治疗口腔及食道损伤的方法和组合物的制作方法

专利名称：治疗口腔及食道损伤的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供治疗上消化道(包括口腔与食道)损伤的方法和组合物。
背景技术：
口腔粘膜炎是指粘膜上皮组织被破坏，导致口腔红斑、溃疡与疼痛。粘膜炎通常是一种如癌症化疗与放疗的抗肿瘤治疗后的并发症。粘膜炎的疼痛性溃疡损伤限制病人经口腔进食食物和流体，进而导致体重减轻和脱水。严重的粘膜炎还会导致抗肿瘤治疗疗效降低或完全终止。化疗或放疗也可破坏胃肠道远处的粘膜上皮，包括食道、胃以及小肠和大肠的粘膜上皮，结果导致疼痛以及器官功能紊乱(如腹泻)。
粘膜炎损伤也可以是二次感染的部位，作为内源性微生物的入口；尤其对于免疫系统受损的病人。因此粘膜炎，对慢性使人虚弱无力的局部感染(如酵母(假丝酵母)感染)以及危及生命的系统感染(败血症)而言，是一种重要的危险因子。对于身患粘膜炎和嗜中性白血球减少症的患者而言，患败血症的风险程度比无粘膜炎患者至少高四倍。
嘴部溃疡性炎症(或口疮性口炎)是一种常见且疼痛的疾病；有近10％的人不时地遭受这些嘴部溃疡的折磨。口疮溃疡的起因还不完全清楚，尽管可能与压力以及口腔内部的很小的损伤有关。尽管对某些患者局部应用类固醇可以缓解，但目前没有令人满意的治疗方案。
发明概述本发明提供一种治疗哺乳动物上消化道损伤的方法，该方法是给哺乳动物施用治疗有效剂量的肠三叶肽(intestinal trefoil peptide)。优选的哺乳动物是人。在优选方案中，肠三叶肽是解痉多肽(SP)，pS2或肠三叶因子(ITF)。更优选地，肠三叶肽是ITF。
应用本发明方法，能够治疗上消化道损伤，如粘膜炎、口疮性口炎与牙龈炎。另外，由于抗肿瘤治疗(化疗或放疗)、贝切特氏病、组织活检、手术、肿瘤切除、热或化学烧伤、拔牙以及任何原因所致的外伤等所致的上消化道损伤，或由于微生物(如细菌、病毒或真菌)感染所致的损伤，都可以治疗。
在优选方案中，可以给患者施用第二治疗药物。优选的第二治疗药物包括抗炎性药物、抗细菌药物(如青霉素、头孢菌素、四环素或氨基糖苷类)、抗真菌药物(如制霉菌素或两性霉素B)、抗病毒药物(无环鸟苷)、局部消毒药物(如聚乙烯吡咯烷酮碘)、止痛剂(如利多卡因或苯坐卡因)或类固醇(如去炎松或氢化可的松)。优选地，第二治疗药物可以在3天、1天、12小时、1小时内施用，或与肠三叶肽同时施用。第二治疗药物可与肠三叶肽在同一药物组合物中存在。
本发明还提供了适于将肠三叶肽送达上消化道的药物组合物。优选地，药物组合物为口腔喷雾剂、口腔清洗剂(漱口液)、药膏、粘贴剂、乳剂、凝胶、咀嚼胶、可嚼片剂、锭剂以及生物降解性薄膜。在一个实施方案中，药物组合物用生物降解性微球包裹一种或多种治疗药物。在优选的口腔喷雾剂、口腔清洗剂、药膏、粘贴剂、凝胶以及生物降解性膜方案中，有粘膜附着剂或粘性增强剂。
在其他优选实施方案中，药物组合物的肠三叶肽是指SP，pS2或ITF。在更优选的方案中，肠三叶肽是ITF。在其他优选实施方案中，药物组合物进一步包含第二治疗药物。优选的第二治疗药物包括抗炎性药物、抗细菌药物(如青霉素、头孢菌素、四环素或氨基糖苷类)、抗真菌药物(如制霉菌素或两性霉素B)、抗病毒药物(无环鸟苷)、局部消毒药物(如聚乙烯吡咯烷酮碘)、止痛剂(如利多卡因或苯坐卡因)或类固醇(如去炎松或氢化可的松)。
所用“肠三叶肽”是指人解痉多肽(SP；又称TFF2)，人pS2(又称TFF1)或人肠三叶因子(ITF；又称TFF3)的所有哺乳动物类似物，以及这些产物的生物活性片段。优选地，三叶肽的类似物与人序列有70％的氨基酸一致性，更优选有85％的一致性，最优选有95％甚至99％的序列一致性。比较序列(comparison sequences)的长度一般至少约10个氨基酸残基，通常至少是20个氨基酸残基，较常见至少30个氨基酸残基，典型的至少是45个氨基酸残基，优选超过60个氨基酸残基。
术语“片段”包括SP、pS2或ITF的经截短或缺失的多肽。优选地，片段与人多肽序列相应区域有70％的氨基酸一致性。更优选地，片段与相应人多肽序列有85％一致性，最优选有95％甚至99％的一致性。比较序列的长度一般至少约10个氨基酸残基，通常至少是20个氨基酸残基，较常见的至少是30个氨基酸残基，典型的至少是45个氨基酸残基，优选超过60个氨基酸残基。
优选片段在对应于人ITF的25、35、45、50、51、62或71位半胱氨酸(

图1)或者对应于人pS2的31、41、51、56、57、68和82位半胱氨酸(图2)的任意位置包含4个半胱氨酸。更优选地，片段包含这些位置上的5个半胱氨酸残基。最优选的片段有6个或甚至全部7个半胱氨酸。
SP片段包括相应的人SP多肽序列经剪切或缺失的多肽，而且优选与相应的人SP多肽序列有70％的序列一致性(图3)。更优选地，片段与人多肽序列有85％的一致性，最优选的有95％甚至99％的一致性。优选地，活性片段在对应于人SP多肽的第6、8、19、29、34、35、46、58、68、78、83、84、95和104位上至少包含4个半胱氨酸。更优选地，片段包含对应于这些位置的6个半胱氨酸。进一步优选地，片段有8个半胱氨酸。最优选地，片段有10个、12个或甚至全部14个半胱氨酸。
在本领域内，已知特定的(identified)半胱氨酸残基的一个功能是参与了蛋白的特征性的3个环状(三叶)结构。因而优选的ITF和pS2片段至少有1个环状结构，进一步优选的片段有2个环状结构，最优选的片段有3个环状结构。同样，已知天然的SP多肽具有6个环。优选的片段至少有这些环状结构中的2个，进一步优选的片段保留4个环状结构，最优选的片段有5个甚至全部6个环状结构。
“共同配制(co-formulated)”是指任意一种药物组合物，它包含两种或两种以上的治疗剂或生物活性制剂。
“药物制剂”或“药物组合物”是指任意的组合物，它包含至少一种治疗或生物活性的药剂，而且适于给患者施用。根据本发明目的，适用于上消化道的药物组合物包括，但并不限于溶液和悬液，它们以喷雾剂、清洗剂、粘贴剂、凝胶、可嚼片剂、舌下、齿龈或颊内使用的干胶片(wafer)和薄膜、咀嚼胶、锭剂送达目的部位，以及其它能在口腔停留一定时间的药物组合物。这些制剂中的任何一种都可以通过本领域已知的和可接受的方法制备。见，例如，RemingtionThe scienceand practice of Pharmacy，19thedition，(ed.AR Gennaro)，MackPublishing co.，Easton，PA，1995.
“微球”是指一种生物降解性的聚合药物传送装置，其直径为5-100微米，中空，适于封装治疗剂。通常，治疗剂在微球生产过程中封装进去。
“治疗有效量”是指足以提供疗效的量。当按照本文所述方法给病人施用三叶肽时，治疗有效量通常是每天约0.1-1000mg的肠三叶肽。优选地，患者每天接受10mg、100mg、250mg或750mg的肠三叶肽。每天的总剂量可以分成多份单个剂量。
“上消化道”是指最接近胃部贲门括约肌(胃食道贲门括约肌)的消化系统部分。具体地说，上消化道是指包括口腔及其相关的结构(如舌、牙龈和舌下组织，以及硬颚和软颚)以及食道。
当涉及肠三叶肽、片段或类似物时，“生物学活性”是指该多肽具有一种与其相关的、天然家族成员一致的活性，该活性与天然的肠三叶肽家族的活性一致。与三叶肽家族的活性一致的生物学活性的一个实例，是改变哺乳动物胃肠道运动性的能力。
“分离的DNA”是指脱离了基因的DNA，所述基因在DNA所来源的生物体的天然基因组中，位于DNA的两侧(flank the DNA)。因此，“分离的DNA”一词包括如cDNA、克隆的基因组DNA和合成DNA。
“治疗”是指用以预防和/或治疗为目的施用药物组合物。药物组合物的活性成分能够治疗最初的症候(如上皮损伤)或继发的综合症(如并发的感染、疼痛或炎症)。
“止痛剂”是指一种能够提高疼痛阀值以缓解疼痛的药物制剂，它没有明显地影响患者的意识。
“抗微生物药剂”是一种化合物，它能够改变细菌或真菌细胞或病毒生长，从而防止、稳定或抑制其生长，或杀死微生物。换句话说，抗微生物药剂可以是杀微生物或抑制微生物(microbiostatic)的制剂。
“热烧伤”是指由于暴露于过高的温度而致的损伤或至少是上皮细胞层的破坏。上消化道的热烧伤通常是由于摄入过热的食物或流体，或吸入超高热的空气所致。热烧伤包括，但并不限于，一度、二度和三度烧伤。
“化学烧伤”是指由于暴露于有害的化学品而致的损伤或至少是上皮细胞层的破坏。通常，上消化道的化学烧伤是由于吸入或摄入化学品所致。
“抗肿瘤治疗”是指任何用于癌症治疗的方法。通常抗肿瘤治疗包括化疗和放疗。
附图简述图1人肠三叶因子的氨基酸序列(ITF；登记号BAA95531；SEQ IDNO1)图2人pS2蛋白的氨基酸序列(登记号NP_003216；SEQ ID NO2)图3人解痉多肽的氨基酸序列(SP；登记号1909187A；SEQ ID NO3)图4编码人肠三叶因子的cDNA序列(SEQ ID NO4)图5编码人pS2蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO5)图6编码人解痉多肽的cDNA序列(SEQ ID NO6)图7编码人肠三叶因子基因的核酸序列(locus 1028053352117-55412；SEQ ID NO7)图8编码人pS2蛋白基因的核酸序列(locus 1028053316511-21132；SEQ ID NO8)图9编码人解痉多肽基因的核酸序列(locus 10280533957-5208；SEQ ID NO9)发明详述本发明提供治疗上消化道的范围很广的损伤(a wide range oflesions)的方法和组合物。本发明的肠三叶肽对于治疗口腔、食道粘膜、舌以及牙龈组织损伤特别有效。
哺乳动物的三叶肽发现于1982年。哺乳动物的三叶肽之一，人肠三叶因子(ITF；ITF3)已经被深入的鉴定，在美国专利6,063,755和6,221,840中有描述，在此引入作为参考。另外两个已知的人肠三叶肽是解痉多肽(SP；TFF2)和pS2(TFF1)。在文献中(如Sands等，Ann.Rev.Phusiol.58253-273(1 996)，在此引入作为参考)的描述中，三叶肽在胃肠道表达，具有由保守的半胱氨酸之间的链内二硫键构成的一个三个环的结构。这些肽保护肠道免受损伤，而且可用于治疗肠道紊乱，如消化器官炎症和炎性肠道疾病。在许多非人的动物种类中，发现了这些人肽的类似物。该蛋白家族的所有成员，包括人和非人的，在此称为三叶肽。在本发明中，人的三叶肽将被更广泛的提及。而且，人ITF的活性与哺乳动物的肠三叶肽的活性相同。
我们发现局部应用肠三叶肽能够治疗上消化道上皮损伤，该损伤包括口腔与食道粘膜，舌以及牙龈组织损伤。因而按照本发明方法，三叶肽治疗剂能够生产成任何的药物组分，这些组分传送治疗药物达上消化道。
药物制剂口腔喷雾，清洗剂以及乳状液喷雾系统专用于送治疗剂到达上消化道。适合的喷雾系统包括增压和非增压(泵压)传递装置。含肠三叶肽的溶液制成口腔喷雾剂，优选水溶液；还可以使用有机和无机组分，乳化剂，赋型剂以及能够增强器官特性的试剂(如调味剂或有气味的东西)。可选地，溶液中可以包含防止微生物生长的保护剂(如羟苯甲酸甲酯)。尽管水本身就能够构成全部的载体，但典型的流体喷雾制剂包括辅溶剂，如丙二醇、玉米糖浆、丙三醇以及三梨醇溶液等，以助溶和掺入水不溶性的成分。因此总的来讲，本发明的制剂优选辅溶剂含量，按体积比从约1-95％，按体积比最优选的约5-50％。当制备为喷雾剂时，患者自己每天使用1-5次。喷雾传递系统通常设计为每次开动传送50-100微升，每次治疗剂量需要开动1-5次。该喷雾剂制剂的流变学特性优化后，能够剪切、雾化形成小滴。另外，设计的喷雾装置能够产生的小滴大小，利于在上消化道粘膜长久停留且减低在呼吸道的暴露。
适于口腔喷雾的药物也可以配制成口腔洗液或漱口剂。用这些制剂的三叶肽治疗，通常时是用本制剂清洗口腔，漱口或淋洗口腔。另外，这些制剂能够吞咽，提供治疗食道、胃和/或小肠的三叶肽。这种用药方法尤其适用于治疗患小肠上皮受损的患者。比如，接受抗肿瘤化疗的患者，又有口腔粘膜炎，常常发展为胃肠道更远端的损伤，如胃和小肠上皮的损伤。已知肠三叶肽，尤其是ITF，在胃内pH条件下稳定。因此，吞咽最初设计治疗口腔粘膜炎的肠三叶肽溶液，可以改善食道较下部(如胃和小肠)的损伤。
在另一个可选制剂中，肠三叶肽和/或其它的治疗剂可以装入生物降解性微球的胶囊中，而不是溶解在制剂的水相中。已经开发了大量的各种微胶囊用药系统，其中许多系统与生物降解性膜的聚合成分(见下面)相似。微球制剂中常用的聚合成分，包括如多聚ε己内酯，多聚(ε己内酯-Co-DL-乳酸)，多聚(DL-乳酸)，多聚(DL-乳酸-Co-羟基乙酸)和多聚(ε己内酯-Co-羟基乙酸)(例见，Pitt等，J.Pharm.Sci.，681534，1979)。
微球能够用本领域内已知的生产方法生产，包括喷雾干粉、凝聚和乳化剂，(例见Davis等，微球和药物治疗，Elsevier，1984；Benoit等，可生物降解微球生产技术进展，第三章，Ed.Benita，S，Dekker，NewYork，1996；微封装和相关的药物方法，Ed.Deasy，Dekker，1984，NewYork；美国专利6365187)。优选的微球时生物粘附性的或制剂中包含生物粘附性赋形剂。
含肠三叶肽溶液的其它技术特征可以轻而易举地修饰，以适于特定的医学制剂以及临床的治疗应用。比如，调节制剂的pH值与渗透率，可以提高三叶肽的稳定性，同时降低口服刺激和敏感性。
药膏、粘贴剂、凝胶由于外伤所致的口腔和食道上皮损伤，可以用药膏、粘贴剂、胶等的给药途径，使用三叶肽治疗。这类制剂的粘附性允许在伤口部位直接使用。可选的方法是，将含三叶肽组分的敷料覆盖伤口，保护损伤部位免受外伤和/或吸收渗出物。如下面将进一步讨论的，这些制剂尤其适用于外伤性手术后，恢复上皮组织的完整性，手术如拔牙、组织活检或肿瘤切除。这些粘性制剂还有一种局部配置效应，减轻刺激和疼痛。
粘膜附着剂粘膜附着性赋形剂可以加入前面所述的药物制剂中的任何一种。这些粘膜附着性制剂覆盖上消化道，以保护、抑制刺激以及加速发炎或损伤组织的痊愈。粘膜附着性制剂也可以延长肠三叶肽与粘膜上皮的接触时间。用于制备口服粘膜附着性制剂，是本领域内众所周知的(如，美国专利5458879)。尤其有用的粘膜附着剂是水凝胶，由约0.05-20％的水溶性聚合物如聚(环氧乙烷)，聚(乙二醇乙醚)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷)，聚(丙烯酸)，聚(羟乙基丙烯酸)，羟乙基乙基纤维素，羟乙基纤维素，壳聚糖以及这些聚合物的混合物。这些聚合物制剂也可以包含分散剂，如羧甲基纤维素钠(0.5-5.0％)。
用于流体制剂的其它优选的粘膜附着性赋形剂，是一类能够以流体形式用药，但到达上消化道部位时又使药物形成胶，因而具有生物粘附性效应，在损伤部位使治疗药物持续停留一段时间而发挥效应。阴离子性的多糖胶质和胶凝剂就是实物，这些物质配伍进合适的制剂中，由于粘膜和唾液中阳离子的存在，将在上消化道形成胶质。这类含胶质和胶凝剂的液体制剂，在水或液相缓冲液系统中，典型地含0.01-20％胶质或胶凝剂。
其它能够增强粘膜粘附性并延长治疗剂在上消化道停留的有用组分，是一些胶状的散布剂，该物质含2-50％的胶状颗粒，如硅胶或二氧化钛。这样的制剂形成低粘性的流体，适于漱口或产生细小的雾珠。而且，颗粒与糖蛋白相互作用，尤其是与粘液素，液体变成了粘性胶，从而有效的粘附粘膜(如美国专利5993846和6319513)生物降解性的薄膜输送装置最简单的生物降解性装置包含治疗剂，且治疗剂掺入固相(通常含脂类)膜或药片中。该装置被配制成在室温时为固态，但体温时就融化，释放掺入的治疗剂。这类合适的制剂中包含，例如，可可油。
聚合物膜装置具有将治疗剂送达口腔的几个优点。它不像冲洗剂、粘贴剂、凝胶和其它可流动组合物，薄膜装置能够在口腔中停留较长的时间(如从数小时到数天)，从而使治疗剂持续地从所附着之处彻底释放。通常，薄膜是部分或完全生物降解性的，而且所含的粘膜粘附层将薄膜固定到口腔粘膜上。薄膜装置，除用于传送治疗剂之外，还能够保护损伤部位免受机械伤害或微生物感染。这种物理屏障功能在治疗如粘膜炎或口疮性口炎时尤其有优势。另外，正如下面将详细讨论的，薄膜装置可用于将三叶肽治疗剂直接释放到覆盖的粘膜，口腔内腔中或这两者中。
薄膜装置至少由两层组成；粘膜附着层适于将薄膜附在口腔粘膜上，填料层(bulk layer)包含活性治疗剂。许多合适的粘膜附着性物质都是本领域内已知的，在上面已讨论过。可选地，一种或多种治疗剂也可以通过粘附层提供。
这种组合传送装置的填料层，可由一种或多种生物降解性聚合物材料制成。合适的聚合物材料包括，如淀粉、明胶、聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚丁二醇、聚氨基甲酸酯、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸盐、胶原质、聚交酯、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)、calcium polycarbophil、聚甲基丙烯酸乙酯、纤维素乙酸酯、丙二醇、聚丙烯酸、交联聚丙烯酸、羟乙基甲基丙烯酸盐/甲基甲基丙烯酸共聚物、硅/乙基纤维素/聚乙二醇、尿烷聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚酐类，多聚氨基酸、部分和全部水解的亚烃基-乙烯基醋酸盐共聚物、聚氯乙烯、多乙酸乙烯酯聚合物、聚乙烯烷基醚、苯乙烯丙烯腈共聚物、聚(对苯二酸-乙二醇)、聚烷撑、聚(乙烯咪唑)、聚酯以及这些聚合物中两种或多种的组合。
一种特别有用的填料层聚合物是由PLGA和乙基纤维素组成的。PLGA是生物降解性的，能够在广泛的条件下和高效率的降解。乙基纤维素是一种不溶于水的聚合物，在薄膜形成时作为PLGA的可塑剂，将在体液中被降解。由于其本身不溶于水的性质，乙基纤维素还有一定程度和比例的膨胀薄膜的效应。
可选的第三层也可以加入胶片中，该层是三叶肽不能渗透的。优选该层仍为生物降解性的，适用于该屏障层的聚合物材料包括乙基纤维素、聚(丙烯酸)或其它多聚电解质。一种配置方案是，该保护层相对于粘附层来说，位于填料层的反面，因而能够使治疗剂直接释放到紧密接触的上皮，而不被腔内液体所稀释。这种配置方法对治疗舌部、牙龈组织或口腔粘膜的非连续损伤(如粘膜炎或口疮性口炎)非常有效。另一种薄膜制剂的配置方案是，该保护层位于填料和粘附层之间。这种配置可以直接将治疗剂释放至口腔液体中，治疗舌部、口腔和食道的较弥散性损伤时非常有用。如果药物浓度高时具有毒性，也适于用这种配置传送，因为它能够保护其覆盖的组织免与含治疗剂的薄膜直接接触。
可嚼片剂，锭剂与糖食(confectionary)与传统的药物传递载体相比，将含三叶肽的药物组分制成可嚼片剂，锭剂或糖食，如口香糖，具有几个优点。首先，延长了在靶位点(口腔与食道)的接触时间以及持续释放时间。第二，通常患者愿意接受这种制剂治疗，尤其是用三叶肽治疗儿童患者。
可嚼片剂的制剂是众所周知的，通常含糖、淀粉或脂类及调味剂。下面提供一个示例性的可嚼片剂制剂。
ITF可嚼片剂制剂(每片)肠三叶因子300mg甘露醇675mg微晶纤维素75mg玉米淀粉30mg硬脂酸钙(calcium sterate)22mg调味剂(如糖精钠或薄荷油)治疗剂掺入口香糖和其它糖食性制剂方法是本领域内人所公知的(如美国专利5858391)。
治疗剂三叶肽在优选方案中，三叶肽是人的三叶肽；更优选的是人肠三叶因子(ITF)、解痉多肽(SP)或pS2。最优选的方案是三叶肽为人ITF。
本发明组合物中所用三叶肽浓度介于0.1-1000mg/ml之间，根据治疗性质及情况，期望频率与疗程，以及用于传递三叶肽的药物组合物类型。通常，治疗方案设计为每天给患者用0.1-500mg的三叶肽。
抗炎性药物任何适于抗炎性药物都能配制在本发明的药物组合物中，所用浓度是该药物已知的浓度。许多最有效的抗炎性药物还具有止痛和退热作用。适于与三叶肽配伍的抗炎性药物包括，如对乙酰氨基酚，阿斯匹林(乙酰水杨酸)，布洛芬，苯布他酮，茚甲新，舒林酸，二氯芬酸以及萘普生。
抗微生物药物许多已知的抗微生物药物都能用在本发明的组合物中，这些药物浓度是其常用的浓度。抗微生物药物包括抗细菌药物，抗真菌药物，抗病毒药物以及其它局部消毒剂。
抗细菌药物(抗生素)实例包括青霉素类(如青霉素G，氨苄，甲氧苯青霉素，苯唑西林和羟氨苄青霉素)，头孢菌素类(如头孢羟氨苄，头孢雷特，头孢氨噻和头孢曲松)，四环素类(如强力霉素，二甲胺四环素，四环素)，氨基糖苷类(如氨基羟丁基卡那霉素A，庆大霉素，卡那霉素，新霉素，链霉素和托普霉素)，大环内酯物(如阿齐霉素，克拉霉素，和红霉素)，氟喹诺酮类(如环丙沙星，洛美沙星和诺氟沙星)以及其它的抗生素，包括氯霉素，氯洁霉素，环丝氨酸，异烟肼，利福平和万古霉素。
抗病毒药物是一类能够破坏或抑制病毒复制的物质。抗病毒药物实例包括1，-D-呋喃核糖-1，2，4-三唑-3氨甲酰胺，9-＞2羟基-乙氧基甲基胍，金刚烷胺，5-碘-2’-脱氧尿苷，三氟胸苷，干扰素，腺嘌呤阿拉伯糖苷，蛋白酶抑制剂，胸苷激酶抑制剂，糖或糖蛋白合成抑制剂，结构蛋白合成抑制剂，连接与吸收抑制剂，核苷类似物如无环鸟苷，喷昔洛韦、伐昔洛韦以及更昔洛韦。
抗真菌药物包括杀真菌和抑制真菌药物两种，如两性霉素B，羟苯丁酯，氯洁霉素，氯苯甲氧咪唑，氟康唑，5-氟胞嘧啶，灰黄霉素、制霉菌素和酮康唑。
局部消毒剂包括的药物如，聚乙烯吡咯烷酮碘，和杀藻胺。
止痛剂和麻醉剂任何常用的局部止痛药都可用于本发明的制剂，其量能够提供给口腔损伤的局部浓度介于半量与5％的利多卡因浓度(20-40ml的液体中含5-50mg/ml)。其它可用的麻醉剂实例包括普鲁卡因，利多卡因，丁卡因、狄布卡因，苯坐卡因，p-丁基-氨基苯酸-2-(二乙基氨基)乙基盐酸酯，马比佛卡因，皮珀罗卡因与达克罗宁。
其它的止痛剂包括鸦片类，如吗啡、可待因、二氢可待因酮和羟可待酮。这些止痛剂也可以与具有止痛和抗炎性特性的其它化合物如对乙酰氨基酚，阿斯匹林和布洛芬，配伍使用。
类固醇类药物类固醇类药物常用于治疗上消化道的损伤。如，口疮性口炎常规用粘贴剂治疗，其中含去炎松(0.1％)，氢化可的松，氟替卡松和倍氯米松。
用三叶肽治疗上消化道的病症粘膜炎粘膜炎是一种常见的口腔疾病，其特征是粘膜炎症。该病症常常由放、化疗等的抗肿瘤治疗引起。粘膜炎的病症包括溃疡，红肿，肿胀，且与上皮细胞损伤和死亡有关。患严重粘膜炎的患者，由于粘膜疼痛限制了进食而易导致脱水和营养不良。严重时，粘膜炎可使患者衰弱，可能需要延长住院时间，注射营养以及镇痛治疗。另外，粘膜上皮的破坏增加患者的局部或系统感染的可能性。屏障功能的打破，使得内脏腔内正常停留的微生物及其产物可以进入体内。因而，能够降低与化疗相关的副作用的药物制剂，将能够提高患者的生活质量，提高其自我服药的意愿，而且可以接受更高剂量的化疗。通常，用含三叶肽的漱口液或口腔喷雾治疗粘膜炎，方法是患者每天自己使用1-5次。这种水溶液优选包含粘膜附着剂和抗炎性药物。其它治疗，如局部止痛(如去炎松)也可以用。可选地，数量少而且空间好定位的损伤部位，用含肠三叶肽的薄膜直接覆盖在损伤部位进行治疗。
拔牙用本发明含三叶肽的药物组合物，可以减轻由于拔牙造成的伤口所致的并发症并能加速愈合。如上所述的口腔清洗剂，粘贴剂，药膏或胶，可以在手术后直接在拔牙部位立即使用，然后每天用1-4次，如需要，直至上皮完全重新长好。优选制剂中含一种局部止痛剂以减轻由于拔牙外伤所致的暂时不适。作为一种预防性方案，制剂中也可以包含抗生素。
牙龈炎牙龈炎是一种极常见的慢性疾病，需要持续治疗，某些情况需要治疗长达数月甚至数年。含本发明三叶肽的药物组合物，可以单独或与其它的疗法配合治疗牙龈炎，尤其是与抗微生物药物，最常见的是与抗细菌药物协同治疗。至少每2-3天，患者用含肠三叶肽的口腔清洗剂漱口一次，最频繁时可一天3次，使用3-4周；如需要，可重复治疗。可选的方法是将三叶肽配伍进胶或牙膏中。严重时，将含高浓度肠三叶肽的粘性胶或药膏，用涂药器涂至纱布等填絮后直接用于伤口。
含肠三叶肽的药物组合物也可以用生物降解性药物传递系统来用药，该系统能够形成膜用于下面的牙龈(美国专利5945115和5990194中详述)。生物降解性的多聚体与肠三叶肽混合后，用注射器，以一种非流动的液体方式，提供至牙床。然后，这种多聚体溶液在原位形成一种固态的生物降解性植入物。
口疮性口炎从口疮性口炎暴发时的第一个朕兆(通常开始时感到一阵一阵痛)开始，患者用含肠三叶肽的清洗液漱洗口腔，一日1-4次至溃疡痊愈(通常需要5-10天)。含肠三叶肽的胶也可以用于溃疡的治疗，同样含类固醇的胶也可很常用。另外，胶中可含肠三叶肽和已知对口疮性口炎治疗有效的类固醇。一种直接使用高浓度物质的方法是，用涂药器将药物的涂于纱布等填料上，直接在伤口上使用。可选的另一种方案是，直接用含三叶肽和类固醇(如去炎松)的薄膜覆盖损伤部位，来治疗损伤。任何对治疗口疮性口炎有效的制剂中还可选地含一种局部麻醉剂(如，利多卡因或苯唑卡因)。
贝切特氏病贝切特氏病是一种罕见的多系统风湿性疾病，特点是系统性血管炎。贝切特氏病的常见症状之一是周期性发生与口疮性口炎类似的口腔溃疡。目前，对贝切特氏病的治疗只是缓解而不是治愈。因此，肠三叶肽可以与目前使用的贝切特氏病的治疗剂联用，来治疗上消化道部位的损伤，其中治疗贝切特氏病的药物包括，如干扰素阿尔发2A和2B，左旋咪唑，环孢霉素，环磷酰胺和秋水仙碱。
口腔活检与口腔手术万一怀疑口腔中瘤的性质或已知为恶性的，这时需要用针或解剖刀进行活检或手术切除，结果会导致一个开放性伤口。手术区域易感染和发炎，用含三叶肽的溶液每天清洗1-4次治疗。优选制剂中含一种止痛剂，一种抗炎性药物和一种抗生素。可选方法是将浓度更高的胶，粘贴剂或药膏直接用于损伤部位。对于恶性肿瘤手术切除后的治疗，可在含三叶肽的制剂中使用局部活性化疗剂。
烫伤与化学烧伤上消化道的外伤常常是由于暴露于过热的物体或有毒的化学物质所致。由于进食过热的食物或饮料所致的上消化道烫伤通常是中度的(如一度或二度烧伤)。更严重的口腔粘膜与上食道烫伤可由于吸入超热的空气所致，或在救火或者房屋或森林火灾的受害者中常见。
化学烧伤也会损害上消化道的粘膜。中度的粘膜刺激与烧伤常常是由于进食了酸性食物(如水果)。更严重的化学烧伤通常与工业事故或职业暴露相关。
此处所述的含三叶肽的药物制剂对于治疗上消化道的烫伤和化学烧伤有效。优选方法是使用粘性流体或含粘膜附着性材料的胶制剂，延长粘膜与三叶肽的接触时间。可选的方法是，持续释放制剂，如使用生物降解性的薄膜。局部止痛剂和抗微生物药物是可以配伍使用的最优选的第二治疗药物。
肠三叶肽的生产肠三叶肽能够用本领域内任何已知的表达重组蛋白方法生产。编码三叶肽(如人肠三叶因子(图4和7)，人pS2(图5和8)以及人解痉多肽(图6和9)或者由此产生的片段)的核酸都可以引入不同的细胞系和无细胞系统进行表达，并进而大规模的生产，纯化以及治疗患者。
将肠三叶肽基因序列插入质粒或其它载体，然后用它去转化活细胞，获得三叶肽的真核或原核表达系统。构建用于蛋白表达的载体，是将含完整读码框架的肠三叶肽cDNA以正确的方向插入表达质粒而获得的。原核和真核表达系统能够表达并回收肠三叶肽融合蛋白，该蛋白中三叶肽共价连接至一个利于鉴定和/或纯化的标签分子上。可以在三叶肽和标签分子之间，用基因工程的方法加入酶切或化学切割位点，这样在纯化后可以切除标签分子。
典型的表达载体包含启动子，在含质粒的细胞中，它能够指导质粒中插入的肠三叶肽核酸合成大量的mRNA。表达载体也可以包含真核和原核来源的能够使他们在宿主内自主复制的复制序列，编码能够在毒性药物存在时筛选出含载体细胞的标记基因序列，以及能够增强合成的mRNA翻译效率的序列。长期稳定的载体由于自由复制体的存在而维持，该自由复制体可由调控元件如病毒(如源于EB病毒基因组的0riP序列)控制。通过将载体整合入基因组DNA，也可以获得表达细胞系，在这种情况下，基因产物的生产是持续性的主要成分。
在细菌，如大肠杆菌中表达外源基因序列，需要将肠三叶肽核酸序列插入到细菌表达载体中。这样的载体包括几种元件，这些元件在细菌中扩增质粒、表达插入的DNA过程中是必要的。通过在质粒中引入选择性的标记序列，能够使含质粒的细菌在其它毒性药物存在时生长而扩增仅含质粒的细菌。质粒还包含一个转录启动子，能够从克隆的基因获得大量的mRNA。这样的启动子可以是(但不必是)可诱导型的，即诱导时启动转录。质粒中还优选地包含一个多接头，以简化基因以正确的方向插入载体。哺乳动物细胞也可用于表达三叶肽。用肠三叶肽表达载体，可以获得稳定或暂时性的表达细胞株，来生产可溶性(剪切或带标签)的三叶肽。合适的细胞系包括如COS、HEK293T、CHO或NIH细胞系。
构建好适当的表达载体后，通过转化技术如磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷转染、电穿孔，显微注射、原生质体融合或脂质体介导的转染，但并不限于这些技术，将其引入适当的宿主细胞中。用本发明的载体转染的宿主细胞包括(但并不限于)大肠杆菌或其它细菌、酵母、真菌、昆虫细胞(例如，使用杆病毒载体在SF9昆虫细胞中表达)，或源于鼠、人或其它动物的细胞。也可以用体外表达系统，表达由克隆的DNA编码的三叶肽、融合蛋白或多肽片段。分子生物学领域内的技术人员会理解，大量的表达系统和纯化系统可以用于重组三叶肽及其片段的生产。这些系统中的部分系统在Ausubel等(CurrentProtocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，New York，NY2000，本文引入作为参考)中有论述。
转基因植物、植物细胞和海藻，对于生产本发明中组合物和方法中的重组肠三叶肽的生产也特别有用。比如用本领域内已知的方法，可以获得表达肠三叶肽的转基因烟草植物或培养的转基因烟草植物细胞(见例美国专利5202422和6140075)。转基因海藻表达系统也可用于生产重组的肠三叶肽(见例如Chen等，Curr Genet.39365-370，2001)。
重组蛋白表达后，用蛋白纯化技术如亲和柱层析，可以将它从细胞裂解液中分离。一旦纯化后，如果愿意，重组蛋白可以进一步的纯化，如用高压液相层析(HPLC；见Fisher，Laboratory Techniques InB iochemistry And Molecular Biology，Work and Burdon，Eds.Elsevier，1980)。
本发明的多肽，尤其是短的肠三叶肽片段可以用化学合成的方法生产，比如用Merrifield固相合成方法，液相合成方法，或者结合二者(见例如“固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)”，第二版，1984年，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)。可选地，多肽片段可以用标准的肽化学方法缩合。
实施例1接受抗肿瘤治疗患者的粘膜炎的治疗在抗肿瘤治疗(如化疗或放疗)之前，开始先用三叶肽治疗，作为一种预防措施以延缓或阻断粘膜炎症。优选方案是用第一剂量的抗肿瘤治疗前三天，患者开始用肠三叶肽治疗。在预防阶段，患者用含肠三叶肽的溶液漱洗口腔。另外为方便起见，提供使用浓缩的口腔喷雾剂。优选患者吞咽溶液，以保护食道上皮细胞和胃肠道较下部位的上皮细胞。在检测口腔或食道粘膜炎之前，持续使用含三叶肽的溶液清洗和吞咽，每天至少2次。
对于已患粘膜炎的患者，用如上所述的肠三叶肽治疗可以促进上皮愈合。用苯坐卡因(一种局部麻醉剂)和制真菌素(一种抗真菌药物)可以进行缓解治疗。肠三叶肽可以与苯坐卡因和制真菌素配伍使用。比如，患者用口腔清洗液清洗口腔(漱口)，该清洗液含全部的治疗药物，每天1-5次。另外可选的方法是提供使用浓缩的口腔喷雾，在使用时可加用苯坐卡因和制真菌素，也可以不加。
口腔清洗液可以吞咽入腹，也可以吐掉。如果吞咽，制剂中也可含抗酸剂。其它能够缓解治疗的、有用的治疗剂，包括抗炎性药物(如布洛芬)和其它的抗微生物药物。下面提供用于治疗化疗所致的粘膜炎的口腔清洗液制剂实例，但并不限于此。一个熟练的医生或药剂师，可立即发现能用于这些制剂的合适的替代物，添加物以及删减物。
清洗液1等量混合苯海拉明(Benadryl)酏剂瓷土-胶质混悬液(Kaopectate)粘性盐酸利多卡因(2％)制真菌素(口服悬液；100000iu/ml)ITF(2.5mg/ml)优选清洗后吞咽清洗液2等量混合苯海拉明(Benadryl)氢氧化铝、氢氧化镁混合物(Maalox)(MgOH&AlOH；40mg/ml)粘性盐酸利多卡因(2％)ITF(2.5mg/ml)优选清洗后吞咽其它方案说明书引用的所有发表的论文以及专利申请，在此作为文献引入，如同每一篇文献或专利都特别标明作为文献引入。尽管前述的发明已经通过阐明和举例的方法详尽的描述，对于本领域内的技术人员来说，根据本发明所授，在不背离权利要求的主旨或保护范围的条件下，可以对其进行某些改变和修饰。
序列表<110>综合医院公司<120>治疗口腔及食道损伤的方法和组合物<130>50206/002CN2<150>PCT/US02/12891<151>2002-04-24<150>US 60/286,240<151>2001-04-24<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>73<212>PRT<213>人<400>1Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu1 5 10 15Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg20 25 30Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg35 40 45Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys50 55 60Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe65 70<210>2<211>84<212>PRT<213>人<400>2
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1.一种治疗哺乳动物上消化道损伤的方法，该方法包括给所说患者施用治疗有效量的肠三叶肽。
2.权利要求1中的方法，其中所述肠三叶肽为解痉多肽、pS2和肠三叶因子。
3.权利要求2中的方法，其中所述肠三叶肽为肠三叶因子。
4.权利要求1中的方法，其中所述哺乳动物是人。
5.权利要求1中的方法，其中所述损伤为粘膜炎。
6.权利要求1中的方法，其中所述损伤为口疮性口炎。
7.权利要求1中的方法，其中所述损伤由抗肿瘤治疗所致。
8.权利要求7中的方法，其中所述抗肿瘤治疗为放疗。
9.权利要求7中的方法，其中所述抗肿瘤治疗为化疗。
10.权利要求1中的方法，其中所述损伤是由牙龈炎所致。
11.权利要求1中的方法，其中所述损伤是拔牙所致。
12.权利要求1中的方法，其中所述损伤是组织活检和手术介入所致。
13.权利要求1中的方法，其中所述损伤是肿瘤切除所致。
14.权利要求1中的方法，其中所述损伤是由于烫伤或化学烧伤所致。
15.权利要求1中的方法，其中所述损伤是由于贝切特氏病所致。
16.权利要求1中的方法，其中所述损伤是由于细菌、病毒或真菌感染所致。
17.权利要求1中的方法，进一步包括给该所说的哺乳动物施用第二治疗药物。
18.权利要求17中的方法，其中所述第二治疗药物是抗炎性药物。
19.权利要求17中的方法，其中所述第二治疗药物是抗细菌药物。
20.权利要求19中的方法，其中所述抗细菌药物是青霉素、头孢菌素、四环素或氨基糖苷类药物。
21.权利要求19中的方法，其中所述抗细菌药物是聚乙烯吡咯烷酮碘。
22.权利要求17中的方法，其中所述第二治疗药物是抗真菌药物。
23.权利要求22中的方法，其中所述抗真菌药物是制真菌素或两性霉素B。
24.权利要求1 7中的方法，其中所述第二治疗药物是抗病毒药物。
25.权利要求24中的方法，其中所述抗病毒药物是无环鸟苷。
26.权利要求17中的方法，其中所述第二治疗药物是止痛剂。
27.权利要求26中的方法，其中所述止痛剂为利多卡因或苯坐卡因。
28.权利要求17中的方法，其中所述第二治疗药物是类固醇。
29.权利要求28中的方法，其中所述类固醇为去炎松或氢化可的松。
30.权利要求17中的方法，其中所述三叶肽与所述第二治疗药物在同一制剂中施用。
31.权利要求17中的方法，其中所述三叶肽与所述第二治疗药物在不同制剂中施用。
32.权利要求31中的方法，其中所述三叶肽与所述第二治疗药物在24小时内分别施用。
33.权利要求32中的方法，其中所述三叶肽与所述第二治疗药物在1小时内分别施用。
34.适用于将治疗药物传递到哺乳动物上消化道的组合物，所述组合物包含肠三叶肽。
35.权利要求34中的组合物，其中所述肠三叶肽为解痉多肽、pS2或肠三叶因子。
36.权利要求35中的组合物，其中所述肠三叶肽为肠三叶因子。
37.权利要求34中的组合物，其中所述组合物是口腔喷雾剂。
38.权利要求34中的组合物，其中所述组合物是口腔清洗液。
39.权利要求34中的组合物，其中所述组合物是生物降解性薄膜。
40.权利要求34中的组合物，其中所述组合物包含微球。
41.权利要求37、38、39或40中的组合物，其中所述组合物进一步包含粘膜粘附性药物。
42.权利要求34中的组合物，其中所述的组合物是口香糖、锭剂或可嚼片剂。
43.权利要求34中的组合物，其中所述的组合物进一步包含第二治疗药物。
44.权利要求43中的组合物，其中所述的第二治疗药物是抗炎性药物。
45.权利要求43中的组合物，其中所述的第二治疗药物是抗细菌药物。
46.权利要求45中的组合物，其中所述抗细菌药物是青霉素、头孢菌素、四环素或氨基糖苷类药物。
47.权利要求45中的组合物，其中所述抗细菌药物是聚乙烯吡咯烷酮碘。
48.权利要求43中的组合物，其中所述第二治疗药物是抗真菌药物。
49.权利要求48中的组合物，其中所述抗真菌药物是制真菌素或两性霉素B。
50.权利要求43中的组合物，其中所述第二治疗药物是抗病毒药物。
51.权利要求50中的组合物，其中所述抗病毒药物是无环鸟苷。
52.权利要求43中的组合物，其中所述第二治疗药物是止痛剂。
53.权利要求52中的组合物，其中所述止痛剂为利多卡因或苯坐卡因。
54.权利要求43中的组合物，其中所述第二治疗药物是类固醇。
55.权利要求54中的组合物，其中所述类固醇为去炎松或氢化可的松。
全文摘要
本发明涉及治疗或预防上消化道损伤(特别是口疮或粘膜炎损伤)的方法和组合物。肠三叶肽以有效浓度单独施用或与不同治疗药剂结合施用。
文档编号A61P31/04GK1520309SQ02812710
公开日2004年8月11日 申请日期2002年4月24日 优先权日2001年4月24日
发明者D·K·波多尔斯基, D K 波多尔斯基 申请人:综合医院公司