专利名称：真核细胞中序列特异性dna重组的制作方法
技术领域：
本发明涉及真核细胞中序列特异性DNA重组的方法，包含向细胞内引入第一DNA序列，向细胞内引入第二DNA序列，通过噬菌体λ整合酶Int进行序列特异性重组。优选的发明实施方式涉及这样一种方法，进一步包含通过Int和Xis因子进行序列特异性DNA重组。本发明进一步涉及载体和它们作为药物的用途。
对真核基因组的控制性操作是调查特定基因在活生物体中的功能的重要方法。而且，所述操作在医学基因治疗方法中起作用。在此意义上，转基因动物的产生、基因或基因节段的改变(所谓的“基因定向”)和外来DNA被定向整合到高等真核生物基因组内是特别重要的。最近，借助序列特异性重组系统的特性描述和应用，这些技术得以改进。
保守性序列特异性DNA重组酶分为两个家族。第一家族、即所谓的“整合酶”家族的成员催化两种指定核苷酸序列之间的DNA链的裂解和再接合，这两种序列在下文中将被称为重组序列。重组序列既可以在两个不同的DNA分子上，也可以在一个相同的DNA分子上，分别导致分子间和分子内重组。在后者情况下，反应的结果取决于重组序列相互间各自的方向。在重组序列方向倒位、即反向的情况下，位于重组序列之间的DNA节段发生倒位。当重组序列在DNA底物上为串联重复、即同向的情况下，发生缺失。在分子间重组的情况下，也就是如果两个重组序列位于两个不同的DNA分子上，那么可能发生两个DNA分子的融合。整合酶家族的成员通常催化分子内以及分子间重组，而所谓“转化酶/分离酶”的第二家族重组酶仅能催化分子内重组。
目前主要用于真核基因组操作的重组酶属于整合酶家族。所述整合酶是噬菌体P1的Cre重组酶和来自酵母的Flp重组酶(Müller，U.(1999)Mech.Develop.，82，pp.3)。与Cre重组酶结合的重组序列称为loxP。loxP是34bp长的核苷酸序列，由两个13bp长的反向核苷酸序列和位于这个反向序列之间的8bp长的间隔区组成(Hoess，R.等(1985)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，181，pp.351)。称为Flp结合序列的FRT的构成与此相似。不过，它们不同于loxP(Kilby，J.等(1993)Trends Genet.(遗传学趋势)，9，pp.413)。因此，重组序列不可以被彼此代替，也就是说，Cre不能重组FRT序列，FLP不能重组loxP序列。两种重组系统在长距离内都是有活性的，也就是说，被两个loxP或FRT序列倒位或删去和位于旁侧的DNA节段可以长达数万个碱基对。
利用所述两种系统实现了例如在小鼠系统内的组织特异性重组，植物与动物中的染色体易位和基因表达的受控制的诱导；参见Müller，U.(1999)Mech.Develop.，82，pp.3。DNA聚合酶β在特定的小鼠组织中以这种方式被删去；Gu，H.等(1994)Science(科学)，265，pp.103。进一步的实例是小鼠晶状体中DNA肿瘤病毒SV40致癌基因的特异性活化，致使仅在这些组织中生成肿瘤。Cre-loxP策略还用于与诱导性启动子有关的方面。例如，用干扰素诱导性启动子调节重组酶的表达，引起肝中特定基因的缺失，而在其他组织中没有或者仅有微小程度的缺失；Kühn，R.等(1995)Science(科学)，269，pp.1427。
迄今，转化酶/分离酶家族已有两种成员用于真核基因组的操作。噬菌体Mu转化酶Gin的突变体无需辅因子即能催化植物原生质体中DNA片段的倒位。不过，已经发现这种突变体是过度重组的，也就是说，它还在除其天然重组序列以外之处催化DNA链的裂解。这引起植物原生质体基因组中不希望出现的部分致死性重组事件。来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的β-重组酶在小鼠细胞培养物中催化两种重组序列之间的重组，因为定向重复单位引起该节段的切离。不过，在缺失的同时还检测到倒位，这使得该系统的受控制的使用不适合于真核基因组操作。
分别利用Cre与Flp重组酶对真核基因组进行操作显示出显著的缺点。在缺失、即基因组中两个串联重复的loxP或FRT重组序列发生重组的情况下，位于串联重复单位之间的DNA节段存在不可逆的丢失。因而，位于该DNA节段上的基因对细胞和生物体而言将永久丢失。因此，为例如在生物体的发育后期基因功能的新分析而重建原始状态是不可能的。各DNA节段的倒位可以避免由缺失导致的DNA节段的不可逆转的丢失。基因可以被倒位灭活但不丢失，并且经由回复重组，借助定时调节的重组酶表达，在发育后期或者在成年动物中可以再次被激活。不过，Cre与Flp重组酶在这种改进方法中使用的缺点是不能调节倒位，因为重组事件不导致改变重组序列。因而，仅在一些、最多50％靶细胞内发生反复的重组事件，导致各基因由于各自DNA节段的倒位而失活。为了至少在部分程度上解决该问题，构建突变的loxP序列，使它在一次的重组之后不能被用于进一步的反应。不过，缺点是反应的唯一性，也就是说，在基因被倒位灭活之后，没有随后的回复重组活化。
Flp重组酶的进一步缺点是降低了37℃下的热稳定性，显著限制了体温约39℃的高等真核生物、例如小鼠中的重组反应效率。因此，构建了具有较高的如野生型重组酶一样的热稳定性但重组效率仍低于Cre重组酶的Flp突变体。
序列特异性重组酶的用途进一步在于医药领域，例如在基因疗法中，重组酶应当以稳定和定向的方式将所需DNA节段整合到不同的人类靶细胞的基因组内。Cre和Flp都可以催化分子间重组。两种重组酶都重组质粒DNA，该DNA携带其各自重组序列的拷贝，和相应的以前经由同源性重组已被插入到真核基因组内的重组序列。不过，真核基因组中有“天然”存在的重组序列时，该反应有可能发生。由于loxP和FRT分别长34和54个核苷酸，这些重组序列作为基因组的一部分存在在统计学上是极不可能的。即使存在重组序列，上述回复反应的缺点也仍然存在，也就是说，Cre和Flp重组酶都可以在成功的分子内重组整合之后切离所插入的DNA节段。
因而，本发明的一个问题是提供简单与可调节的重组系统和所需工作手段。本发明的进一步问题是提供这样一种重组系统和所需工作手段，它们可以进行所需DNA序列的稳定和定向整合。
权利要求中定性的主题解决了所述问题。
下列举例说明更加详细地解释本发明。
图1显示重组反应示意图，也就是整合酶Int催化的整合和切离。显示出超螺旋质粒DNA(顶部)，其携带重组序列attP的一个拷贝。attP由五个所谓Int臂结合位点(P1、P2、P1′、P2′、P3′)、两个Int核心结合位点(C和C′；用黑色箭头标示)、三个IHF结合位点(H1、H2、H′)、两个Xis结合位点(X1、X2)和所谓重叠区(空心矩形)组成，该重叠区中发生真正的DNA链置换。attP、attB的配对序列显示在线性DNA节段下方，由两个Int核心结合位点(B和B′；用空心箭头标示)和重叠区组成。对attB与attP之间的重组来说，Int和IHF是必要的，它们使质粒整合到携带attB的DNA节段内。从而生成两种新的杂种重组序列attL和attR来充当切离的靶序列。该反应需要Int和IHF以及另一个由噬菌体λ编码的辅因子Xis。
图2A显示整合酶表达载体示意图，图2B显示蛋白质分析示意图。(A)载体pKEXInt包括野生型整合酶基因，载体pKEXInt-h包括突变体Int-h的基因，载体pKEXInt-h/218包括突变体Int-h/218的基因。对照载体(pKEX)没有包括Int基因。用灰色条显示野生型整合酶(Int)与两种突变体(Int-h和Int-h/218)的各自基因。在编码区之后是用于RNA加工的信号序列(点状矩形)，称为SV40、t-Ag接头和polyA信号，它们应当保证各自mRNA的细胞内稳定性的增加。整合酶基因的表达通过人巨细胞病毒(CMV)启动子而发生。(B)向所示报告细胞系内引入各种载体之后，制备B2与B3溶胞产物，在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据蛋白质的分子量分离它们。抗野生型Int多克隆小鼠抗体使Int-h蛋白的存在可见(泳道2和4)。用箭头标示Int在凝胶中的位置。
图3显示底物载体示意图。(A)pGFPattB/attP。它是用ApaLI线性化的载体。大黑箭头标示两种重组序列attB和attP的位置和方向，它们位于GFP(绿色荧光蛋白)基因的旁侧，后者又与CMV启动子反向。PA表示polyA信号。另外在载体上放置neo抗性基因，它由SV40启动子驱动表达，并使得能够选择稳定的报告细胞系。还标示限制酶NcoI的识别位点。attB与attP之间的整合重组引起GFP基因的倒位，因而引起它的表达。小的空心与实心箭头标示单一PCR引物的位置和方向，表示为p1至p7。(B)pGFPattL/attR。该载体等同于pGFPattB/attP，不过包括attL和attR，而非attB和attP。GFP基因位于CMV启动子的3′-5′方向。阴影框表示用于DNA分析的探针的位置。
图4A至D显示在琼脂糖凝胶(1.2％w/v)中分离DNA分子并用溴化乙锭染色使DNA可见之后借助PCR而检测报告细胞系中整合重组的示意图，其中。(A)逆转录酶PCR(RT-PCR)。通过电穿孔分别向各报告细胞系B1至B3内引入载体pKEX和pKEXInt-h(图2A)。对所分离的polyAmRNA进行的RT-PCR分析显示仅当用pKEXInt-h处理细胞时(泳道1、3和5)，预期产物具有引物对p3/p4(图3)。扩增来自相同RNA制备物的β-肌动蛋白基因，作为RNA含量的对照。M道DNA梯；O道不含RNA模板的RT-PCR对照。(B，C)基因组PCR分析。在电穿孔后72小时从各细胞系分离基因组DNA，用引物对p3/p4(图3)和p1/p2(图3)扩增。泳道的编号和命名对应于图4A。(D)缺失试验。用引物对p5/p6扩增所分离的基因组DNA(图3)。用箭头标示在缺失而非倒位之后预计的PCR产物(420bp)的位置。泳道的编号和命名对应于图4A。
图5A和B显示在琼脂糖凝胶(1.2％w/v)中分离DNA分子之后通过PCR和DNA杂交来检测报告细胞系中倒位的示意图。(A)PCR分析。用载体pKEX和pKEXInt-h处理细胞系B1、B2、B3和BL60，从细胞中分离的基因组DNA部分，用引物对p3/p4和p5/p7扩增(图3)。在泳道1、3和5中可以见到被整合酶催化的PCR产物恢复GFP基因的倒位。M道DNA梯；O道不含基因组DNA的PCR对照。(B)DNA分析如图5A所示分析的DNA的其余部分与限制酶NcoI一起保温，在琼脂糖凝胶上根据其分子量分离，随后转移到硝基纤维素膜上。借助放射性标记探针使携带GFP的DNA片段可见(图3B)，以检测重组。9道未重组的pGFPattB/attP；10道重组的pGFPattB/attP。
图6A显示分别包含attB和attH的核酸序列示意图。图6B显示attP和attP*的部分序列示意图。(A)attB与attH之间的序列对比。在序列顶部用实线标示attB中的Int核心结合位点B和B′。在序列顶部用虚线标示attH中的Int核心结合位点H和H′。用空心矩形描绘重叠序列。用垂直双线标示序列中的差异。核心与重叠区中的残基编号涉及以O表示的重叠中心，规定参见Landy和Ross((1977)，Science，197，pp.1147)。从-9至+11的序列分别是attB和attH基因座。(B)分别对应于attB和attH的attP和attP*的部分序列之间的序列对比。表示方法同图6A。
图7显示在琼脂糖凝胶电泳中分离之后检测大肠杆菌中载体pACH上attH与attP*之间重组的示意图。底物载体pACH与Int、Int-h或Int-h/218的相应原核表达载体一起被共转化到大肠杆菌菌株CSH26或CSH26δIHF内。在选择后36小时分离质粒DNA，与限制酶HindIII和AvaI一起保温，通过琼脂糖凝胶电泳分离和使其可见。由倒位产生的限制片段的位置标示为“invers”。尚未重组的DNA的位置标示为pACH。1和12道DNA梯；2和3道表达载体和非重组pACH的DNA；4至7道从CSH26分离的DNA；8至11道从CSH26δIHF分离的DNA。
图8显示载体pEL13整合到attH基因座的策略和检测方法的原理示意图。整合载体pEL13携带抗性基因(标以“hygr”的箭头)、在CMV启动子控制下的Int-h基因(标以“int h”的箭头)和一个attP*拷贝(标以“attP*/P*OP*′”的空心矩形)。Int-h是在通过电穿孔向BL60细胞内引入载体之后被表达的(图2B)。随后，重组酶催化attP*与染色体attH之间的分子间重组(标以“attH/HOH′”的阴影矩形)，引起载体pEL13整合到BL60细胞的基因组内。利用引物对attX1/B2(标以“attX1”和“B2”的箭头)通过PCR可以选择和鉴别稳定掺入载体的细胞。EcoRV和SphI表示相应限制酶的限制酶识别位点。
图9显示检测BL60细胞内attP*(pEL13)与attH之间的分子间重组示意图。在pEL13的电穿孔和随后历经数周的选择之后利用引物对attX1/B2从31个不同细胞群落分离和扩增基因组DNA(图8)。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并使其可见。在凝胶中用箭头标示预期产物(295bp)的位置。随后通过DNA测序进一步分析产物。DNA梯位于右侧边缘。
本文所用的名词或动词“转化”表示任意向细胞内引入核酸序列的过程。引入例如可以是转染或脂转染，或者可以借助于钙法、电休克法或卵母细胞注射而进行。名词或动词“转化”还表示引入病毒核酸序列，例如包含重组序列和对各病毒来说是天然的治疗基因或基因片段。病毒核酸序列不必是裸露的核酸序列，可以包装在病毒蛋白包膜内。因而，该术语不仅仅涉及名词或动词“转化”在通常意义上的公知方法。
本文所用的术语“衍生物”涉及相对天然重组序列而言具有修饰的attB与attP序列和attL与attR序列，修饰的形式是一个或多个、至多六个、优选为两个、三个、四个或五个取代。
本文关于重组序列所用的术语“同系物”或“同源性”或“相似性”涉及与天然重组序列的同一性为约70％，优选为约80％，更优选为约85％，进而更优选为约90％，进而更优选为约95％，最优选为约99％的核酸序列。
本文所用的术语“载体”涉及天然存在或合成产生的构建体，用于核酸的摄取、增殖、表达或传递，例如质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、噬菌体、病毒或反转录病毒。
象Cre和Flp一样，噬菌体λ的整合酶(本文通常表示为“Int”)属于序列特异性保守性DNA重组酶家族。Int催化两种不同重组序列、即attB与attP之间的整合重组。attB包含21个核苷酸，最初是从大肠杆菌基因组分离的；Mizuuchi，M.和Mizuuchi，K.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)，77，pp.3220。另一方面，具有243个核苷酸的attP要长得多，天然存在于噬菌体λ的基因组中；Landy，A.和Ross，W.(1977)Science(科学)，197，pp.1147。Int重组酶由attP中的七个结合位点和attB中的两个结合位点组成。Int的生物功能是向大肠杆菌染色体上的attB基因座内序列特异性整合循环噬菌体基因组。Int需要一种蛋白质辅因子进行整合重组，即所谓的整合宿主因子(本文通常表示为“IHF”)；Kikuchi，Y.和Nash，H.(1978)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，253，7149。需要IHF与attP装配成功能性重组配合物。用于整合反应的第二种辅因子是attP的DNA反向(negative)超螺旋。最后，attB与attP之间的重组生成两种新的重组序列，即attL和attR，它们充当进一步重组反应、即切离反应的底物和识别序列。噬菌体λ整合的全面总结例如参见Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.(生物化学年评)，58，pp.913。
从细菌基因组中切离噬菌体基因组也由Int重组酶催化。为此，除了Int和IHF以外还需要另外的辅因子，它也是从噬菌体λ编码的。它是切离酶(本文通常表示为“XIS”)，在attR中有两个结合位点；Gottesman，M.和Weisberg，R.(1971)The Bacteriophage Lambda(噬菌体λ)，Cold SpringHarbor Laboratory，pp.113。与整合重组相反，重组序列的DNA反向超螺旋并不是切离重组所必需的。不过，DNA反向超螺旋提高重组反应的效率。利用第二种辅因子，即FIS(倒位刺激因子)可以使切离反应效率进一步提高，该因子的作用与Xis有关；Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.(生物化学年评)，58，pp.913。切离是遗传学上整合反应的真正逆反应，也就是再次产生attB和attP。噬菌体λ切离的全面总结例如参见Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.(生物化学年评)，58，pp.913。
本发明在一方面涉及真核细胞中序列特异性DNA重组的方法，包含a)向细胞内引入第一DNA序列，2)向细胞内引入第二DNA序列，和c)通过噬菌体λ整合酶Int进行序列特异性重组。优选的是这样一种方法，其中该第一DNA序列包含根据SEQ ID NO1的attB序列或其衍生物，该第二DNA序列包含根据SEQ ID NO2的attP序列或其衍生物。进一步优选的是这样一种方法，其中该第一DNA序列包含根据SEQ ID NO3的attL序列或其衍生物，该第二DNA序列包含根据SEQ ID NO4的attR序列或其衍生物，其中在步骤c)中，序列特异性重组是通过Int和Xis因子进行的。
本发明的方法不仅可以利用天然attB和/或attP序列或者attL和/或attR序列进行，而且可以利用修饰的、例如取代的attB和/或attP序列或者attL和/或attR序列进行。例如，已经在噬菌体λ和大肠杆菌的attP和attB同源性序列(野生型序列的突变体)之间观察到整合重组，所述同源序列在attB中的下列位置具有一或多个下列取代G，T(在-9位)；A，C，G(-8)；C，A，T(-7)；T，G ， A(-6)；C，A(-5)；A(-4)；G， A(-3)；A，C，G(-2)；A，C，G(-1)；A，C，G(0)；T，C，G(+1)；A，C，G(+2)；T，G， C(+3)；A，G， T(+4)；A，C，G(+5)；G，T(+6)；G，T(+7)；G，T，A(+8)；C，G，A(+9)；C，G，A(+10)；T，A，C(+11)(Nash，H.(1981)Annu.Rev.Genet.(遗传学年评)，15，pp.143；Nussinov，R.和Weisberg，R.(1986)J.Biomol.Struct.Dynamics(生物分子结构动力学杂志)，3，pp 1134)，和/或在attP中的下列位置具有一或多个下列取代T(在+1位)；C(+2)和A(+4)；Nash，H.(1981)Annu.Rev.Genet.(遗传学年评)，15，pp.143。
因而，本发明涉及这样一种方法，其中所用attB和attP序列与天然、分别根据SEQ ID NO1的attB序列和根据SEQ ID NO2的attP序列相比具有一个或多个取代。此外，本发明涉及这样一种方法，其中所用attL和attR序列与天然、分别根据SEQ ID NO3的attL序列和根据SEQ IDNO4的attR序列相比具有一个或多个取代。优选的是这样一种方法，其中的重组序列具有一个、两个、三个、四个或五个取代。取代既可以发生在重叠区(见图6A空心矩形)，也可以发生在核心区(见图6A虚线区)。包含七个核苷酸的完整重叠区也可以被取代。更优选的是这样一种方法，其中向attB和attP序列的核心区或重叠区引入取代。优选的是在重叠区引入取代的同时在核心区引入一个或两个取代。
关于本发明的方法，如果在attB中引入取代，那么在attP中引入对应的取代是不必要的，或者如果在attL中引入取代，那么在attR中引入对应的取代是不必要的，反之亦然。对于在重组序列中进行取代，这种修饰形式的选择应使得能够进行重组而与修饰无关。这类取代的实例例如列举在Nash，H.(1981)，出处同上和Nussinov，R.，Weisberg，R.(1986)，出处同上的出版物中，不被视为限制性的。例如通过诱变方法可以易于引入进一步的修饰，通过试验重组可以试验它们的用途。
因而，本发明进一步涉及这样一种方法，其中所用attB序列与天然、根据SEQ ID NO1的attB序列相比、或者所用attP序列与天然、根据SEQID NO2的attP序列相比、或者所用attL序列与天然、根据SEQ ID NO3的attL序列相比、或者所用attR序列与天然、根据SEQ ID NO4的attR序列相比具有一个或多个取代。因此，一种重组序列中的一个或多个取代不必暗示其他重组序列中的相应取代。
在本发明方法的优选实施方式中，attB序列包含21个核苷酸，并对应于最初从大肠杆菌基因组分离的序列；Mizuuchi，M.和Mizuuchi，K.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)，77，pp.3220，attP序列包含243个核苷酸，并对应于最初从噬菌体λ基因组分离的序列；Landy，A.和Ross，W.(1977)Science(科学)，197，pp.1147。
在本发明方法的进一步优选实施方式中，attL序列包含102个核苷酸，attR序列包含162个核苷酸，这两种序列都对应于最初从大肠杆菌基因组分离的序列；Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.(生物化学年评)，58，pp.913。
为了实施本发明的方法，除了重组序列以外，第一DNA序列还可以包含另外的DNA序列，以便整合到真核细胞基因组中的所需靶基因座内。这种重组经由同源性重组发生，后者受到内部细胞重组机制的介导。关于所述重组，另外的DNA序列必须与靶基因座DNA同源并分别位于attB和attL序列的3′和5′处。本领域技术人员知道同源性必须是多大程度以及各自3′和5′序列必须是多长，才能以足够高的概率发生同源性重组；参见Capecchi，M.(1989)Science(科学)，244，pp.1288。
分别具有attP和attR重组序列的第二DNA序列也可以包含对经由同源性重组整合到所需靶基因座来说是必需的DNA序列。关于本发明的方法，第一和/或第二DNA序列也可以包含另外的DNA序列。优选的是这样一种方法，其中两种DNA序列都包含另外的DNA序列。
第一与第二DNA序列具有或者没有另外DNA序列时的引入可以连续进行，也可在共转化中进行，共转化时DNA序列存在于两种不同的DNA分子上。优选的是这样一种方法，其中具有或者没有另外DNA序列的第一与第二DNA序列存在于和被引入到真核细胞的单一DNA分子上。此外，可以向一个细胞内引入第一DNA序列，向另一个细胞内引入第二DNA序列，随后融合这些细胞。术语融合表示生物的杂交以及最广义上的细胞融合。
本发明的方法例如可以在分子内重组中用于倒位位于非同向重组序列之间的DNA节段。此外，本发明的方法可以在分子内重组中用于删去位于同向重组序列之间的DNA节段。如果各自按5′-3′或3′-5′方向掺入重组序列，那么它们以同向存在。如果例如按5′-3′方向整合attB序列，按3′-5′方向整合attP序列，那么重组序列是非同向的。如果将重组序列各自经由同源性重组掺入外显子5′和3′端的内含子序列中，并且该重组是通过整合酶进行的，那么在非同向重组序列和同向重组序列的情况下，分别将倒位和删去外显子。利用这种程序，被不同基因编码的多肽可以丧失它的活性或功能，或者转录可以被倒位或缺失所终止，以便没有(完整的)转录物产生。这样，例如可以调查所编码的多肽的生物功能。
不过，第一和/或第二DNA序列可以包含编码一种或多种目标多肽的其它核酸序列。例如可以经由重组序列向在分子内重组后被瞬时表达的基因组内引入结构蛋白、酶或调节蛋白。被引入的多肽可以是内源性的或外源性的。此外，可以引入标记蛋白。本领域技术人员知道这份根据本发明方法的应用列表仅仅是例证性的，而不是限制性的。利用迄今所用的Cre与Flp重组酶进行的本发明应用的实例例如可以参见Kilby，N.等，(1993)，Trends Genet.(遗传学趋势)，9，pp.413。
此外，本发明的方法可以通过附加体底物上的分子内重组，用于删去或倒位载体上的DNA节段。删去反应例如可以用于从所谓的辅助病毒删去包装序列。这种方法在基因治疗所用病毒载体的工业生产中具有广泛应用；Hardy，S.等，(1997)，J.Virol.(病毒学杂志)，71，pp.1842。
分子间重组引起分别有一拷贝attB与attP或attL与attR的两个DNA分子的融合。例如，可以首先经由同源性重组在特征熟知的细胞基因组基因座内引入attB。随后可以经由分子间重组将携带attP的载体整合到所述基因组attB序列内。在这种方法中优选的是突变体整合酶Int-h/218的表达，该酶的基因位于被共转染的第二DNA载体上。另外的序列也可以位于携带attP的载体上，例如位于loxP/FRT序列旁侧的特定标记蛋白基因。利用这种方法，可以实现例如在不同细胞类型中不同基因的对比表达分析时，所述基因不受各自基因组整合位点的积极或消极影响。
为了实施本发明的方法，整合酶必须作用于重组序列。整合酶或整合酶基因和/或Xis因子或Xis因子基因可以存在于已经引入第一与第二DNA序列的真核细胞内。它们还可以在第一与第二DNA序列的引入之间或者在第一与第二DNA序列的引入之后而被引入。用于序列特异性重组的整合酶优选地是在进行所述反应的细胞内表达。为此，向该细胞内引入包含整合酶基因的第三DNA序列。如果利用attL/attR进行序列特异性重组，那么可以另外向细胞内引入Xis因子基因(第四DNA序列)。最优选的是这样一种方法，其中将该第三和/或第四DNA序列经由同源性重组或者随机地整合到真核细胞基因组内。进一步优选的是这样一种方法，其中该第三和/或第四DNA序列包含调节序列，它们导致整合酶基因和/或Xis因子基因的空间和/或时间表达。
在这种情况下，空间表达意味着重组酶和Xis因子分别利用细胞类型特异性启动子仅在特定的细胞类型内被表达，并且仅在这些细胞内催化重组，例如肝细胞、肾细胞、神经细胞或免疫系统的细胞。在整合酶/Xis因子表达的调节中，在成年生物体内可借助活性形式的启动子或者在特定发育阶段或者在特定时间点实现时间表达。此外，利用诱导性启动子可以实现时间表达，例如干扰素或四环素依赖性启动子；参见Müller，U.(1999)Mech.Develop.，82，pp.3。
用在本发明方法中的整合酶可以是噬菌体λ的野生型和经过修饰的整合酶。由于野生型整合酶仅能够进行与辅因子、即IHF的重组反应，因此优选的是在本发明的方法中使用经过修饰的整合酶。如果在本发明的方法中使用野生型整合酶，那么另外需要IHF进行重组反应。整合酶经过修饰，以便所述整合酶可以进行没有IHF参加的重组反应。修饰型多肽的产生和所需活性的筛选属于本领域现状，可以容易地进行；Erlich，H.(1989)PCR Technology(PCR技术).Stockton Press。有两种Int突变体是优选的噬菌体λ整合酶，称为Int-h和Int-h/218；Miller等(1980)Cell(细胞)，20，pp.721；Christ，N.和Drge，P.(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，288，pp.825。与野生型Int相比，Int-h在174位由赖氨酸残基代替了谷氨酸残基。Int-h/218在218位由另一个的赖氨酸残基代替了谷氨酸残基，它是由Int-h基因经PCR诱变所产生的。在大肠杆菌内和体外，也就是在含有纯化底物的反应试管内，所述突变体也可以催化attB/attP以及attL/attR之间的重组，而无需辅因子IHF、Xis和反向超螺旋的参与。在真核细胞内，突变体仅需要辅因子Xis进行attL/attR之间的重组。利用另外的辅因子、例如FIS可以实现attL/attR之间重组效率的进一步提高。突变体Int-h/218是优选的，因为这种突变体可以催化与辅因子无关的整合反应，且增加了效率；Christ，N.和Drge，P.(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，288，pp.825。
本发明的方法可以在所有真核细胞内实施。细胞例如可以存在于细胞培养物内，并包含所有类型的植物与动物细胞。例如，细胞可以是卵母细胞、胚胎干细胞、造血干细胞或任意类型的分化细胞。这样一种方法是优选的，其中的真核细胞是哺乳动物细胞。更优选的是这样一种方法，其中的哺乳动物细胞是人、猴(simian)、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、牛、绵羊或猪的细胞。
此外，本发明的优选实施方式涉及这样一种方法，其中可选地，第二步序列特异性DNA重组是通过噬菌体λ整合酶和Xis因子进行的。第二步重组需要由第一步attB与attP或其衍生物重组所产生的attL与attR序列。因此，第二步序列特异性重组限于用在第一步attB与attP序列或其衍生物特异性重组中的方法。野生型和Int突变体都仅能催化没有另外因子加入的所谓整合重组，也就是说，如果被稳定地整合到细胞的基因组内，那么它们重组attB与attP，而不是attL与attR。野生型整合酶需要因子IHF、Xis和反向超螺旋进行所谓的切离(excision)重组。Int突变体Int-h和Int-h/218仅需要Xis因子进行切离重组。因而，如果细胞内存在另外用于第二步重组反应、即切离重组的因子，那么有可能以可控制的方式依次进行两步重组反应。可以开发新的策略，与其他已经使用的重组系统一起用于高等真核基因组的可控制的操作。这是可能的，因为不同的重组系统仅使用它们自己的重组序列。
例如Int系统可以用于以定向方式向真核基因组的基因座内整合loxP和/或FRT序列，随后通过Cre和/或Flp的控制型表达分别激活和灭活基因。Int系统可以进一步用于在使用后从基因组删去loxP/FRT序列，也就是与各自重组酶重组。
此外，这样一种方法是优选的，其中向细胞内引入包含Xis因子的另一种DNA序列。最优选的是这样一种方法，其中该另一种DNA序列进一步包含调节性DNA序列，它引起Xis因子基因的空间和/或时间表达。
例如，在借助Int进行成功的分子内整合重组(倒位)，引起特定细胞类型中的基因活化/失活之后，借助所诱导的Xis的空间和/或时间表达以及Int的同时表达可以在后面的时间点再次灭活或激活所述基因。
此外，本发明涉及根据SEQ ID NO1的attB序列或其衍生物与根据SEQ ID NO2的attP序列或其衍生物或者根据SEQ ID NO3的attL序列或其衍生物与根据SEQ ID NO4的attR序列或其衍生物在真核细胞中序列特异性DNA重组中的用途。真核细胞可以存在于生物体、例如哺乳动物的细胞集合物中，所述生物在其细胞内没有整合酶或Xis因子。所述生物体可以用于与其他在细胞内具有整合酶或Xis因子的生物体一起喂养，以便产生后代，在这些后代的细胞内进行序列特异性重组。因而，本发明还涉及整合酶或整合酶基因与Xis因子或Xis因子基因在真核细胞序列特异性重组中的用途。
本发明人已经鉴别了人类基因组中的一种序列(本文称为attH)，其与attB的同源性为约85％。attH作为重组序列，可以用于将外来DNA整合到人类基因组内。因此，可以相应地修饰第二种重组序列attP，以便整合酶能够进行高效的重组反应。本发明人能够证明，借助大肠杆菌中的Int-h，可以使attH与本发明人修饰的attP重组，后者在本文中称为attP*，如SEQ ID NO5所述。利用人类细胞进行的实验证明，如果所述细胞瞬时合成Int-h，那么attH与同样是人类基因组一部分的attP*重组。
进而存在这样的可能性，具有attP重组序列的外来环状DNA可以以定向方式被稳定地整合到天然人类基因组attH基因座内。attH是人类基因组中天然重组序列的一个实例。在人类基因组计划内可以鉴别与attB有同源性的另外序列，它们也可以用于将外来DNA整合到人类基因组内。根据存在于人类基因组中并与attB同源的所述序列，可在外来环状DNA中选择对应的attP重组序列。优选的是这样一种外来环状DNA，它包括天然attP序列的核酸序列。更优选的是天然attP序列的衍生物，它具有至多六个、优选一至五个、特别是三个取代。最优选的是这样一种外来环状DNA，它包含根据SEQ ID NO5的attP*核酸序列，并与attP具有约95％的同源性。
整合酶可以作为多肽或者经由表达载体被运送到细胞内。此外，整合酶基因可以是DNA分子上可表达的核酸序列，它包含修饰的或天然的attP序列或attP*序列。
包括天然attP序列或其衍生物或同系物、特别是根据SEQ ID NO5的attP*序列的外来环状DNA还包含所要引入基因组的治疗基因或基因片段。治疗基因例如可以是CFTR基因、ADA基因、LDL受体基因、β-球蛋白基因、VIII因子或IX因子基因、α-1-抗胰蛋白酶基因或肌营养不良蛋白(dystropin)基因。外来环状DNA例如可以是已经用于全身性基因疗法的病毒载体。载体也可以是细胞特异性的，以便它仅转染基因疗法所需的那些细胞，例如肺上皮细胞、骨髓干细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、肝细胞、肾细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、造血干细胞或成纤维细胞。本领域技术人员知道这份列表仅是治疗基因和靶细胞的一种选择，其他基因和靶细胞也可以用于基因疗法。基因片段包含例如治疗基因、单一外显子、反义核酸序列或核酶(ribozyme)的缺失。此外，基因片段可以包含带三核苷酸重复单位的基因节段，例如脆性-X-综合征基因。
如果在重组中使用野生型整合酶，那么必须存在IHF。优选的是修饰型整合酶的使用，其中即使没有IHF也可以发生重组。特别优选的是Int-h或Int-h/218的使用。
因而，本发明涉及天然attP序列或其衍生物或同系物。本发明确切地涉及根据SEQ ID NO5的attP*核酸序列。此外，本发明涉及载体，它包含天然attP序列或其衍生物、特别是根据SEQ ID NO5的attP*核酸序列，以及携带治疗基因或其基因片段的另一种核酸序列。优选的是这样一种载体，其中治疗基因包含CFTR基因、ADA基因、LDL受体基因、α或β球蛋白基因、α-1-抗胰蛋白酶基因、VIII因子或IX因子基因或其片段。载体也可以包含调节性DNA元件，它们调节治疗基因或其基因片段的表达。
此外，本发明涉及载体作为人或兽医药物的用途。进而，本发明涉及载体制备全身性基因疗法(Somatic gene therapy)的药物的用途。
本发明的载体例如可以通过静脉内或肌内注射给药。载体还可以作为气雾剂而吸入。进一步的应用对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1. 表达载体与底物载体的产生1.1 表达载体野生型Int(pKEXInt)、Int-h(pKEXInt-h)、Int-h/218(pKEXInt-h/218)的真核表达载体和pEL13都是pKEX-2-XR的衍生物(Rittner等(1991)，Methods Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学方法)，2，pp.176)。所述载体包括人巨细胞病毒启动子/增强子元件(CMV)和小猴病毒40(SV40)肿瘤抗原的RNA剪接与多腺苷酸化信号元件。利用下列引物通过PCR克隆Int基因位于Int基因5′末端的(3343)5′-GCTCTAGACCACCATGGGAAGAAGGCGAAGTCA-3′和位于3′末端的(3289)5′-AAGGAAAGCGGCCGCTCATTATTTGATTTCAATTTTG TCC-3′。在第一个变性步骤(95℃，4min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(55℃，45 sec.)、DNA合成(72℃，2 min.)和最后的合成步骤(72℃，4 min.)。利用XbaI和NotI将所得PCR片段克隆到pKEX-2-XR载体内。从载体pHN16生成Int-h作为模板(Lange-Gustafson，B.和Nash，H.(1989)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，259，pp.12724)。分别从pTrcInt和pTrcInt-h/218生成野生型Int和Int-h/218作为模板(Christ，N.和Drge，P.(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，288，pp.825)。除了Int-h基因以外，pEL13还携带一个attP*的拷贝。
通过PCR诱变从attP构建attP*。使用下列寡核苷酸(O3)5′-GTTCAGCTTTTTGATACTAAGTTG-3′，(O4)5′-CAACTTAGTATCAAAAAGCTGAAC-3′，(PC)5′-TTGATAGCTCTTCCGCTTTCTGTTACAGGTCACTAATACC-3′和(PD)5′-ACGGTTGCTCTTCCAGCCAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3′。
在第一个变性步骤(95℃，4 min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(57℃，1min.30 sec.)、DNA合成(72℃，1min.30 sec.)和最后的合成步骤(72℃，4 min.)。将PCR产物与限制酶SapI一起保温，与用SapI裂解的pKEXInt-h连接。对照质粒pKEX没有携带Int基因。
1.2 底物载体底物载体是pEGFP的衍生物(Clontech)。重组序列盒处于CMV启动子的控制之下，保证强烈的组成型表达。首先用AgeI和BamHI从pEGFP切出GFP(绿色荧光蛋白)基因，构建pGFPattB/attP。使用下列寡核苷酸，向用AgeI裂解的载体内插入双链寡核苷酸形式的野生型attB序列(B1OB)5′-CCGGTTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGAACGC-3和(BOB1)5′-AATTGCGTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAA-3′。
使用下列引物，从载体pAB3(Drge，P.和Cozzarelli，N.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院院报)，86，pp.6062)通过PCR扩增野生型attP序列(p7)5′-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3′和(p6)5′-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3′。
在第一个变性步骤(95℃，4 min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(54℃，30 sec.)、DNA合成(72℃，30 sec.)和最后的合成步骤(72℃，4 min.)。将携带attP的PCR片段用XmaI和BamHI消化，与携带GFP基因的限制片段连接。所述GFP限制片段是利用AgeI和EcoRI从pEGFP生成的。连接产物向用MfeI/BamHI裂解的携带attB的载体内克隆。所得底物载体携带方向与CMV启动子相反的GFP基因，其在整合重组中的功能利用大肠杆菌中的野生型Int进行了试验。
除了重组序列以外，pGFPattL/attR等同于pGFPattB/attP。载体是这样构建的，首先在大肠杆菌中重组pGFPattB/attP，产生attL和attR。随后利用BsiEI和HindIII进行部分限制反应，切离就CMV启动子而言正向的GFP基因。首先使用下列引物通过PCR扩增GFP基因，以按照与CMV启动子相反的方向插入之(p2)5′-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3′和(p3)5′-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3′(图3)。
在第一个变性步骤(95℃，4 min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(56℃，45 sec.)、DNA合成(72℃，1 min.)和最后的合成步骤(72℃，4 min.)。随后将PCR片段用HindIII和BsiEI裂解，按照相反方向整合到部分裂解的包括attL和attR的载体内。因而，pGFPattL/attR显示与pGFPattB/attP相同的球形(global)结构，除了attL/attR代替attB/attP以外。
使用下列引物通过PCR从纯化的人DNA扩增人attB同系物attH(B3)5′-GCTCTAGATTAGCAGAAATTCTTTTTG-3′和(B2)5′-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3′。
在第一个变性步骤(95℃，5 min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(42℃，1.45 min.)、DNA合成(72℃，1.45 min.)和最后的合成步骤(72℃，10 min.)。用于产生attH的引物序列已经取自EST(登记号N31218；EMBL-数据库)。通过对分离的PCR产物(192 bp)的测序，检验和完成了数据库中不完整的attH序列。随后，将该片段用XbaI和PstI消化，插入到经过相应处理的载体pACYC187(New EnglandBiolabs)内。如文献所述通过定向诱变产生attP*(Christ，N.和Drge，P.(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，288，pp.825)，按照与attH相反的方向插入到携带attH的载体内。这种构建得到供试载体pACH。
通过亲和层析法(Qiagen，Germany)从大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，D.(1983)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，166，pp.557)分离质粒DNA。借助基于荧光的373A DNA-测序系统(Applied Biosystems)控制表达载体与底物载体以及所有通过PCR产生的构建体。利用″Master Mix Kit″(Qiagen，Germany)进行PCR反应，在TBE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％w/v)分析所得产物。
2 细胞培养和报告细胞系的构建利用人伯基特氏淋巴瘤细胞系(BL60；(Wolf，J.等，(1990)Cancer Res.(癌症研究)，50，pp.3095))进行瞬时表达和重组分析。在RPMI1640培养基(Life Technologies，Inc.)中培养BL60细胞，培养基中补充有10％胎牛血清并包括2mM L-谷氨酰胺、链霉素(0.1 mg/ml)和青霉素(100单位/ml)。
如下构建pGFPattB/attP或pGFPattL/attR被稳定整合到基因组内的BL60报告细胞系将约20μg每种载体用ApaLI线性化，经过苯酚/氯仿萃取纯化，用乙醇沉淀，利用″Bio-Rad Gene Pulser″通过260 V与960 mF电穿孔引入到约2×107个细胞内。利用G418/Genetizin(300μg/ml)选择稳定的细胞系，随后通过PCR、DNA测序和Southern分析加以鉴别。
3 体内重组分析为了在体内进行分子内重组，通过实施例2所述电穿孔将不同BL60报告细胞系的约2×107个细胞用40μg每种环状表达载体转染。72小时后离心收获细胞，按照厂商的指导通过亲和层析法分离半数细胞的基因组DNA(Qiaamp Blood Kit，Qiagen，Germany)。从半数细胞分离RNA(Rneasy kit，Qiagen，Germany)或者制备溶胞产物，用于Western分析(见实施例4)。
使用重组酶Int、Int-h和Int-h/218，如上所述在大肠杆菌中利用pACH进行重组分析(Christ，N.和Drge，P.(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，288，pp.825)。预期的pACH重组引起倒位，并且得到HindIII和AvaI的限制分析的证实。
如下进行关于pEL13整合到BL60细胞基因组中attH基因座的分子间重组如上所述经由电穿孔将2×107个细胞用20μg环状pEL13转染。48小时后将细胞按1×106个细胞/ml平板接种在选择培养基(200μg/ml潮霉素B)中，培养6至8周。按照厂商的指导，在培养后从不同存活细胞群的一部分细胞中制备基因组DNA(Qiaamp Blood Kit，Qiagen，Germany)。
为了证实分子内重组、整合重组与切离重组，使用20至50 pmol下列引物通过PCR扩增0.4μg基因组DNA(p1)5′-GGCAAACCGGTTGAAGCCTGCTTTT-3′；(p2)5′-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3′；(p3)5′-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3′；(p4)5′-AACCTCTACAAATGTGGTATGG-3′；(p5)5′-TACCATGGTGATGCGGTTTTG-3′；(p6)5′-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC；(p7)5′-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3′。
在第一个变性步骤(95℃，5 min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(57℃，45 sec.)、DNA合成(72℃，1.5 min.)和最后的合成步骤(72℃，4 min.)。
如下检测pEL13的分子间整合重组。将下列寡核苷酸作为PCR引物，与存活细胞群的约400ng基因组DNA一起保温(attx1)5′-AGTAGGAATTCAGTTGATTCATAGTGACTGC-3′和(B2)5′-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3′。
在第一个变性步骤(95℃，4 min.)之后进行扩增，也就是30次循环的变性(95℃，45 sec.)、引物结合(52℃，45 sec.)、DNA合成(72℃，45 sec.)和最后的合成步骤(72℃，4 min.)。
利用4μg分离的RNA进行逆转录酶PCR(RT-PCR)。首先，按照厂商的指导使用寡-dT引物合成cDNA(First Strand Synthesis Kit，Pharmacia)。其次，使用所述cDNA的四分之一作为模板，并使用引物p3和p4进行随后的PCR。为了试验缺失而不是倒位，利用引物p5和p6扩增所分离的基因组DNA。使用下列引物从所述cDNA开始分析β肌动蛋白转录物(AS)5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′和(S)5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′。
PCR条件与p1至p7所述相同。
基本上按照Sambrook，J.(1989)Molecular Cloning(分子克隆)(第2版)Cold Spring Harbor Laboratory Press的方案进行Southern分析。将约10μg基因组DNA用NcoI片段化，在TBE缓冲液中通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％w/v)分离，转移至尼龙膜过夜。使用引物p2和p3通过PCR生成用于重组检测的GFP探针。按照厂商的指导使用32P标记的dATP与dCTP进行放射性标记(Megaprime，Amersham)。
4 蛋白质分析在探针缓冲液(New England Biolabs)中将细胞煮沸5分钟，生成瞬时转染型细胞的溶胞产物。根据分子量在12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜(Immobilon P，Millipore)上过夜。将膜用1％封闭溶液(BM Chemiluminescence Western Blotting Kit，BoehringerMannheim，Germany)处理，与1∶50.000稀释的鼠抗野生型Int多克隆抗体一起保温(抗体来自A.Landy，USA)。使用与过氧化物酶偶联的第二抗体使凝胶中的整合酶位置可见(BM Chemiluminescence Western Blotting Kit；Boehringer Mannheim，Deutschland)。使用含有野生型Int的大肠杆菌细胞提取物作为对照。
5 结果5.1 BL60细胞中Int-h的合成为了试验Int-h是否能够催化人类细胞中的重组，有必要证明能够从所述细胞合成重组酶。因此，整合出在CMV启动子的控制下携带Int-h基因的真核表达载体pKEXInt-h。向两种不同的BL60报告细胞系、即B2和B3中引入pKEXInt-h后，通过RT-PCR分析来检测完整和正确修饰的Int-h基因特异性转录物。用pKEXInt-h电穿孔后72小时在Western分析中研究溶胞产物。利用抗野生型Int的鼠多克隆抗体进行重组酶的检测。向细胞内引入pKEX作为对照。
结果证明，在电穿孔中经过pKEXInt-h处理的细胞内存在具有预期分子量的蛋白质。如果使用对照载体pKEX，那么所述蛋白质是不可检出的。
5.2 Int-h催化的人类细胞中的分子内整合重组Western分析证明，Int-h蛋白是在两种报告细胞系中从载体pKEXInt-h开始合成的。所述细胞含有底物载体pGFPattB/attP，其作为外来DNA被稳定地整合到细胞的基因组内。关于整合重组的两种重组序列、即attB和attP位于彼此倒位的方向，并位于GFP基因旁侧。GFP基因本身位于CMV启动子的倒位方向，后者位于attB的上游。attB与attP之间由Int-h所致重组引起GFP基因的倒位，因而引起它的表达。总共构建了三种报告细胞系(B1至B3)。对它们的基因组DNA的Southern分析证明，若干pGFPattB/attP拷贝作为同向重复单位已被整合到B1与B3的基因组内，而细胞系B2仅含有一个拷贝。所整合的序列通过了PCR和随后测序的检验。
为了试验attB与attP之间的重组，向细胞系内分别引入pKEXInt-h和pKEX。电穿孔后72小时收获细胞，从所述细胞的一部分分离RNA，使用引物对p3/p4通过RT-PCR研究GFP表达。如果GPF基因由于重组而倒位，那么所述引物仅扩增0.99kb长的DNA片段。结果证明，在所有三种细胞系中都可检出产物。如果向细胞内引入pKEX，那么没有产物可检出。所分离的PCR产物的DNA序列分析确认，GFP基因的编码区已被转录，在转录物中可检出attR而不是attP。作为所有六种细胞制备物中的RNA量以及逆转录酶成功合成第一条DNA链的对照，通过PCR分析内源性β-肌动蛋白转录物。结果证明转录物是几乎等量存在的。
还通过基因组DNA的直接PCR检测了重组。结果证明，如果向细胞内引入pKEXInt-h，那么仅能使用引物对p3/p4(0.99kb)和p1/p2(0.92kb)检出预期产物。通过DNA测序分析所述产物确认，基因组中存在attR和attL，且GFP基因被重组所倒位。这些实验已经重复了三次，其中在所有三种细胞系中通过RT-PCR和/或PCR都可检出attB与attP之间的重组。在使用引物对p5/p6时，PCR对GFP基因缺失的检测为阴性。仅能扩增由所整合的载体产生的预期1.3kb片段。
在另一实验中，利用细胞系B3反复得到在PCR中显示attB与attP之间倒位的最强信号。结果是基因组DNA被NcoI片段化，借助GFP基因作为探针通过Southern分析进行检查。结果证明基因组DNA的限制片段在细胞系B3中是可检出的，这是预期的attB与attP之间倒位的结果。
为了试验野生型Int和突变型Int-h/218是否能够催化分子内整合重组，如上实施例2所述在另一实验中通过电穿孔向报告细胞系B3中引入了载体pKEXInt-h、pKEXInt-h/218、pKEXInt和作为对照的pKEX。如上实施例3所述在72小时后分离基因组DNA，利用引物对p5/p7和p3/p4经由PCR检验重组。结果证明两种Int突变体都能够催化attB与attP之间的重组，不过野生型Int是无活性的。
5.3 attL与attR之间的切离重组是不可检出的因为在没有辅因子IHF和Xis的存在下，Int-h还能催化attL与attR之间的切离重组，所以构建三种BL60报告细胞系，其中载体pGFPattL/attR已被稳定地整合到基因组中。所述细胞系仍然包括就CMV启动子而言倒位方向的GFP基因，但该基因位于attL和attR旁侧而不是attB和attP旁侧。如上实施例3所述利用pKEXInt-h作为重组酶的表达载体进行重组分析，不过结果证明借助RT-PCR或PCR都不能在attL与attR之间检出倒位或缺失。
5.4 人类基因组中天然相似于attB的核苷酸序列的鉴别和鉴定正如实施例3所证明的，两种Int重组酶突变体都催化人类细胞中的分子内整合重组。参与该反应的两种重组序列之一、即attB有21bp长，是大肠杆菌基因组的天然部分。能够证明attB的所谓核心识别区序列上的一些差异在与attP重组时可被Int-h所容许(Nash(1981)Annu.Rev.Genet.(遗传学年评)，15，pp143)。人类基因组中与attB同源的功能序列的存在从统计学观点来看是可能的。本发明人在数据库检索中可以将一段仍不完整的序列鉴定为表达序列标记(EST)的一部分。然后从人DNA中分离所述序列并克隆之。DNA序列分析完成了该序列，利用BL60细胞的基因组DNA进行的进一步Southern分析证明，所述序列是作为单一拷贝基因存在于基因组中的仍然未知的人基因的一部分。
所述序列本文称为attH，在三个位置上不同于野生型attB序列。其中两个核苷酸位于左(B)Int核心识别区，第三个是所谓重叠区的一部分。因为两种重组序列重叠区的同一性是被Int-h有效重组的先决条件，所以attP重叠区中0位的单个核苷酸从胸苷变为鸟嘌呤，得到attP*。将attH和attP*作为倒位序列掺入载体(pACH)，在大肠杆菌中检验重组。结果证明在没有IHF的存在下，Int-h和Int-h/218催化attH与attP*之间的倒位。所分离的重组产物的DNA序列分析确认，attH与attP*之间的重组按预期机理发生。相形之下，即使在IHF的存在下野生型Int也仅能非常无效地重组attH/attP*。因而，attH是Int-h催化的包括attP*拷贝的外来DNA的整合所需的有效整合序列。
5.5 人类细胞中attH与attP*之间的分子间整合重组构建pEL13，以证明attH作为人类基因组的天然部分是否能够在分子间反应中与attP*重组。除了处于CMV启动子控制之下的Int-h基因以外，所述载体还包括一个attP*的拷贝，和潮霉素耐药性基因作为选择标记。向BL60细胞内引入pEL13后，能够合成Int-h，由它催化基因组attH与作为pEL13一部分的attP*之间的分子间重组。
如实施例2所述借助电穿孔向BL60细胞内引入pEL13。将所述细胞置于选择压力下，72小时后稀释。利用引物对attx1/B2通过PCR在6至8周后检查从重组事件中幸存的细胞群落。结果证明在31个幸存细胞群落中有13个可检出attH的整合。利用不同方法进行PCR产物的DNA序列分析确认了它们作为重组产物的身份。
序列表<110>彼得.德罗奇(Drge Dr.，Peter)<120>真核细胞中序列特异性DNA重组<130>DR0-001 PCT<140>xx<141>2000-08-29<150>DE 199 41 186.7<151>1999-08-30<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>1ctgctttttt atactaactt g 21<210>2<211>243<212>DNA<213>λ噬菌体<400>2tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240ttc 243<210>3<211>102<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>3ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca ttatttgatt tc102<210>4<211>162<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>4tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg162<210> 5<211>243<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>5tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt gatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240ttc 24权利要求
1.真核细胞中序列特异性DNA重组的方法，包含a)向细胞内引入第一DNA序列，b)向细胞内引入第二DNA序列，和c)通过噬菌体λ整合酶Int进行序列特异性重组。
2.真核细胞中序列特异性DNA重组的方法，所述真核细胞在其基因组中具有第一DNA序列，该序列是天然或者是先前通过DNA重组引入的，所述方法包含如权利要求1所定义的步骤b)和c)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述第一DNA序列包含根据SEQ ID NO1的attB序列或其衍生物，所述第二DNA序列包含根据SEQID NO2的attP序列或其衍生物。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述第一DNA序列包含根据SEQ ID NO3的attL序列或其衍生物，所述第二DNA序列包含根据SEQID NO4的attR序列或其衍生物，其中在步骤c)中另外存在Xis因子。
5.根据权利要求1至4任意一项的方法，其中向该细胞内另外引入第三或第三和第四DNA序列，所述序列分别包含Int基因或Int基因和Xis因子基因。
6.根据权利要求5的方法，所述第三或所述第三和/或第四DNA序列进一步包含能影响Int基因和/或Xis因子基因的空间和/或时间表达的调节性DNA序列。
7.根据权利要求1至6任意一项的方法，其中所述Int是经过修饰的整合酶。
8.根据权利要求7的方法，其中所述经过修饰的Int是Int-h或Int-h/218。
9.根据权利要求1至8任意一项的方法，其中步骤c)还包含“整合宿主因子”(IHF)。
10.根据权利要求1至9任意一项的方法，所述第一和/或第二DNA序列进一步包含这样的DNA序列，它们通过同源性重组使所述第一和/或第二DNA序列整合至真核细胞基因组内。
11.根据权利要求1至10任意一项的方法，所述第一和/或第二DNA序列进一步包含编码目标多肽的核酸序列。
12.根据权利要求11的方法，其中所述目标多肽是结构蛋白、内源性或外源性酶、调节蛋白或标记蛋白。
13.根据权利要求1和3至12任意一项的方法，其中在真核细胞的同一DNA分子内引入所述第一和第二DNA序列。
14.根据权利要求1至13任意一项的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
15.根据权利要求14的方法，其中所述哺乳动物细胞是人、猴、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、牛、绵羊或猪的细胞。
16.根据权利要求1至3和5至15任意一项的方法，进一步包含d)在根据步骤a)至c)或者在没有Xis因子时根据步骤a)与b)的第一步序列特异性DNA重组之后由Int和Xis因子进行第二步序列特异性DNA重组。
17.根据权利要求16的方法，进一步向所述细胞内引入另外的DNA序列，该另外的DNA序列包含Xis因子基因。
18.根据权利要求17的方法，其中所述另外的DNA序列包含另外的能影响所述Xis因子基因的空间和/或时间表达的调节性DNA序列。
19.根据SEQ ID NO1的attB序列或其衍生物和根据SEQ ID NO2的attP序列或其衍生物或者根据SEQ ID NO3的attL序列或其衍生物和根据SEQ ID NO4的attR序列或其衍生物在真核细胞中序列特异性DNA重组中的用途。
20.根据SEQ ID NO5的核酸序列或其衍生物。
21.载体，包含根据SEQ ID NO5的核酸序列或其衍生物和另外的编码治疗基因的核酸序列或其DNA片段。
22.根据权利要求21的载体，其中所述治疗基因是CFTR基因、ADA基因、LDL受体基因、β-球蛋白基因、VIII因子或IX因子基因、α-1-抗胰蛋白酶基因或肌营养不良蛋白基因或者所述基因之一的基因片段。
23.根据权利要求21或22的载体，其中所述另外的核酸序列包含另外的表达和/或转录元件。
24.根据权利要求21至23任意一项的载体，用作人或兽医药物。
25.根据权利要求21至23任意一项的载体的用途，用于制造躯体基因疗法药物。
26.真核细胞，可通过权利要求1或2所述真核细胞受到根据权利要求1至18任意一项的方法处理而获得。
27.转基因生物，包含至少一个根据权利要求26的细胞。
28.根据权利要求27的生物，其中所述生物是小鼠、大鼠、兔或仓鼠。
全文摘要
本发明涉及真核细胞中序列特异性DNA重组的方法,包含向细胞内引入第一DNA序列,向细胞内引入第二DNA序列,通过噬菌体λ整合酶Int进行序列特异性重组。优选的发明实施方式涉及这样一种方法,进一步包含通过Int和Xis因子进行序列特异性DNA重组。本发明进一步涉及载体和它们作为药物的用途。
文档编号A61P7/00GK1387576SQ00815104
公开日2002年12月25日 申请日期2000年8月29日 优先权日1999年8月30日
发明者彼得·德罗奇, 尼科尔·克赖斯特, 埃尔克·洛尔巴赫 申请人:彼得·德罗奇