以壳多糖或其衍生物为基质网架的复层人工皮肤的制作方法

专利名称：以壳多糖或其衍生物为基质网架的复层人工皮肤的制作方法
技术领域：
本发明涉及体表伤口覆盖和修复材料。具体地说，本发明涉及以壳多糖多孔网架为基质材料，包括具有生命活力的表皮层和真皮层的复层人工皮肤。本发明进一步涉及制备所说的复层人工皮肤的方法，以及制备应用此复层人工皮肤修复由各种原因造成的人类或其它哺乳动物的皮肤组织缺损，使受损组织再生。
在人体的生命活动中，常见因机械创伤、物理、化学及生物损伤等原因造成身体局部软组织，特别是皮肤的缺损。当损伤累及真皮时(如烧伤)，一般很难再生，而常常是在受损伤区域形成结缔组织瘢痕以替代皮肤组织。在临床上，虽然曾可以使用自体组织移植、同种异体组织移植(如使用单合子双胞胎的组织)，或异种组织移植(如使用经过处理的猪皮、胎牛皮及羊皮等)方法，或使用天然或化学合成材料覆盖物(如使用聚酯纤维、交联的聚乙烯醇泡沫片层等)，暂时填充和覆盖受损的皮肤伤面。但上述方法均有不可克服的缺点。自体组织移植实际上是以伤治伤，移植材料来源有限；异体移植难以克服免疫排斥反应；化学合成覆盖物的组织相容性差，不利于渗出物排出等等。近年来，市场上也出现了许多皮肤代用品，以及所谓的“人工皮肤”。已知这些人工皮肤包括以胶原蛋白为原料制备的胶原蛋白膜，和以水生生物的壳多糖为原料的无纺纤维形式的壳多糖膜，以及冻干的猪皮和血纤蛋白膜等。然而，这些人工皮肤均不能提供令人满意的治疗效果，因为这些所谓的人工皮肤都是无生命活力的暂时的皮肤覆盖物。无皮肤细胞成分，其组织相容性差，柔韧性差，最终要脱落，需二次皮肤移植，也不能有效地促进原位细胞增殖和正常新生组织的长入。
作为与本发明密切相关的现有技术，这里可提到的例如美国专利5,698,228号提供了一种包括迭合到鱼皮胶原蛋白层上的鱿鱼壳多糖的皮肤伤口愈创组合物，其优点是具有良好的柔软性，并可促进溶菌酶的产生，以保护伤口。同时，该组合物还有利于成纤维细胞的粘附与增殖。另外，美国专利4,651,725号描述了一种适用于敷盖皮肤缺损创面的，包括壳多糖无纺纤维(纤度小于1但尼尔，强度大于2g/d)和高分子材料制成的粘合剂的伤口敷料。所说的伤口敷料具有较好的组织相容性、柔韧性和适配性。因此，在以前利用壳多糖作为组织工程材料，用于制造皮肤培养物或皮肤替代物的方法中，基本上都是制成膜片或无纺纤维压片，在接种或不接种自体和异体细胞的情况下，直接用来敷盖皮肤伤口表面。这些材料的缺点包括难以使自体或异体细胞在其表面上生长、增殖、不能从被覆盖的伤口表面为细胞提供营养支持、被覆盖的伤口局部有过多渗出液积聚、敷盖物易于被伤口渗出液分解及皱缩，进而脱落等。
Eugene Bell等人(参见Science，2111052-1054，1981)通过大量培养从皮肤组织分离的表皮细胞和成纤维细胞，并在已掺入了成纤维细胞的胶原蛋白凝胶上成层地接种表皮细胞，以得到皮肤培养物。Steven Boyce等人(参见Surgery，103421-431，1988)也报导了大量培养得自皮肤的表皮细胞，在海绵状胶原蛋白基质上成层培养和增殖这些细胞的方法。其中所说的海绵状基质是在胶原蛋白中加入少量硫酸软骨素而制得的。再者，美国专利6,043,089号公开了一种以胶原蛋白材料为基质，并在此基质上接种了皮肤细胞的皮肤细胞培养物及其制备方法。迄今，在所查国内外文献、专利中，尚未见将壳多糖或其衍生物用作基质网架的人工皮肤。
作为本发明的前期工作，本课题组在以前多年从事人工真皮和复层人工皮肤研究中，已应用哺乳动物(包括人)胶原蛋白作为基质网架，成功地构建了具有与天然皮肤相似结构和功能的复层人工皮肤(参见刘晋宇等，中国修复重建外科杂志，15(4)235-239，2001；马刚等，中华皮肤科杂志，31(2)121-122，1998)。本发明人考虑到壳多糖或其衍生物如脱乙酰壳多糖作为复层皮肤基质材料的种种优良性质，在上述前期工作的基础上，使用壳多糖或其衍生物的多孔三维结构为基质网架，进一步制备了具有表皮和真皮双层结构的组织工程化人工皮肤，从而完成了本发明。
此外，还应用壳多糖或其衍生物的三维基质网架构建成了软骨组织，表明此网架具有良好的塑型性质。为其应用于构建其它组织工程构件提供了线索。
①本发明的目的是提供一种人工复层皮肤，用于创伤早期阶段重建或愈合受损创面的皮肤组织。特征在于使用壳多糖或其衍生物的多孔三维支架作为人工皮肤基质网架，在此基质网架的接近伤口的内侧面接种和培养成纤维细胞，并在此基质网架对着伤口的外侧接种并培养表皮角质形成细胞。形成了具有表皮和真皮的复层人工皮肤。
②根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质网架的最佳厚度约为1.5mm。
③根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的壳多糖衍生物包括脱乙酰壳多糖。
④根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的生长因子为表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。
⑤根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质网架或空隙内含有适当浓度的生长因子和透明质酸。


图1显示复层人工皮肤的构建流程。
图2显示按本发明方法制备的壳多糖基质网架的扫描电镜结构。
图3-1(HE×100)和图3-2(HE×400)分别显示在动物全层皮肤缺损部位植入按本发明方法制备的复层人工皮肤后14天时的组织学改变。
图4-1和图4-2分别显示带有背部皮肤缺失(直径2.5cm)的实验动物(裸鼠)，按本发明制备的复层人工皮肤和作为对照的未接种皮肤细胞的壳多糖膜片在移植于皮肤缺损部位后的修复改变。
本发明涉及用于敷盖和修复人和哺乳动物因各种原因引起的皮肤缺损的复层人工皮肤(包括表皮和真皮)制备方法。特征在于，所说的复合人工皮肤是以冻干后得到的多孔海绵状壳多糖或其衍生物作为三维基质网架材料。本发明的组织工程化人工复合皮肤具有良好的组织相容性、足够的生物力学强度、被接种的表皮和真皮细胞能够良好地生长和增殖，且能与创面周边正常皮肤组织充分融合。另外，本发明的复层人工皮肤具有合成和分泌细胞外基质(如胶原蛋白和蛋白多糖)的能力，表明此人工皮肤是有生命活力的“活皮肤”。因而，其完全可以作为“真正人工皮肤等同物”在临床上广泛应用。
与其它组织工程一样，皮肤组织工程研究中同样包括具有三维结构的细胞外基质网架、相应组织细胞(包括干细胞)，以及调控相应组织细胞生长、增殖与分化的生长因子这三个基本要素。迄今，用于构建人工皮肤的细胞外基质或网架材料大多是经过处理的生物来源的胶原蛋白，尚未见使用天然壳多糖或其衍生物如部分脱乙酰化的壳多糖作为构建人工复层皮肤的基质材料的报导。本发明人在以前长期从事组织工程学研究的基础上，首先成功地制备了海绵状壳多糖或其衍生物(如脱乙酰壳多糖)人工复层皮肤基质网架材料，并用于复层人工皮肤的制备。
壳多糖是通过β-1，4糖苷键连接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖单位所形成的线性多糖。昆虫和甲壳动物如蟹、龙虾和河虾等的外骨骼含有大量的壳多糖，使之成为自然界具有这一特征性多糖并仅次于纤维素的第二种最丰富的生物聚合物。然而，由于壳多糖对许多常用的含水溶剂或有机溶剂都呈惰性反应，所以既不稳定也不易于加工。为此，后来市场上又出现了经过加工的壳多糖衍生物如脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多糖是部分或全部脱乙酰基的壳多糖，并且是由单体β-(1，4)-D-氨基葡糖单位(约占60％)和单体β-(1，4)-N-乙酰-D-氨基葡萄糖单位(约占40％)组成的多糖。脱乙酰壳多糖及其衍生物可溶于富马酸、乙酸、丙酸等有机酸，有些衍生物如D-羧甲基脱乙酰壳多糖甚至可溶于水。由于脱乙酰壳多糖具有良好的组织相容性和生物可降解性，而且具有抑制细菌生长和促进伤口愈合等有益的生物学性质，所以在医学领域可将其用于制作手术缝合线、创面覆盖物、免疫佐剂及药物缓释剂等。特别是在作为药物缓释剂的应用方面，例如美国专利4,946,870号公开了含有氨基多糖(即壳多糖)衍生物，用于向局部粘膜缓慢释放药物的药物缓释系统。另外美国专利5,422,116号还公开了含有脱乙酰壳多糖的眼科药物缓释组合物。
一般说来，溶解脱乙酰壳多糖所需酸的量大约相当于分子中氨基基团的化学计算量。另外，为得到可溶性产物，所需的壳多糖脱乙酰化程度必须在80％以上，即脱乙酰壳多糖的乙酰含量必须小于4～4.5％。因此，脱乙酰壳多糖并不是一种单一的、明确的化学实体，而是基于生产条件的不同而产生的组合物。
为了制备用于本发明的人工皮肤的基质网架，例如可将自制的或从市场上购得的脱乙酰度大于85％的脱乙酰壳多糖溶解在选自甲酸、乙酸、丙酸、酒石酸、富马酸和柠檬酸等有机酸的稀溶液中，制成浓度为1～5％的溶液，然后加入适当量的生长因子(如EGF和FGF)及透明质酸。将混合物高速搅拌至形成均匀的泡沫状物后，按一定厚度倒入不同大小的铸型槽内并直接放入冻干装置中冷冻干燥。冻干后，可用适当浓度的强碱(如NaOH)溶液浸泡2～4小时，再用蒸馏水洗至中性，干燥并消毒后即可用于植入成纤维细胞和角质形成细胞。
全层皮肤是由表皮、真皮和皮下组织三部分组成的。其中，表皮主要包括处于不同增殖、分化阶段的角质形成细胞(KC)及少量的非角质形成细胞。表皮角质形成细胞是构成皮肤表皮的主要细胞，其正常增殖和分化直接影响到表皮的正常结构和功能。因此，角质形成细胞的体外培养一直是人工皮肤重建技术中的一个普遍问题。迄今为止，已建立的角质形成细胞培养方法包括滋养层培养法(Cuono et al，Plast Reconstr Surgery 80(4)626-635，1987)、无血清培养法(Steven et al，Surgery 103(40)421-431，1988)和气液面培养法(Boyce et al，J Biomed Mater Res 22937-957，1988)。本发明经过对几种方法的比较实验发现，以中性蛋白酶和胰蛋白酶联合消化法分离表皮细胞，使用NIH3T3细胞作为滋养层，并使用含血清培养基和低接种密度培养表皮角质形成细胞，可实现表皮角质形成细胞的最佳分离和培养效果。应特别指出的是，本发明人在进行了大量预实验的基础上，特别设计了除含有胎牛血清和抗生素及HEPES外，还含有适当量的胰岛素、转铁蛋白、三碘甲腺原氨酸、霍乱毒素、氢化可的松及多种细胞生长因子的DMEM培养基。培养结果显示，在这样的细胞培养基中，角质形成细胞增殖速率明显提高，而且细胞传代效果良好。
作为真皮组织的构成细胞，成纤维细胞(FB)具有合成并分泌细胞外基质及细胞因子的功能，其在组织形成、器官发生及创伤修复中发挥重要作用。例如，成纤维细胞借助其自身趋化因子向靶位点移行、聚集并活化，同时产生并分泌胶原蛋白以形成一系列胶原组织，进而导致组织再生和创伤修复。目前，已建立的皮肤成纤维细胞的分离培养方法包括组织块培养法、胶原酶消化法和胶原酶与中性蛋白酶联合消化法。本发明选用胶原酶和中性蛋白酶联合消化法分离，并使用含有15％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基按常规方法培养成纤维细胞。一般说来，培养7～8天，细胞即可在培养瓶内形成细胞单层。
为了制备本发明的以壳多糖或其衍生物为基质网架的复层人工皮肤，可以将如上制备的壳多糖基质网架用细胞培养液和乙醇溶液(75％)浸泡并用紫外光照射杀菌后，依次在该海绵状网架两侧分别接种有适当细胞密度的，按上述方法分离纯化并传代培养的表皮角质形成细胞(创面远侧)和成纤维细胞(紧贴创面侧)。其间，可于接种成纤维细胞后，将附着于网架上的细胞培养4～6天，然后，再在对侧表面接种表皮角质形成细胞。将接种了两种皮肤细胞的基质网架依次在培养基液面上和液气界面上分别培养不同时间。当表皮细胞生长分化到具有层次分明的各层，最表面(角质层)细胞渐变扁平，而且真皮层有大量成纤维细胞及由之产生并分泌的细胞外基质堆积时，即可将所得到的复层人工皮肤材料移植到动物实验模型的皮肤创面上，借以观察本发明的复层人工皮肤对皮肤创伤的治疗和修复效果。本发明复层人工皮肤的构建流程如附图1所示。
观察结果显示，移植后7天即可见本发明的以壳多糖为基质材料的复层人工皮肤与周围正常皮肤组织融合良好，表皮变厚并出现角化现象，同时真皮层细胞数目增多，基质网架逐渐被细胞分解。移植第14天后，可见毛细血管数目迅速增加，且表皮层与真皮层接合良好。移植后第21天，移植物与创面周围正常皮肤基本融合为一体，基质网架基本消失，而代之以新生的皮肤细胞和细胞外间质。
本发明对现有技术的一个重要改进在于使用组织相容性良好，具有消炎抑菌、促进伤口愈合及毛细血管再生，而且材料来源广泛、成本相对较低的壳多糖或其衍生物代替目前普遍使用的胶原蛋白作为制备复层人工皮肤的基质。已有研究结果显示，壳多糖是构成细胞外壁的重要多糖类物质，其本身很易于被组织溶菌酶分解。因此，壳多糖较胶原蛋白更具有某些独特的优点。我们的实验研究结果进一步表明，使用壳多糖或其衍生物作为复层人工皮肤的基质网架材料，更有利于接种其它的皮肤细胞的生长和增殖、产生细胞外基质，局部毛细血管生成与重建，从而大大加速了创伤部位皮肤组织的再生与修复。本发明的研究成果为使用壳多糖基质材料，制备“活”的组织工程复层人工皮肤，并为最终将组织工程皮肤应用于临床提供了成功的经验，也为将来使用壳多糖作为基质网架构建其它组织或器官提供了可供借鉴的实验基础。
以下借助具体实施例进一步举例描述本发明，但本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明精神和原则的前提下，对本发明所涉及的某些技术细节所作的任何改动和改变，均将落入本发明待批权利要求范围内。
实施例1本实施例使用从大鼠皮肤分离并纯化的表皮和真皮细胞，使用主要由壳多糖材料制备的海绵体作为基质网架，以制备复层人工皮肤，并观察其在裸鼠受体的皮肤组织创伤修复中的积极效果。
(1)大鼠皮肤组织细胞的分离和纯化选择健康成年大鼠，在麻醉下从动物背部切取约3×3cm大小的全层皮肤。用75％乙醇浸泡3分钟后，再用1∶10稀释的D-Hanks液(每升含有4g KCl、0.6g KH2PO4、80g NaCl、2.50g NaHCO3和0.8g Na2HPO4·12H2O)洗3次。将皮肤组织切成5×5mm小块并用中性蛋白酶(40g/L)室温下消化24小时，然后剥离出表皮和真皮组织。
将表皮组织用含有胰蛋白酶(0.25g/L)和EDTA(0.1g/L)溶液，37℃消化5分钟后，将消化产物过200目网筛。再用含有青霉素(105单位/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM培养基将细胞洗3次后，以苔酚兰染色法检查细胞的存活性。然后在含有15％(v/v)胎牛血清、青霉素(105单位/L)和链霉素(100mg/L)、胰岛素(6mg/L)、转铁蛋白(5mg/L)、氢化可的松(0.8mg/L)和表皮生长因子(20μg/L)的DMEM培养基中并在6.8％CO2环境下，37℃培养细胞。
将真皮组织用I型胶原酶(2.5g/L)37℃消化4小时后，基本上按上述处理表皮组织的同样方法处理，并使用含有胎牛血清(15％，v/v)、HEPES(10mM)和抗生素(青霉素和链霉素，浓度同上)的培养基，在5％CO2环境下37℃培养细胞。
待两种细胞均增殖到足够的细胞密度(1～5×106细胞/ml)后，再次按常规方法进行细胞形态学鉴定。然后在液氮或-70℃冰箱中冻存这些种子细胞。细胞冷冻和复苏过程中，为防止细胞受损，须在细胞冷冻液中加入二甲基亚砜(DMSO)和甘油作为保护剂，并选择合适的冷冻和冻融速度。本实施例中所使用的细胞冷冻液为添加有10％(v/v)DMSO的上述培养基，冷冻速度为-1℃/分。将细胞悬液分装于1ml冷冻管中完成冷冻和复苏过程。使用时，将冷冻管从液氮罐或低温冰箱中取出并直接放入37℃水浴箱中振荡，直到内容物完全融化。低速离心细胞后，加入新鲜培养基并按常规方法继续培养。
使用丝裂霉素(4mg/L)处理的NIH3T3细胞作为滋养层细胞，在滋养层细胞上接种角质形成细胞(2.0×104/cm2)后于37℃和6.8％CO2条件下培养之。每隔3天更换培养液，约10天后细胞生长连成细胞单层。反复用含EDTA(0.1g/L)的胰蛋白酶(0.25g/L)溶液简单消化后，继续培养细胞并传代。
另外，将分离并培养的成纤维细胞悬液按1.0×105/cm2密度接种于玻璃培养瓶中，基本上按照上述培养角质形成细胞的常规方法培养并传代。
以常规染色排除法(使用噻唑蓝(MTT)染料)或集落形成率检测法定量检测细胞存活率，并确定生长曲线。
(2)以壳多糖为基本基质材料的复层人工皮肤基质网架的制备将精制的市购壳多糖(吉林德鑫生物技术公司生产，脱乙酰度＞87％)溶解于1.5％乙酸中制成2％(w/v)壳多糖溶液。将所得到的溶液快速(2000rpm)搅拌至泡沫状，然后在平底浅盘中铸型并冷冻干燥，得到厚度约1.5mm的人工皮肤基质网架。
按本发明所述方法制备的人工皮肤基质网架的形态学超微结构如图2所示。
(3)复层人工皮肤的制备首先，将经过培养并传代纯化的成纤维细胞按3.0×105细胞/cm2的密度接种于上述步骤(2)中制备的壳多糖基质网架的一个侧面上，37℃培养4天(中间更换培养液1次)。然后，将经过上述同样方法处理的角质形成细胞按4.0×105细胞/cm2的密度接种于该基质网架的另一侧。将接种两种皮肤细胞的基质网架置于上述培养角质形成细胞的复合培养基中，37℃继续培养6天(培养过程中更换培养液2次)，然后改用气液面培养法继续培养。培养完成后，即可将该人工复层皮肤移植物用于同体或同种动物皮肤及皮下部分软组织损伤创面的治疗和修复。
(4)本发明的复层人工皮肤在修复裸鼠皮肤创伤中的应用及效果观察以背部人为造成全层皮肤缺损(1.5×1.5cm)的成年裸鼠作为实验动物模型。创伤后2小时，以接种成纤维细胞的一侧贴近创面，将如上制备的复层人工皮肤(1.5×1.5cm)移植到创伤部位。移植后，每隔3天通过大体观察、光镜和电镜组织学检查，以及红外热像扫描技术观察并分析本发明的复层人工皮肤对受体动物皮肤创伤的修复效果。结果可见，移植术后3天移植物与正常皮肤组织融合良好，且与创面贴合紧密。移植6天后镜下可见有少量毛细血管从周围正常组织向移植物内长入，且长入移植物基质内的新生毛细管数量逐渐增多。移植的人工皮肤与其周围正常皮肤颜色十分接近。术后9天，可见移植物区域毛细血管大量增加，表皮层清晰可见层次分明的基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，并可见表层有角质化细胞层剥离脱落，同时可见真皮层细胞数量及细胞外基质显著增加，并且基质网架已几乎全部被吸收并被这些增殖的细胞及其所分泌的细胞外基质所取代(参见图3-1和3-2)。术后15天，大体可见创面已基本愈合，修复区皮肤颜色正常，并且所残留的瘢痕极少(参见图4-1和4-2)。
权利要求
1.一种用于创伤早期阶段重建或愈合受损伤的皮肤组织的人工复层皮肤，特征在于其中使用壳多糖或其衍生物多孔海绵作为细胞培养物基质骨架，并在所说的基质骨架的接近伤口的内侧面接种和培养成纤维细胞，同时，在所说的基质的对着伤口的外侧接种并培养表皮角质形成细胞。
2.根据权利要求1的复层人工皮肤，其中所说的基质骨架的最佳厚度约为1.5mm。
3.根据权利要求1的复层人工皮肤，其中所说的壳多糖衍生物还包括脱乙酰壳多糖。
4.根据权利要求1的复层人工皮肤，其中所说的基质骨架或空隙内含有适当浓度的生长因子和透明质酸。
5.根据权利要求1的复层人工皮肤，其中所说的生长因子选自表皮生长因子和成纤维细胞生长因子。
全文摘要
本发明总的涉及体表伤口覆盖和修复材料。更具体地说,本发明涉及以壳多糖多孔网架为基质材料,包括有生长的表皮和真皮层的复层人工皮肤。本发明进一步涉及制备所说的复层人工皮肤的方法,以及所说的复层人工皮肤在覆盖和修复人或其它哺乳动物的皮肤及皮下组织缺损中的应用。
文档编号A61L27/00GK1363398SQ0210007
公开日2002年8月14日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者侯立中, 杨同书, 颜炜群, 周余来, 侯宜 申请人:吉林大学