/水/乙酸乙酯)。通过色谱分馏(直径7cm，长20cm，70～230目硅胶，流速10ml/10min)，用异丙醇/水/乙酸乙酯的比例为v/v/v＝3∶1∶3的混合液洗脱，从所说固体材料能得到精酸无机盐。
Rf值为0.50～0.75的色谱分馏物中含有精酸无机盐。相对于蒸馏水或适当缓冲溶液，如磷酸盐缓冲盐水、或瑞格溶液，含精酸无机盐的分馏物可以并合，也可以在4℃24小时透析(Mrcutoff 3500)，或者冷冻干燥。代表性的精酸无机盐的产量是每100克丹参1～2克。精酸无机盐悬浮在适当的缓冲溶液(PBS，HEPES)或者介质(DMEM)中，当需要时，使用前再浓缩，过滤或者冷冻干燥。精酸无机盐可以在给予病体前灭菌过滤，如使用0.22微米或者0.45微米的Nalgene滤器。在色谱分馏物中存在精酸无机盐可以依靠使用核磁共振(1H NMR或者13NMR)，质谱，碎片质谱，红外光谱或者本领域公知的其它适当手段确认。
精酸无机盐的分子量一般在700～800分子量单位之间，是咖啡酸(caeffic acid)的四聚物。本发明方法使用的精酸无机盐的一个实例产生的碎片离子在APCI-LC-质谱的数据是500～525(518更可取)m/z，480～495(492更可取)m/z，345～360(353更可取)m/z，315～325(321更可取)m/z，290～300(295更可取)m/z，260～275(269更可取)m/z，190～210(196更可取)m/z，170～185(178更可取)m/z和130～145(134更可取)m/z。
另外，利用含KBr分散体固相红外光谱，也能使精酸特征化，例如，带氢键的酚羟基/芳羟基在3400(bR)/2900λ(cm- 1)；酯羰基在1721λ(cm-1)；共轭羰基在1600λ(cm-1)；羧羰基在1520(s)λ(cm-1)；对称伸展的羧羰基在1400(w)λ(cm-1)；以及-O-O-伸展在1290λ(cm-1)。
当参照精酸无机盐的量使用词“有效量”时，其定义是精酸无机盐的“量”或者“剂量”，按照该量给予糖尿病体，该量就足以产生治疗效果，也就是该量足以降低表现出糖尿肾病的糖尿病体尿中蛋白质的水平。精酸无机盐或者精酸B的镁盐，可以按单剂供给，也可按多剂供给。
在一实施方案中，使用精酸无机盐治疗糖尿病体，结果使尿中总蛋白质水平降到比治疗前观察到的水平低。在具体实施中，给予精酸无机盐之后尿中蛋白质的水平能够降低到其接近控制水平。
在一可取的实施方案中，本发明的方法包括，使用从中草药抽提出的或适当化学方法合成出的精酸B的镁盐、或者精酸B模拟物的镁盐，治疗依赖胰岛素、和不依赖胰岛素表现出糖尿肾病的糖尿病体。从中草药制成精酸B的镁盐的适当方法是已知的。参见文献(Tanaka T.et al.Chem.Pharm.Bull.37340～3441989；Yokozawa T.et al.Jap.J.Nephrol.311091～1098 1989；Yokozawa T.et al.Nephron7588～93 1997；Yokozawa T.et al.Exp.Toxic.Pathol.4934～346 1997)，全部文献内容并于此处。
本文定义的“精酸B模拟物的镁盐”是指表现出与精酸B的镁盐有相同生物活性的任何(小有机分子)分子。例如，一种精酸B模拟物的镁盐能够减轻与糖尿肾病相关的至少一种症状的严重性，这与给予精酸B的镁盐后观察到的效果相同，也就是减少了表现出糖尿肾病的糖尿病体的蛋白尿。这样，将精酸B模拟物的镁盐给予表现出糖尿肾病的糖尿病体，能够降低尿中蛋白质的水平。
在另外实施方案，本发明涉及医疗评价糖尿肾病糖尿病体的方法。测定糖尿病体尿中蛋白质的水平，再将尿中蛋白质的水平与控制水平相比较。然后确定，使病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平，给予糖尿病体的精酸无机盐的量。
本发明还涉及，使用中草药丹参(Salviae MiltiorrhizaeRadix herb)或精酸无机盐(精酸B的镁盐)，或者其模拟物，治疗表现出微蛋白尿的病体。在可取的实施方案中，精酸无机盐是精酸B的镁盐。
在另一实施方案中，本发明涉及，使用中草药丹参(SalviaeMiltiorrhizae Radix herb)、丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)或者其成分，或者中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)或丹参的模拟物(SalviaeMiltiorrhizae Radix mimic)的抽提物，制备医疗处理微蛋白尿病体所用药品。也在实施方案中，发明涉及使用精酸无机盐制备医疗处理微蛋白尿病体所用药品。
名词“微蛋白尿”是指尿白蛋白的排泄速度在20～200微克/分钟或者30～300毫克/24小时状态下的任何疾病、紊乱、不宁或者健康状态。参见文献(Abbott K.C.et al.Arch.InternalMed.154146～153 1994)，全部文献内容并于此处。在本领域，发现和诊断微蛋白尿的方法是公知的，其包括放射性免疫测试，乳体免疫测试，氟免疫测试，酶免疫测试，凝集抑制法，免疫比浊法，免疫悬液法，以及放射免疫扩散测试。参见文献(KeenH.et al.Lancet 2913～916 1968；Silver A.et al.Clin.Chem.321303～1306 1986；Close C.et al.Diabet.Med.4491～492 1987；Harmoinen A.et al.Clin.Chim.Acta 16685～89 1987；Marre M.etal.Clin.Chem.33209～213 1987；McCormik C.P.et al.Ann.Clin.Lab Sci.19944～951 1989；Cambiaso C.L.et al.Clin.Chem.34416～418 1988；Niwa T.et al.Clin.Chem.Acta 186391～3961990)全部文献内容并于此处。在用所说中草药丹参，丹参的模拟物，精酸无机盐，精酸B的镁盐，或者精酸B模拟物的镁盐治疗之前和之后，测定尿中白蛋白或总蛋白质的水平，然后再针对经历治疗的每个病体的需要，调整减轻微蛋白尿所需要的治疗频率和剂量。由于微蛋白尿与糖尿病体的糖尿肾病相关，所以，应预料到，本发明的方法能够用于阻止微蛋白尿的发展，也就防止了糖尿肾病的发展。参见文献(Mattock M.B.et al.Diabetes 41736～741 1992；Neil A.et al.Diabetes Care16996～1003 1993；Abbott K.C.et al.Arch.Intern.Med.154146～153 1994)，全部文献内容并于此处。
中草药丹参的水基抽提物或者精酸B的镁盐，能够按照减轻微蛋白尿的有效剂量，给予表现微蛋白尿的病体。减轻微蛋白尿的有效剂量是指中草药丹参、丹参的抽提物、丹参的模拟物、精酸B的镁盐，或者精酸B模拟物的镁盐的一个量，该量能够恢复尿中白蛋白的水平。最可取的实施方案中，尿中白蛋白的水平恢复到接近对照者的水平。名词“恢复”是指尿中白蛋白的水平返回到，病体没有发展成微蛋白尿之前观察到的水平，或者从对照者观察到的水平。中草药丹参或精酸无机盐能够用于防止微蛋白尿的发展。
控制水平，当参照治疗表现微蛋白尿的病体时，定义如同前文对糖尿肾病所述，只是控制水平是参照尿白蛋白水平，而不是对表现出糖尿病肾的病体所述的总蛋白质水平。
本发明还涉及医疗评价微蛋白尿病体的方法。测定病体尿中白蛋白的水平，将尿中白蛋白的水平与控制水平相比较。然后再确定，使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平，使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix herb)、丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)或者其成分的量。
在另一实施方案中，本发明涉及医疗评价微蛋白尿病体的方法。测定病体尿中白蛋白的水平，将此尿中白蛋白的水平与控制水平相比较。然后确定，使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平，所用精酸无机盐的量。
还可以看到，色谱分馏出的、含有精酸无机盐或者精酸B的镁盐的其它成分，也可以在本发明的方法中，减轻糖尿病体的糖尿肾病或者减轻病体的微蛋白尿。
色谱分馏出的、含有精酸无机盐或者精酸B的镁盐的其它成分的生物活性，能够评价出，例如使用体内和体外生物试验评价。作为说明，生物活性可以在体外评估，使用培养的肾小球细胞，看其能力是否能，降低葡萄糖导致的蛋白酶C的活性增加；TGF-beta-l的合成和分泌；纤维结合蛋白的合成；ERK的磷酸化；或如本文所述的其任何结合。另外，生物活性也可在体内评估，看其能力是否能降低表现出糖尿肾病的糖尿病体尿蛋白的排泄速度，是否能将表现出微蛋白尿的病体的尿白蛋白水平恢复到控制水平。
还应看到，精酸无机盐或者精酸B的镁盐之中的部分也能用于本发明的方法。此处所说的精酸无机盐或者精酸B的镁盐的“部分”是指精酸B的镁盐之中的任何部分，只有该部分能够减轻糖尿肾病的任何症状，如降低糖尿肾病病体尿中的蛋白质、将微蛋白尿病体尿中白蛋白的水平恢复到控制水平、或者防止表现微蛋白尿的病体的糖尿肾病发作。例如，精酸B的镁盐的部分可以是精酸B的镁盐的代谢产物。代谢产物可以是，例如，从给药后精酸无机盐的破裂、酶降解、或酶加工(胃或肠酶加工，得到的代谢物)所得到的精酸B的镁盐的部分。
还可看到，利用本领域公知的合成技术能够设计、并生产出生物活性的精酸无机盐，精酸B的镁盐，或者其“部分”。举例来说，可以根据精酸B的镁盐和其代谢物的已知结构，合成分子。合成出的精酸B的镁盐、精酸B的镁盐的部分、或者精酸B的镁盐的代谢物，应该具有与从中草药丹参得到的精酸无机盐或者精酸B的镁盐相同的生物活性，也就是，能够降低糖尿病肾病体尿中已经升高的蛋白质水平，或者将表现微蛋白尿病体的尿白蛋白水平恢复到接近控制水平。涉及到溶解性、稳定性、以及对水解和蛋白质水解的敏感性中的一种或多种性质，合成的精酸无机盐、精酸B的镁盐、其代谢物、或者其“部分”，比从中草药抽提出的精酸无机盐或者精酸B的镁盐，具有生物学上的优越性。
对表现出糖尿肾病的病体，本发明的方法还能减少，潜含在肾小球基膜累积中的细胞内的胞间蛋白质和细胞信号分子的产生和分泌。例如，在肾小球细胞中，减少了纤维结合蛋白的合成及分泌，也伴随着蛋白质活化酶C活性减少，TGF-beta、磷酸化ERK和MEK的水平也降低。
另外，在治疗过程中，为确定中草药丹参、丹参的模拟物、精酸无机盐或者精酸B的镁盐的效果，在监视尿中蛋白质(白蛋白或总蛋白)水平的同时，也可以监视其它生理参数。所说其它生理参数可以是，例如，肌酸酐、血尿氮水平或者其组合。在使用丹参、丹参模拟物，精酸无机盐或者精酸B的镁盐之前、期间和/或之后，可以在一个或者多个时间点，评价这些生理参数。在本领域，有各种适当的测试方法评价这些生理参数。
给予本发明中草药丹参的抽提物、精酸无机盐、精酸B的镁盐或者其模拟物，完成本发明的方法，可以通过肠道或者非肠道的给予方法。常规的给予是通过口服摄食，如饮剂、片剂或胶囊形式，或者肌肉注射中草药的抽提物、精酸无机盐或者精酸B的镁盐。围绕本发明的其它常规给予方式包括，静脉内、动脉内、腹腔内或者皮下，以及鼻内给予。也可以使用栓剂或者皮肤局部给药。
中草药丹参的抽提物、精酸无机盐、精酸B的镁盐或者其模拟物可以单独给予患者，也可以组合给予患者。组合给予的意义包括同时、或者随后，逐个或者组合，给予所说抽提物、精酸无机盐、精酸B的镁盐、或者其模拟物。当逐个给予所说抽提物、精酸无机盐或者精酸B的镁盐时，可取的给药形式进行的要彼此充分按时紧密衔接，例如，给予所说抽提物要紧密按时与给予精酸无机盐衔接，这样才能对糖尿肾病或微蛋白尿产生最大疗效。显然，可以使用多种路线，如肌肉内、口服皮肤，给予所说中草药、抽提物、精酸无机盐、精酸B的镁盐，或者其任何组合。
中草药丹参的抽提物、精酸无机盐、或者精酸B的镁盐可以单独给药，也可以与常用的赋型剂掺合在一起给药，如，医药学、或生理学可接受的、有机或无机的、适合肠道或者非肠道使用的载体，只要其不与抽提物发生有害反应。适合的医药可接受的载体包括水、盐溶液、如瑞格溶液、醇、油、凝胶、碳水化合物、如乳糖、多糖或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯基pyrolidine。这样的配方可以灭菌消毒，如果需要，还可搀和辅剂，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、调整渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等，这些都不与中草药丹参、丹参抽提物、精酸无机盐或者精酸B的镁盐发生有害反应。这样的配方，如果需要，还可以结合其它抑制代谢降解的活性物质。可取的中草药丹参抽提物的给药方式是口服，如饮用。可取的精酸无机盐或者精酸B的镁盐的给予方式是肌肉注射。参照所希望达到的效果，也就是减轻糖尿肾病或者微蛋白尿，中草药丹参的抽提物、精酸无机盐、或者精酸B的镁盐单独，或者与添加剂结合给药，可以在一个治疗时期按一个或者多于一个剂量给药。
当需要或者希望使用非肠道给药时，特别适合丹参抽提物、精酸无机盐或者精酸B的镁盐的添加物是可注射的、消毒溶液，可取的是油基或水基溶液，以及悬浮液、乳化液，或者包括栓剂的植入剂。非肠道给药的具体载体包括，葡萄糖水溶液、盐水、纯水、乙醇、丙三醇、亚丙乙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯嵌段聚合物等。安瓶是十分方便单位剂量。丹参抽提物、精酸无机盐或者精酸B的镁盐也可以结合到脂质体中，或者穿透皮肤的吸入或贴片方式给药。在本领域，适当本发明使用的医药添加剂是公知的，如医药科学所述。参见文献(PharmaceuticalSciences 17th.Ed.Mack Pub.Co.Easton PA；以及WO 96/05309)全部文献内容合并在此处。
给与病体的剂量和频率(单剂量或者多剂量)要依赖多种因素改变，所述因素包括，糖尿肾病或者微蛋白尿的病程，病体是依赖胰岛素、还是不依赖胰岛素的糖尿病，给药的路线，身高，年龄，性别，健康情况，体重，躯体质量指数，能接受的限食，被治疗的紊乱的自然及发展症状(糖尿视网膜病)，并发治疗的种类(胰岛素)，糖尿肾病、微蛋白尿的综合程度，以及其它与健康状态相关的问题。其它医疗组合或者药剂也可以与本发明的方法和中草药丹参抽提物结合在一起使用。例如，伴随给予中草药丹参抽提物，可以限食降低蛋白质。完成包括给药频率和持续时间的剂量调整和操作，都在本领域技术人员的能力之内。下述实施例进一步说明本发明，但是决不构成对本发明的限制。
根据世界健康组织建立的标准(WHO Expert Committee onDiabetes Mellitus.Second Report.Geneva.Tech.Rep.No.6461980)，所用患者都有2-型糖尿病，NIDDM。尿蛋白质水平高于0.15g/24h.指示糖尿肾病。没有患者有其它病史能导致、或者诊断出其它肾病能导致尿蛋白质水平高于0.15g/24h.。2位患者有视网膜病，1位有微动脉瘤，还有位有棉-毛斑。
如实施例1所述，患者每天三次，早、午、和晚饭前饮用煮沸过的丹参抽提物约150毫升。所有患者同时使用口服非胰岛素的降血糖剂格列喹酮(gliquidone)治疗。在使用煮沸过的丹参抽提物治疗之前，和紧接用丹参治疗之后，取每位患者的血样和尿样。收集的血样和尿样使用标准的、公认的原始记录，血液葡萄糖水平，血液尿氮水平和总蛋白质水平(such asChemstrip and Accu-Check 3 Blood monitor system of BoehringerMannheim Biochemicals.Indianapolis，IN to measure bloodglucose levels)。
使用丹参抽提物的治疗效果在几个指数上表现，如表2-3中所示，尿蛋白质，血红蛋白Alc(HbAlc)，禁食血浆葡萄糖(FPG)，血液尿氮(BUN)，和肌酸酐水平。这些数据是以平均值±SD表示20判定数据。治疗前和治疗后，平均值之间统计意义上的差别是使用学生的T-试验确定。
在用中草药丹参抽提物治疗后，在禁食血浆葡萄糖和血液尿氮水平(见表3)、收缩和舒张血压、肌酸酐和血红蛋白(Hb)Alc的水平中，都观察不到统计意义上的区别。这些数据说明，本发明的方法提供了方便的、经济有效的、灵验的改善糖尿肾病导致机能退化的方法。
表2治疗前和治疗后的生理参数
表3用抽提物治疗前和后的尿蛋白质、血液尿氮(BUN)和肌酸酐水平
实施例3精酸无机盐的制备按照经过修改的前述方案，从中草药丹参抽提物制备出精酸无机盐。在室温，100克丹参与800毫升80％的甲醇混合3天。通过纱，重力过滤除掉不溶物后，在减压条件除去液体中的甲醇。滤液的水层顺序用己烷、二乙醚、二氯甲烷和乙酸乙酯抽提，每种300毫升，四次。得到的水层冷冻脱水产出30克固体物质。以SiO2为基质，体积比3∶1∶3的异丙醇、水、乙酸乙酯的混合液洗脱，色谱分馏冷冻后的固体物质，得到精酸无机盐。从100克丹参，生产出的精酸无机盐约1.01克。
实施例4用精酸无机盐治疗糖尿病鼠，降低尿蛋白质排泄速度3～4月龄，250～300克重(Sprague-Dawley)鼠，逐个单独圈养在灭菌且隔绝微生物、特定的无病护理设备的笼中。鼠的食物是标准固体鼠食，水任鼠饮用。保持25℃的温度和40％的湿度，控制室内12小时光亮、12小时黑暗的循环。
随机将鼠分成三个试验组，1组10只是无糖尿病对照组，2组10只是不进行治疗的糖尿病组，3组10只精酸无机盐治疗的糖尿病组。单独静脉注射在每千克0.1M柠檬酸缓冲溶液中有50毫克的、PH值为4.5的、新制备的链脲菌素(STZ)，导致胰岛素依赖糖尿病(Schmidt R.E.et a1.Diabetes 45(3)284～2901996)。注射STZ三天后，当非禁食血浆葡萄糖的水平高于17mmol/L，就认为鼠患糖尿病。给予STZ八周后，每天按每千克体重20毫克精酸无机盐的剂量，肌肉注射八周，用精酸无机盐给动物治疗。
在治疗处理之前和自始至终的治疗期内，每周记录体重。在注射STZ后的第8、12、16周，测定24小时尿和糖基化血红蛋白的水平。尿样进行10分钟3000转离心处理，以及使用标准技术的上清液分析，测定肌酸酐和蛋白质水平。
给予STZ导致鼠患糖尿病，见表4，经过STZ处理的鼠的血液葡萄糖水平明显升高。如图1中所示，与没有治疗的糖尿病鼠比较，用精酸无机盐治疗明显降低糖尿病鼠的尿蛋白质水平。精酸无机盐治疗的糖尿病鼠的尿蛋白质水平接近在对照鼠、就是在没有糖尿病鼠中观察到的水平。
精酸无机盐治疗没有明显降低糖尿病鼠的血糖水平，如表4所示。与没有糖尿病的鼠相比较，糖尿病鼠的糖基化血红蛋白血浆水平明显偏高，而其体重明显偏低。没有糖尿病的鼠的几个生理血浆参数的水平(BUN、Uric Acid、Cholesterol、Albumin)，都与糖尿病鼠相同，见表4，与此同时，某些血液细胞参数(hemoglobin Alc、percentage of reticulocytes and whiteblood cells)又与糖尿病鼠不同，见表5。因此，从中草药丹参抽提物衍生出的精酸无机盐减轻了糖尿肾病的相关症状，同时不改变其它生理参数。
表4对STZ导致的糖尿病鼠，精酸无机盐效果的生理参数
表5精酸无机盐对血液细胞的效果
注HbAlc(血色素Alc)，HCT(血流比容)；Hb(血色素)；PLT(血小板)；RBC(血红细胞)；WBC(血白细胞)；MCH**p＜0.01vs.对照实施例5精酸无机盐降低，在肾小球细胞中高糖导致细胞信号分子和细胞外基质的产生和排泄的活性和水平在高葡萄糖条件培养肾细胞，进行试验研究，表明高糖导致糖尿肾病。高糖条件培养的人和鼠的肾小球细胞中，细胞外的基质分子，如IV胶原质、薄片蛋白和纤维结合蛋白的合成都受到刺激(Ziyadeh FNet al.J.Clin.Invest.932431～2437 1994；Kagami S.et al.JournalClin.Invest.932431～2437 1994；Ayo SH.Et al.Am.Journal Pathol.1361339～1348；1930；Ayo SH.et al.Amer.Journal.Shysiol.260F185～191 1991；Danne TM et al.Diabetes 42170～1771993)。作为模型系统，在高葡萄糖(30mM)和正常葡萄糖(5.5mM)条件下培养肾小球细胞中，用以认识精酸无机盐对细胞外基质蛋白质的合成和分泌以及其细胞调节的作用。
细胞培养试验使用鼠科动物肾小球细胞。肾小球细胞(MES-13)从转基因鼠克隆出。试验使用初始培养细胞的第25代。MES-13细胞在(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)介质中生长，(DMEM)介质温度37℃，处于5％二氧化碳和95％空气的潮湿气氛中，介质含有15％的胎牛血清(FBS)、1％链霉素和青霉素混合物、0.2微克/毫升的两性霉素B、44毫摩尔碳酸氢钠和14毫摩尔海波(HEPES)。利用含0.5毫摩尔EDTA和0.025％胰岛素的汉克(Hanks)平衡盐溶液中的胰蛋白酶化作用，从已经融合的贮存培养基接种次培养，次培养在含15％胎牛血清(FBS)的DMEM介质中生长24小时，到接近铺满融合(80％)。接近融合的细胞用无血清的DMEM介质温育到停止细胞生长，并使细胞培养同步化。24小时后，介质换成不含血清、但是含有5.5毫摩尔(正常)或者30毫摩尔(高糖)葡萄糖的DMEM介质，细胞培养再进行5天。然后，细胞用25微克/毫升或者50微克/毫升精酸无机盐温育24小时。
精酸无机盐降低高糖导致的蛋白质活化酶C的活性在糖尿病中蛋白质活化酶C(PKC)的活化传递下流信号，并且激活MAPK串(Hanada M.et al.Diabetes 46847～8531997)。MAPK的活化，通过MEK，能够负责在糖尿病的肾小球中过多合成细胞内基质蛋白质(Hanada M.et al.Diabetes46847～853 1997)。MAPK是磷酸化的、并且活化Elk-l，其是三元复合要素之一(Janknecht R et al.EMBO J.125097～51041993)。Elk活化之后增加c-fos和c-jun的表达，并且在糖尿病体中过多合成细胞内基质蛋白质(Studer RK et al.Diabetes42118～126 1993；Ayo SH et al.Am.Journal Pathol.1361339～13481930；Ayo SH et al.Amer.Journal Physiol.260f185～191 1991；Haneda M et al.Diabetologia 34198～200 1991；Fumo P.et al.Am.Journal Physiolo.267F632～F638 1994)。所以，使用肾小球细胞培养，评价精酸无机盐改变葡萄糖导致的PKC增加的能力。
使用商品试剂盒(Upstate Biotechnology，Lake Placid NY)测定，30毫摩尔(高糖)和5.5毫摩尔(正常)葡萄糖存在条件细胞培养的溶胞产物中PKC的量。简要地说，10微升基底混合物，10微升抑制剂混合物或者稀分析缓冲溶液II，10微升脂质活化剂(使用前，至少在冰上声振1分钟)，10微升PKC(25～100毫克提纯酶/化验)，10微升冷却的三磷酸腺苷和〔32P〕ATP混合物添加到灭菌的微型离心管中，用稀分析缓冲溶液II将最后的体积调整到60微升。稀分析缓冲溶液I和II由试剂盒的制造商提供。反应混合物在30℃温育10分钟后，(25微升)置于P81试纸平面上成斑，简单地用0.75％磷酸溶液洗涤，再用丙酮洗涤。将试验纸面装入管型瓶，再利用放射性闪烁计数测定。PKC的活性用p摩尔/分钟/蛋白质(pmol/min/protein)表示。使用不配对或者配对的学生T-试验确定组之间明显差别的统计意义。
如图2所示，与在5.5毫摩尔葡萄糖(正常、对照)中细胞培养相比，在30毫摩尔(高糖)葡萄糖存在条件下细胞培养5天的PKC活性明显(p小于0.01)较高。将精酸无机盐添加到细胞培养中，结果明显(p小于0.01)改变了PKC活性。对葡萄糖导致的PKC活性，精酸无机盐的效果是依赖剂量的。50微克/毫升或者25微克/毫升的精酸无机盐都降低了PKC的活性，见图2。这些数据说明，用精酸无机盐处理细胞能够降低葡萄糖导致的PKC水平，这就向下调整了潜含在糖尿肾病中的细胞信号路径。
制备Western印迹的溶胞产物和介质进行Western印迹试验，以评价多种参数水平的相对改变，其中包括肾小球细胞胞液和30毫摩尔高糖或5.5毫摩尔正常糖条件的培养介质中的MEK1和MEK2蛋白质(MEK-T)；磷酸化MEK1和MEK2(MEK-P)；ERK1和ERK2(p42/p44)蛋白质(ERK-T)；磷酸化ERK1和ERK2(ERK-P)；TGF-betal以及纤维结合蛋白。
等分份的肾小球细胞胞液或者培养介质添加到SDS-胶体电泳试样缓冲溶液，然后加热到95℃，保持15分钟。细胞胞液和培养介质试样中的蛋白质浓度，用Lowry法以BSA为标准进行测定(Lowry O.H.et al.J.Biol.Chem.193265～275，1951)。MEK-T，MEK-P，ERK-T，ERK-P，TGF-beta 1以及纤维结合蛋白质的标准施用到，带细胞胞液和培养介质～12.5或5％的聚丙烯酰胺的平行电泳路径，然后进行电泳。使用标准技术方案，使电泳分离出的蛋白质传输到硝化纤维膜上(Ausubel etal.“Current Prorocols in Molecular Biology”J.W.Wiley & SonsNew York NY 1998)。
带着对MEK-T，MEK-P，ERK-T，ERK-P，TGF-beta1或者纤维结合蛋白是第一抗体的Western印迹在室温温育2小时(Ha H.et al.J.Pharmacol.And Exp.Therap.28 11457～14621997)。再将印迹膜置于PBS-Tween-20(体积比0.3％)中洗涤1小时，然后，按照本领域公知的常规方案(See Ausubel et al.“Current Protocols in Molecular Biology”J.W.Wiley & Sons NewYork NY 1998)，带着过氧化物结合的第二位抗体在室温温育2小时。洗涤后，通过增强化学冷光检出抗原抗体(AmershamInternational，England)并且测出光密度数据。
精酸无机盐减少葡萄糖导致的TGF-beta 1合成和分泌TGF-beta 1是通过培养的近侧小管，肾小球的内皮、上皮和肾小球细胞表达(Kaname S，et al.Kidney Int.1319～1327 1992；Haberstroh U，et al.Am.Journal Physiol.264F1966～F205 1993；MacKay K，et al.Journal Clin.Invest.831160～1167 1989；ZiyadehFN，et al.Journal Am.Soc.Nephrol.230 1991)。在试验的肾小球性肾炎中，TGF-beta 1潜含在肾小球膨胀的发病机理中(BorderWA，et al.Nature 360361 1990；Border WA，et al.Kidney Int.41566～570 1992)。暴露给高浓度葡萄糖，在培养的肾小球细胞中mRNA编码的TGF-beta 1成倍增加(Wolf G，et al.Kidney Int.42647～656 1992)。增加的TGF-beta 1表达是与肾脏肥大联系在一起，是试验导致和人类糖尿肾病的早期特征。用胰岛素治疗使血液葡萄糖水平正常化，削减了TGF-beta l表达的增量(Border WA，et al.Diabetes Meab.Rev.12309～339 1996；Shankland Sj，et al.Kindey Int.46430～442 1994)；而且TGF-beta1导致培养细胞肥大(Border WA，et al.Diabetes Meab.Rev.12309～339 1996)。由于这些资料指明，TGF-beta 1参与糖尿肾中的肾脏肥大和基质膨胀，也就评价了精酸无机盐对葡萄糖导致的TGF-beta 1的合成和分泌增加的效果。
在高浓度葡萄糖(30毫摩尔)存在条件的肾小球细胞培养中，TGF-beta 1的分泌明显增加，如图3所示。添加25或50微克/毫升的精酸无机盐减少了高糖(30毫摩尔)条件肾小球细胞培养中TGF-beta 1的分泌，如图3所示。
精酸无机盐减少了葡萄糖导致的纤维结合蛋白的合成和分泌如图3所示，与在正常葡萄糖浓度下细胞培养相比，高糖存在明显增加了肾小球细胞TGF-beta 1的分泌。精酸无机盐减少了高糖导致的TGF-beta 1的分泌。由于TGF-beta 1通过cAMP响应元素刺激纤维结合蛋白的基因表达(Kreisberg JJ，et al.Kidney Int.46(4)1019～24 1994)，结果是糖尿肾病的细胞内基质组分积累(Border WA，et al.Diabetes Meab.Rev.12309～3391996)，这也就评价了精酸无机盐对葡萄糖导致的纤维结合蛋白合成和分泌增加的效果。
与正常或对照的葡萄糖浓度(5.5毫摩尔)相比，高糖(30毫摩尔)存在培养肾小球细胞时，纤维结合蛋白的分泌增加。高浓葡萄糖导致的纤维结合蛋白的合成和分泌增加，能够通过添加精酸无机盐减少。添加50微克/毫升的精酸无机盐，将纤维结合蛋白的水平减少到接近控制水平，如图4所示。
精酸无机减少葡萄糖导致的MEK和ERK磷酸化包括MEK和ERK在内的MAPK串是重要的信号传导系统。在糖尿病中PKC的活化激活MAPK(Haneda M.et al.Diabetes46847～853 1997)。ERK的酪氨酸和苏氨酸残基磷酸化需要ERK对核充分活化和移动。磷酸化的MEK才能使ERK-1和ERK-2活化。尾随肾小球细胞暴露给高浓度葡萄糖，评价精酸无机盐对ERK-2和MEK-2磷酸化的作用。
与正常葡萄糖浓度(5.5毫摩尔)相比较，高糖(30毫摩尔)存在培养5天的肾小球细胞中磷酸化ERK-2的相对量增加；与此同时，包括磷酸化和非磷酸化ERK-2的ERK-T的总量保持不变，如图6所示。用50微克/毫升的精酸无机盐处理高浓葡萄糖存在培养的细胞，结果是磷酸化的ERK-2降低到接近控制水平。
与ERK的情况相同，与正常葡萄糖浓度相比，在高浓葡萄糖条件培养的肾小球细胞中磷酸化的MEK-2(MEK-P)的量增加，如图7所示。当高浓度葡萄糖存在培养的细胞用50微克/毫升的精酸无机盐温育后，磷酸化的MEK-2接近控制水平。MEK-T的总量，包括磷酸化的和非磷酸化的MEK-2，保持不变，与葡萄糖的浓度和精酸无机盐处理无关，如图8所示。
这些资料说明，在高浓葡萄糖，ERK-2和MEK-2的磷酸化作用加强，精酸无机盐处理能够将ERK-2和MEK-2的磷酸化的水平恢复到接近控制水平。ERK-2和MEK-2磷酸化的量的增加，对改变关键细胞信号路径是十分重要的，举例来说，所说路径能够在肾脏细胞增加细胞外基质的生产，能够给糖尿肾病造成的肾小球基膜积累作出贡献。所以，尽量减少糖尿肾病的ERK-2和MEK-2磷酸化，继而用精酸无机盐治疗，就能够阻止或者减轻细胞外基质的沉积，防止状态发展。
这些资料说明，精酸无机盐能够降低PKC，MAPK串以及TGF-beta 1信号路径的活性，同样也减少了细胞外基质蛋白、纤维结合蛋白的合成和分泌。用精酸无机盐抑制了PKC的活性，也就抑制了MAPK串和TGF-beta 1。所以，通过潜在性地改变PKC和MAPK介导的路径，精酸无机盐能够减少糖尿病体的尿蛋白质。等同物参照文献和可取的实施方案，具体说明和描述本发明的同时，本领域人员能够理解到，在其中的形式和细节上能够作出多种变化，都脱离不开本发明的思想和范围，如权利要求书所限定。
权利要求
1.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，该方法包括给予糖尿病体使用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radixherb)、丹参的模拟物(Salviae Miltiorrhizae Radix mimic)或者其成分。
2.一种使用中草药丹参、丹参的模拟物或者其成分的方法，包括用其制造用于治疗糖尿病体的糖尿肾病的医药。
3.根据权利要求1或2所述方法，其中中草药丹参或丹参的模拟物是按一种剂量提供。
4.根据权利要求1或2所述方法，其中中草药丹参或丹参的模拟物是按多种剂量提供。
5.根据权利要求1或2所述方法，其中使用中草药丹参或丹参的模拟物的抽提物。
6.根据权利要求5所述方法，其中所说抽提物是用煮沸中草药丹参或丹参的模拟物的方法制成。
7.根据权利要求1或2所述方法，其中所说糖尿病体是非胰岛素依赖糖尿病体。
8.根据权利要求1或2所述方法，其中所说糖尿病体是胰岛素依赖糖尿病体。
9.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，包括下述步骤(1)制成中草药丹参或丹参模拟物的抽提物；(2)将所说抽提物给予糖尿病体。
10.根据权利要求9所述方法，其中中草药丹参或丹参的模拟物是按一种剂量提供。
11.根据权利要求9所述方法，其中中草药丹参或丹参的模拟物是按多种剂量提供。
12.根据权利要求9所述方法，其中所说糖尿病体是非胰岛素依赖糖尿病体。
13.根据权利要求9所述方法，其中所说糖尿病体是胰岛素依赖糖尿病体。
14.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，包括下述步骤(1)测定糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质的水平与控制水平相比较；(3)给予糖尿病体使用中草药丹参、丹参的模拟物和其成分，使糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
15.一种医疗评价糖尿肾病的糖尿病体的方法，包括下述步骤(1)测定糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质的水平与控制水平相比较；(3)确定给予糖尿病体使用的中草药丹参、丹参的模拟物或其成分的数量，以使病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
16.根据权利要求14或15所述方法，其中还包括制成中草药丹参或丹参的模拟物的抽提物的步骤。
17.根据权利要求16所述方法，其中所说抽提物是用煮沸中草药丹参或丹参的模拟物的方法制成。
18.根据权利要求16所述方法，其中所说抽提物是按一种剂量提供。
19.根据权利要求16所述方法，其中所说抽提物是按多种剂量提供。
20.根据权利要求14或15所述方法，其中所说测定尿中蛋白质水平是在给予中草药丹参、丹参的模拟物或其成分之前、之中和/或之后的一个或多个时间点，进行测定。
21.根据权利要求14或15所述方法，其中所说糖尿病体是非胰岛素依赖糖尿病体。
22.根据权利要求14或15所述方法，其中所说糖尿病体是胰岛素依赖糖尿病体。
23.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，包括给予糖尿病体使用精酸无机盐。
24.一种使用精酸无机盐或者精酸模拟物的盐的方法，包括用其制造用于治疗糖尿病体的糖尿肾病的医药。
25.根据权利要求23或24所述方法，其中所说精酸无机盐是精酸B的镁盐或其模拟物。
26.根据权利要求23或24所述方法，其中所说精酸无机盐是按一种剂量提供。
27.根据权利要求23或24所述方法，其中所说精酸无机盐是按多种剂量提供。
28.根据权利要求23或24所述方法，其中所说糖尿病体是非胰岛素依赖糖尿病体。
29.根据权利要求23或24所述方法，其中所说糖尿病体是胰岛素依赖糖尿病体。
30.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，包括下述步骤(1)测定糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质的水平与控制水平相比较；(3)给予糖尿病体使用精酸无机盐，使糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
31.一种医疗评价糖尿肾病的糖尿病体的方法，该方法包括下述步骤(1)测定糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质的水平与控制水平相比较；(3)确定给予糖尿病体的精酸无机盐的数量，以使病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
32.根据权利要求30或31所述方法，其中所说精酸无机盐是精酸B的镁盐或其模拟物。
33.根据权利要求30或31所述方法，其中所说精酸无机盐是按一种剂量提供。
34.根据权利要求30或31所述方法，其中所说精酸无机盐是按多种剂量提供。
35.根据权利要求30或31所述方法，其中所说糖尿病体是非胰岛素依赖糖尿病体。
36.根据权利要求30或31所述方法，其中所说糖尿病体是胰岛素依赖糖尿病体。
37.根据权利要求30或31所述方法，其中所说尿中蛋白质的水平是在给予精酸无机盐之前、之中和/或之后进行测定。
38.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括给予糖尿病体使用精酸无机盐或者精酸模拟物的盐。
39.一种治疗非胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括给予非胰岛素依赖糖尿病体使用中草药丹参、丹参的模拟物或者其成分。
40.一种治疗非胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括下述步骤(1)将中草药丹参或丹参的模拟物制成其抽提物；(2)给予非胰岛素依赖糖尿病体使用所说抽提物。
41.一种治疗非胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括下述步骤(1)测定非胰岛素依赖糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质的水平与控制水平相比较；(3)给予非胰岛素依赖糖尿病体使用中草药丹参、丹参的模拟物或其成分，使其尿中蛋白质水平降低到接近控制水平。
42.一种治疗非胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括给予非胰岛素依赖糖尿病体使用精酸无机盐。
43.一种治疗非胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括下述步骤(1)测定非胰岛素依赖糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质的水平与控制水平相比较；(3)给予非胰岛素依赖糖尿病体使用精酸无机盐，使非胰岛素依赖糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
44.一种治疗非胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括，给予非胰岛素依赖糖尿病体使用精酸无机盐或者精酸模拟物的盐。
45.一种治疗胰岛素依赖糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括，给予胰岛素依赖糖尿病体使用精酸无机盐或者精酸模拟物的盐。
46.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括，给予病体使用中草药丹参、丹参的模拟物或其成分。
47.一种中草药丹参、丹参的模拟物或其成分，或者中草药丹参或丹参的模拟物的抽提物的应用方法，其中包括，用其制造治疗病体微蛋白尿的医药。
48.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括下述步骤(1)制成中草药丹参或丹参模拟物的抽提物；(2)给予病体使用所说抽提物。
49.根据权利要求47或48所述方法，其中所说抽提物使用煮沸中草药丹参或丹参模拟物的方法制成。
50.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括下述步骤(1)测定病体尿中白蛋白的水平；(2)将所说尿中白蛋白的水平与控制水平相比较；(3)给予病体使用中草药丹参、丹参的模拟物或其成分，使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平。
51.一种医疗评价微蛋白尿病体的方法，其中包括下述步骤(1)测定病体尿中白蛋白的水平；(2)将所说白蛋白的水平与控制水平相比较；(3)确定使用中草药丹参、丹参的模拟物或其成分的数量，以使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平。
52.根据权利要求50或51所述方法，其中还包括制成中草药丹参或丹参的模拟物的抽提物的步骤。
53.根据权利要求52所述方法，其中所说的抽提物是用煮沸中草药丹参或丹参模拟物的方法制成。
54.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括，给予病体使用精酸无机盐。
55.一种精酸无机盐的使用方法，该方法包括用其制造治疗病体微蛋白尿使用的医药。
56.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括下述步骤(1)测定病体尿中白蛋白的水平；(2)将所说尿中白蛋白的水平与控制水平相比较；(3)给予病体使用精酸无机盐，使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平。
57.一种医疗评价微蛋白尿病体的方法，其中包括下述步骤(1)测定病体尿中白蛋白的水平；(2)将所说尿中白蛋白的水平与控制水平相比较；(3)确定使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平所用精酸无机盐的数量。
58.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括，给予糖尿病体使用中草药丹参的代谢物。
59.一种中草药丹参、丹参的模拟物或其成分的代谢物的使用方法，其中包括，用其制造治疗糖尿病体对糖尿肾病所使用的医药。
60.根据权利要求1或2所述方法，其中中草药丹参的代谢物是按一种剂量提供。
61.根据权利要求1或2所述方法，其中中草药丹参的代谢物是按多种剂量提供。
62.一种治疗糖尿病体的糖尿肾病的方法，其中包括下述步骤(1)测定糖尿病体尿中的蛋白质水平；(2)将所说尿中蛋白质水平与控制水平相比较；(3)给予糖尿病体使用中草药丹参的代谢物，使糖尿病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
63.一种医疗评价糖尿肾病的糖尿病体的方法，其中包括下述步骤(1)测定糖尿病体尿中蛋白质的水平；(2)将所说尿中蛋白质水平与控制水平相比较；(3)确定给予糖尿病体使用的中草药丹参、丹参的模拟物或其成分的代谢物的数量，以使病体尿中蛋白质的水平降低到接近控制水平。
64.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括，给予病体使用中草药丹参的代谢物。
65.一种中草药丹参、丹参的模拟物或其成分的代谢物，或者中草药丹参、丹参的模拟物的抽提物的应用方法，其中包括用其制造治疗病体微蛋白尿所使用的医药。
66.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括下述步骤(1)制成中草药丹参的代谢物；(2)给予病体使用所说的代谢物。
67.一种治疗病体微蛋白尿的方法，其中包括下述步骤(1)测定病体尿中白蛋白的水平；(2)将所说白蛋白的水平与控制水平相比较；(3)给予病体使用中草药丹参的代谢物，使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平。
68.一种医疗评价微蛋白尿病体的方法，其中包括下述步骤(1)测定病体尿中白蛋白的水平；(2)将所说尿中白蛋白的水平与控制水平相比较；(3)确定使病体尿中白蛋白的水平恢复到接近控制水平，给予病体使用的中草药丹参、丹参的模拟物或其成分的代谢物的数量。
全文摘要
本发明公开用中草药丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix)治疗糖尿肾病和微蛋白尿。包括煮沸丹参制成水基抽提物,再给糖尿病体或微蛋白尿病体使用抽提物,以治疗糖尿肾病。另外还包括,给病体使用从丹参抽提出来的精酸无机盐。本发明还包括,给病体使用水基抽提物或精酸无机盐之前、之中和/或之后,测定尿中蛋白质的水平。
文档编号A61K36/00GK1387439SQ00815232
公开日2002年12月25日 申请日期2000年9月21日 优先权日1999年9月29日
发明者李海日, 李勋哲, 郑万吉, 苏德海·V·沙赫 申请人:希瓦生物医学股份有限公司