专利名称：用于治疗对PPAR－γ受体的活化有响应的病变的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及螺莱素(spirolaxine)在治疗这些对PPARγ受体(过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体)的活化有响应的病变如2型抗胰岛素性糖尿病中的应用。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含作为用于治疗对PPARγ受体的活化有响应的病变如急性恶性血液病的活性成分的螺莱素和全反式视黄酸。
PPARγ是核受体总科的成员。其与类视黄醇X受体(RXR)异二聚体化并可作为与葡萄糖和脂质代谢相连的基因的转录调节剂(Diabetes47(4)507 1998年4月14日)。
糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而导致的综合征；其特征为胰岛素分泌和其它代谢紊乱以及血管异常，即血液中葡萄糖浓度升高、非特异性的动脉粥样硬化加速、神经病和由肾和视网膜变性而导致的毛细管基底层加厚。
根据现代分类，糖尿病主要被分成两类1-胰岛素依赖性糖尿病(也被称为1型糖尿病)；患有这种类型糖尿病的患者完全依赖于胰岛素来防止酮酸中毒和死亡。就内源性胰岛素分泌而言，患有1型糖尿病的患者表现为胰岛素分泌减少。
2-非胰岛素依赖性糖尿病(也被称为2型糖尿病)；患有这种类型糖尿病的患者不需要胰岛素来生活他们可以决定是否用其来控制糖尿病的症状。就内源性胰岛素分泌而言，患有2型糖尿病的患者可被进一步分为两类。在第一类中，胰岛素水平正常或低于正常；在第二类中，胰岛素值高于正常并且患者表现出抗胰岛素性。
如上所述，PPARγ还可作为与脂质和葡萄糖代谢有关的基因的转录调节剂。
可用于糖尿病的治疗的胰岛素敏化药，PPARγ的配体已经是已知的。
例如，将噻唑烷二酮衍生物描述为可用于治疗患有2型抗胰岛素糖尿病患者的物质。这些化合物是PPARγ的高亲和力配体；其由于在体内对所说受体具有高连接亲和力而具有抗糖尿病活性(NipponRinsho 2000年二月；58(2)401-4)。
类似地，PPARγ在一些白血病细胞系中具有高水平的表达，其不能进行区分使得随后在最不成熟水平上发生累积(Jan，Exp.4，281-99，1995)。
急性恶性血液病是血癌，其在发达国家中进行性的不断增长。
在空气中存在越来越多的污染化物，其使得人类基因库发生突变。这些突变常常是造成实体癌和恶性血液病的原因。
如上所述，急性恶性血液病的特征为淋巴系或骨髓系细胞不能分化，其使得随后在最不成熟的水平上发生了累积。
通常可以用可以消灭这些肿瘤细胞或可诱导其末期分化的药物来治疗这些病变(分化疗法)。
在European Journal of Cell Biology 67，379-85-1995年8月和European Journal of Cell Biology 77，214-19-1998年11月中描述了具有抗增生活性的PPARγ配体，当与类维生素A联用时，其对不同的骨髓白血病细胞系表现出强的前期分化协同作用。
事实上，通过与RXT类维生素A受体的异二聚体化，PPARγ决定了活化受体络合物的活性增加和两种受体的同时活化(Cell第93卷，241-52，1998年4月)。
视黄酸和PPARγ配体的联合治疗为这些特征是细胞分化不足的病变如急性恶性血液病的治疗提供了治疗上的优点。
Spirolaxine是一种已知的化合物；在Phytochemistry，(1990)第29卷，第2期，第613-616页中对作为真菌Sporotrichum laxum代谢产物的该物质进行了描述。在日本专利申请JP 08177033中对螺莱素的抗肿瘤活性进行了描述。在该申请中描述的实验模型涉及抑制肿瘤系增殖的体外试验。该试验表明通过对所试验肿瘤系的直接citotoxicity而显著抑制了增殖。
在WO 9605204中，将螺莱素描述为一种用于治疗由幽门螺旋杆菌而引起的胃十二指肠疾病的化合物。
在日本专利申请JP 94-82785中，将螺莱素描述为一种具有抗胆固醇血症活性的降低脂质的化合物。
在Phytochemistry，(1990)第29卷，第2期，第613-616页中描述了制备螺莱素的方法。
视黄酸也是一种已知的化合物。J.J.Kamm in J.Am.Acad.Dermatol.6，652(1982)公开了这种化合物的毒理学和致畸性。C.D.Robertson等人在J.Am.Chem.Soc.77，4111(1955)中对这种化合物的合成进行了描述。
从来没有过有关单独或与全反式视黄酸合用的螺莱素可用作治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的物质的描述。
由于其可刺激肿瘤细胞克隆物早幼粒细胞的分化(分化治疗)，所以视黄酸是一种用来治疗急性前髓细胞白血病(APL)的物质，特别是用来治疗恶性血液病的物质。
与其它类型的白血病相比，APL表现出较不显著的白细胞增多、贫血和血小板减少，当用常规化疗进行治疗时还表现出较低的缓解百分比和较高的死亡率。
APL的特征为异常易位，其涉及牵涉视黄酸受体α基因(Cin.Lab.Sci.2000 Spring；13(2)106-16)的染色体15和17的长臂[translocationt(15；17)]。
ATRA的口服给药使大多数患有APL的患者获得了完全缓解。但是，在一些情况中用ATRA进行的治疗可能会造成所谓的“视黄酸综合征”。这种综合征的特征为所治疗患者的白细胞计数迅速并进行性的增加，其可以用其它化疗来进行治疗。
此外，因为在用ATRA进行治疗期间，肿瘤细胞变得对这种化合物有抗药性，所以需要进行后期缓解治疗。
尽管近年来进行了一些努力，但是仍然需要一些可用于治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的单独或联用的新化合物。
已经发现式(I)的螺莱素是一种可用于制备治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的药物的物质。
本发明的一个目的是式(I)的螺莱素用来制备治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的药物的应用，其中所说的对该类受体的活化有响应的病变是2型抗胰岛素性糖尿病。
本发明的另一个目的是包含作为活性成分的式(I)的螺莱素和式(II)的全反式视黄酸的用于治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的药物组合物。
本发明的另一个目的是式(I)的螺莱素与式(II)的全反式视黄酸的联合。
本发明的另一个目的是一种包含作为活性成分的式(I)的螺莱素和式(II)的全反式视黄酸以及至少一种赋形剂和/或基质的药物组合物。
本发明的另一个目的是式(I)的螺莱素与式(II)的全反式视黄酸联合用于制备治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的药物的应用，其中所述的对PPARγ的活化有响应的病变是急性恶性血液病，包括淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、单核细胞白血病和巨核细胞白血病。
本发明的另一个目的是式(I)的螺莱素与式(II)的全反式视黄酸联合用于制备治疗急性前髓细胞白血病的应用。
此外，其中将多种抗肿瘤药同时或相继进行给药的治疗方案的应用在医学领域中是公知的。
在治疗方案中将多种抗肿瘤药进行给药的必要性可以根据事实证明，通过在不同代谢水平的作用，在一些情况中其有助于癌症的完全缓解，而在其它情况中其有助于使进行治疗的患者活的更久和/或改善其生活质量。本发明的联合可与一种或多种治疗急性恶性血液病的已知抗肿瘤药一起使用。
因此，本发明的另一个目的还是一种包含式(I)的螺莱素和式(II)的全反式视黄酸的联合以及一种或多种治疗急性恶性血液病理学的已知抗肿瘤药的药物组合物。上述已知的抗肿瘤药包括烷化剂；拓扑异构酶抑制剂；抗微管蛋白药；插入剂(intercalants)；抗代谢剂；天然产物如长春花属生物碱(Vinca alcaloids)、表鬼臼毒素、抗生素、酶和紫杉烷类(taxanes)。
报告下面的试验数据以更好的对本发明进行说明。
实施例1螺莱素(ST1397)对PPARγ的活化作用通过一些用受PPAR-γRE控制的表达PPAR-γ的质粒和编码荧光素酶的信息载体进行的细胞转染实验证明了螺莱素与PPARγ受体相连的能力和决定这些具有PPAR-γ(PPAR-γRE)响应序列的基因的活化作用的能力(Cell 68；879-887；1992；J.Biol.Chem.272；25252-25259；1997)。
通过用PPAR-γ质粒和TK-PPAR-Reluc信息载体对NIH-3T3鼠科动物成纤维细胞进行转染而证明了荧光素酶表达的活化作用；在用螺莱素以40nM的浓度进行处理24小时后对荧光素酶活性进行了测定。
将螺莱素的活性与一种用于治疗2型抗胰岛素性糖尿病的已知化合物——曲格列酮(TZD)的活性进行了比较，是在5μM的浓度下进行试验的。
在
图1中所阐明的结果表明螺莱素比上述抗糖尿病化合物更有效。实际上，由参考化合物所诱导并由TK-PPAR-Reluc信息载体所介导的荧光素酶活性(可作为受体活化作用的指数)比对照高5倍，而由本发明螺莱素所诱导的荧光素酶活性比对照高7倍。
实施例2本发明的联合对人前髓细胞白血病细胞系(NB4)分化的作用在这种实验模型中对螺莱素(ST1397)和ATRA单独使用和联用时的前期分化活性都进行了评估。
众所周知，全反式视黄酸在0.1至1μM的浓度之间变得有效；当生长显著停止时，一般在治疗的第三/第四天内观察到分化作用的峰值。
NB4细胞在25cm2烧瓶中在5ml带有10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养物以约100.000细胞/ml的密度进行生长。在一天之后，用ATRA以10-7M的浓度或用ST 1397以0、1、0、5和1μM的剂量对其进行处理，或用等体积的两种化合物的组合对其进行处理。然后，在不替换培养介质的情况下将该细胞放在培养器中培养2-3天。
在处理的第二天或第三天结束时，通过NBT染料还原和样品的分光光度发分析来测定细胞到粒细胞的分化。
用1mM的DMSO溶液将视黄酸溶解于该培养介质中。因为这种化合物(DMSO)在某些试验条件下也可能发生分化，所以用等体积的DMSO对对照培养物进行处理。
为了对分化作用进行测量，从各样品中收集500.000个细胞，离心并将其用1ml带有10％血清、1mg/ml氮蓝四唑(NBT)和100ngPMA的RPMI1640培养物重新混悬。将重新混悬的细胞在37℃下培养20-60分钟。在培养结束时，将细胞进行离心并将由此而获得的团状物重新混悬于1ml包含10％Triton X 100的PBS中。
对样品进行超声以使其完全溶解，然后用分光光度计在540nm的波长下进行读数。
图2所列结果表明当单独给药时，ST1397在NB4细胞中不能诱导分化。ATRA的分化作用已经是众所周知的，但是发现其这种作用被如上所述的单独给药时无效的ST1397的同时给药所加强。
权利要求
1.式(I)的螺莱素用于制备治疗对PPARγ受体的活化有响应的病变的药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中所说的对PPARγ受体的活化有响应的病变是2型抗糖尿病性糖尿病。
3.式(I)的螺莱素和式(II)的全反式视黄酸所组成的联合
4.一种药物组合物，其包含作为活性成分的式(I)的螺莱素和式(II)的全反式视黄酸以及至少一种赋形剂和/或基质。
5.如权利要求3所述的联合用于制备治疗这些对PPARγ受体的活化有响应的病变的药物的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其中所说的对PPARγ的活化有响应的病变是急性恶性血液病。
7.如权利要求6所述的应用，其中所说的急性恶性血液病是选自淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、单核细胞白血病或巨核细胞白血病。
8.如权利要求6所述的应用，其中所说的恶性血液病是急性前髓细胞白血病。
9.如权利要求3所述的联合与一种或多种已知的抗肿瘤药相结合的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中所说的抗肿瘤药选自烷化剂；拓扑异构酶抑制剂；抗微管蛋白药；插入剂；抗代谢剂；天然产物如长春花属生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、酶或紫杉烷。
全文摘要
本发明的特征为式(I)的螺莱素用于治疗这些对PPAR－γ受体的活化有响应的病变如2型抗胰岛素性糖尿病的应用。本发明还涉及一种用于治疗这些对PPAR－γ受体的活化有响应的病变如急性恶性血液病的药物组合物，其包含作为活性成分的式(I)的螺莱素和式(II)的全反式视黄酸。
文档编号A61K31/365GK1610545SQ02808138
公开日2005年4月27日 申请日期2002年3月1日 优先权日2001年3月16日
发明者C·皮萨诺, T·里乔尼 申请人:希格马托制药工业公司