专利名称：胰岛素b链基因疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗自身免疫性糖尿病的保护性新型疫苗，本发明特别涉及新的用于预防自身免疫性糖尿病发病的基因疫苗，该疫苗能提供抗自身免疫性糖尿病的保护作用。
目前糖尿病已成为严重危害人民身体健康的三大疾病之一，自身免疫性糖尿病占总发病率的10～15％，研究表明自身免疫性糖尿病为细胞免疫介导的，具有MHC限制性的。胰岛B细胞被特异性破坏的器官特异性疾病，其发病早，而且目前所有治疗措施均不能阻止其并发症的发生。
现在，临床上所应用于治疗自身免疫性糖尿病的药物是胰岛素，该药的应用明显延长了自身免疫性糖尿病患者的生命，但不能阻止其并发症的发生。因此，预防自身免疫性糖尿病的发生、防止其并发症的出现是一个具有普遍性的难题。
有很多资料报道了应用免疫抑制剂预防自身免疫性糖尿病的发生，目前己逐步应用了如强的松、环孢霉素A、Rapamycin、FK506等进行了研究。应用于临床并取得了一定疗效的药物是环孢霉素A，但由于其可引起肾、肝损害，内分泌系统紊乱等原因，限制其长期、有效的使用。
另外也有报道应用免疫调节剂纠正自身免疫性糖尿病免疫功能紊乱常用的有白细胞介素4、白细胞介素1、CD3单克隆抗体、CD4单克隆抗体，以及自身抗原、谷氨酸脱羧酶和胰岛素等。一些研究显示口服胰岛素可以有效地防止NOD小鼠发生糖尿病，这种免疫治疗作用是通过CD4+T淋巴细胞以及抗免疫型细胞因子，诸如白细胞介素4、白细胞介素10等发挥作用的。Bellman等实验显示自身免疫性糖尿病口服胰岛素的治疗机制是使胰岛B细胞周围浸润的单个核细胞由CD4+Th1淋巴细胞转变为Th2淋巴细胞。但是口服抗原后，由于消化道的消化作用以及粘膜免疫等作用，使其产生的免疫反应较弱，所需剂量过大，其在临床的应用价值有待进一步的探讨。
本发明的目的在于提供一种胰岛素B链基因疫苗制剂，该制剂能有效地预防大部分自身免疫性糖尿病的发生。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案在于采用了一种胰岛素B链基因疫苗制剂，该制剂含有胰岛素B链基因、质粒DNA。
本发明的制剂为可以直接作为基因疫苗的特别优选的重组DNA质粒以及编码胰岛素B链片段的基因。
胰岛素基因是研究工作者们认识较早的一个功能基因，在本实施例中应用胰岛素基因的序列信息设计寡核苷酸引物，用于从机体中用聚合酶链反应(PCR)扩增该基因，新设计的引物两端含有HindⅢ和EcoRⅠ两个限制性内切酶识别弱点，使扩增的质粒可以通过相出的限制性内切酶切后直接克隆到一个质粒载体上，此两种限制性内切酶仅作为举例，而不能视为排除其它限制性内切酶。
在本发明中所使用的优选DNA构建物优点在于允许该构建物在微生物中进行繁殖，如大肠杆菌，通过这种方法构建成功的DNA构建物可进行大量结构相同的繁殖。
当新克隆出的胰岛素B链基因以直接方式插入质粒DNA而直接整合出一个完整的表达基因，即在机体内表达出胰岛素B链，这种肽段可以通过机体的抗原递呈细胞在体内发挥作用。
本发明特别有利之处在于，以非常低剂量的抗原，该疫苗组合物也能诱导机体出现有效的免疫保护作用。
该新型免疫可以根据动物个体、种属、免疫特征的不同而不同，但是在对下面实施例中的小鼠动物模型进行免疫接种时，我们发现，应用该新型疫苗剂量20～100μg时，按免疫程序能有效地提供保护作用。
本发明所提供的新型疫苗为非口服载剂，可用微滴或其它微束体形式进行接种，它们可以有效地将免疫反应物运送到细胞，从而引发免疫耐受反应，并可以有效地降低或抑制免疫反应以及氧自由基对胰岛B细胞的破坏作用。
以下具体说明本发明的实质内容及其优点。
一、胰岛素B链基因疫苗的制备材料与方法用于培养的材料来自Gibco、Sigma公司。DNA操作的酶来自中国华美公司，按产品说明进行操作，其它实验试剂分别来自Fluka公司。单克隆抗体来自Sigma公司。菌株及培养大肠杆菌JM109按《分子克隆》中介绍方法培养和保存。胰岛素B链制备处死大鼠，分离胰腺细胞，提取胰岛细胞RNA。根据基因文库的报道(未申请专利)合成两端带有HindⅢ和EcoRⅠ的引物aagctttttgtcaaacagcacctttg agaagatgagagggaaccggcttaag(美联公司)，在PCR仪(华美公司)中，94℃变性60秒钟、58℃退火60秒钟、72℃延伸90秒钟的循环中扩增3035循环，获得胰岛素B链片段，应用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切该片段，并与同样处理后的pcDNA3质粒连接，构建成为胰岛素B链基因疫苗，然后将其转运到大肠杆菌JM109菌株中扩增。
胰岛素B链基因疫苗在大肠杆菌中的扩增大肠杆菌JM109在含有青霉素、链霉素的LB培养液中培养到适当的光吸收值，然后加入异丙基-beta-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养，并进行质粒鉴定，以确定所得到的为胰岛素B链基因疫苗。
二、对应用胰岛素B链基因疫苗进行治疗和预防自身免疫性糖尿病的研究为进一步证实胰岛素B链基因疫苗对自身免疫性糖尿病小鼠的防治作用，本实施例在自身免疫性糖尿病发病前后分别应用胰岛素B链基因疫苗后，进行了研究自身免疫性糖尿病小鼠的模型按Paik等方法制备，连续5天腹腔内注射溶于pH4.5 0.1mmol/L柠檬酸缓冲液中的链脲佐菌素50mg/kg。实验分组第1组对照组B57CL/6小鼠，未制作糖尿病动物模型，肌肉注射0.9％氯化钠溶液第2组糖尿病组按上述方法制作糖尿病动物模型，发病后肌肉注射0.9％氯化钠溶液第3组胰岛素B链基因疫苗治疗组糖尿病小鼠，发病后肌肉内注射含胰岛素B链基因疫苗的0.9％氯化钠溶液第4组胰岛素B链基因疫苗预防组在制作糖尿病动物模型之前，注射含胰岛素B链基因疫苗的0.9％氯化钠溶液在实验过程中，小鼠饲养环境保持在温度18～27℃，相对湿度为＞70％，灯光照射12小时，胰岛素B链基因疫苗注射时间为0800～0900之间。实验结果1、应用胰岛素B链基因疫苗防治糖尿病小鼠后，小鼠糖尿病发病率的变化表1 胰岛素B链基因疫苗对自身免疫性糖尿病小鼠的影响
从表1可以得出1)预防性应用胰岛素B链基因疫苗，第1周无1例发生糖尿病，第2周糖尿病的有效率为70％，第3、4周维持在60％，较同期的糖尿病组和治疗组明显降低(P＜0.005～0.01)；2)对于糖尿病组和治疗组，通过检测血糖、尿糖发现，无1例出现糖尿病缓解。
2、应用胰岛素B链基因疫苗防治糖尿病鼠后，小鼠糖尿病血糖的变化如表2所示，1)在自身免疫性糖尿病小鼠，在发病后第1周到第4周，血糖稳定为20.28±1.75mmol/L、19.34±2.33mmol/L、20.33±2.31mmol/L和19.30±1.83mmol/L，较对照组呈显著性升高(P＜0.01)；2)预防性应用胰岛素B链基因疫苗后，可以有效地使大多数具有糖尿病发病倾向小鼠的血糖维持在8.02±0.99～9.00±0.76mmol/L之间，明显低于糖尿病组3)小鼠发病后，应用胰岛素B链基因疫苗并不能有效地降低血糖。
表2 胰岛素基因疫苗对自身免疫性糖尿病糖尿病小鼠血糖的影响(mmol/L)
3、应用胰岛素B链基因疫苗防治糖尿病鼠后，小鼠胰岛分泌胰岛素的变化表3胰岛素B链基因疫苗对自身免疫性糖尿病糖尿病小鼠胰岛素的影响(mIU/L)
预防性应用胰岛素B链基因疫苗4周后，可以有效地使多数小鼠的胰岛素浓度维持在47.75±3.30～52.40±5.50mIU/L之间，和对照组相比，无显著性差异。而在糖尿病发病后，再应用胰岛素基因疫苗不能使血中胰岛素的含量升高。糖尿病组小鼠血中胰岛素的浓度＜5mIU/L。(见表3)4、应用胰岛素B链基因疫苗防治自身免疫性糖尿病鼠后，小鼠胰岛的变化糖尿病发生第4周以及应用胰岛素B链基因疫苗4周后，处死各组小鼠，做常规病理性检测，显微镜下发现1)糖尿病组小鼠胰岛数目减少、部分胰岛细胞周围仍可见浸润的炎症细胞，胰岛细胞被破坏；2)治疗组小鼠病理改变和糖尿病组相似，说明已发病的糖尿病小鼠在注射胰岛素B链基因疫苗后，并不能有效的抑制机体内的免疫反应。3)预防性应用胰岛素B链基因疫苗后，多数小鼠在实验观察期间未发生糖尿病，尽管此种小鼠部分胰岛β细胞仍然被破坏，但是未发现胰岛周围出现浸润的炎症细胞，而预防组内注射胰岛素基因疫苗未阻止糖尿病发生的小鼠，其病理变化和糖尿病组相似。
权利要求
1.一种胰岛素B链基因疫苗制剂，其特征在于该制剂含有胰岛素B链基因、质粒DNA。
2.根据权利要求1所述的基因疫苗制剂，其特征在于所述的制剂为可以直接作为基因疫苗的特别优选的重组DNA质粒以及编码胰岛素B链片段的基因。
全文摘要
本发明涉及抗自身免疫性糖尿病的保护性新型疫苗,本发明特别涉及新的用于预防自身免疫性糖尿病发病的基因疫苗,该疫苗能提供抗自身免疫性糖尿病的保护作用。该制剂含有胰岛素B链基因、质粒DNA。所述的制剂为可以直接作为基因疫苗的特别优选的重组DNA质粒以及编码胰岛素B链片段的基因。
文档编号A61K48/00GK1322574SQ0110904
公开日2001年11月21日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者钱庆文, 汪恕萍, 钱书虹, 霍东霞 申请人:钱庆文, 汪恕萍, 钱书虹, 霍东霞