专利名称：Vhh单重链抗体及其在哺乳动物中的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于在哺乳动物中生产单链免疫球蛋白的方法，具体地讲，本发明涉及一种用于在哺乳动物中生产单链骆驼VHH抗体的方法。还披露了用本发明方法生产的单链抗体及其用途。
本发明背景抗体的抗原结合结构域包括两个独立的区域重链可变区(VH)和轻链可变区(VL它可能是Vκ或Vλ)。抗原结合位点本身是由6个多肽环形成的三个来自VH结构域(H1，H2和H3)，三个来自VL结构域(L1，L2和L3)。编码VH和VL结构域的V基因的多种主要成分是通过基因片段的组合性重排产生的。VH基因是通过三个基因片段VH，D和JH的重组产生的。在人体内，根据单倍型，存在大约51种功能性VH片段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)，25种功能性D片段(Corbett等(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6种功能性JH片段(Ravetch等(1981)Cell，27583)。VH片段编码形成VH结构域的第一和第二抗原结合环的多肽链的区(H1和H2)，而VH，D和JH片段组合形成VH结构域第三个抗原结合环(H3)。VL基因是通过仅有2个基因片段VL和JL的重组产生的。在人体内，根据单倍型，有大约40种功能性Vκ片段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)，31种功能性Vλ片段(Williams等(1996)JMol.Biol.，264220；Kawasaki等(1997)Genome Res.，7250)，5个功能性Jκ片段(Hieter等(1982)J.Biol.Chem.，2571516)和4种功能性Jλ片段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL片段编码多肽链的形成VL结构域的第一和第二抗原结合环(L1和L2)的区域，而VL和JL片段组合形成VL结构域的第三个抗原结合环(L3)。据信，选自这种主要成分的抗体具有足够的多样性，以便至少以中等亲和力结合几乎所有的抗原。高亲和力抗体是通过重排基因的“亲和力成熟”产生的，其中，由免疫系统根据改善了的结合，产生并且选择点突变。
重链基因座包括大量的可变链基因(VH；实际上不是完整基因，但包含第一编码外显子加上转录起始位点)，这些基因重组到两个短的编码区D和J(被称作VDJ重组)，这两个编码区位于编码重链Cμ的恒定区的外显子前面，得到被称作IgM的完整抗体重链区。随后发生了类转换，其中，所述可变区与位于IgM恒定区下游的另一个恒定区重组，得到IgD，IgG，IgA和IgE(由位于Cμ基因下游的各种Cδ，Cγ，Cα，Cε的外显子编码)。在该过程中缺失了间插的恒定区。在所述轻链基因座，κ基因座中发生了类似过程，并且，当这一过程不会导致在λ基因座中产生抗体时发生(有关综述参见Rajewski，K.，Nature381，p751-758，1996；深入的综述参见免疫学教科书，Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Capra.J.，Current BiologyPublications/Churchill Livingstone/Garland Publishing，fourthedition，1999，ISBN 0-8153-3217-3)。
骆驼类(双峰驼，单峰驼和无峰驼)除了正常的重链和轻链抗体(在一个抗体中具有两条轻链和两条重链)之外，还包括单链抗体(仅含有重链)。这种抗体是由一套被称为VHH基因的独特的VH片段编码的。单链抗体的抗原结合与在常规抗体上出现的抗原结合不同，不过，以相同方式获得了高的亲和力，即通过可变区的高变和表达所述高亲和力抗体的细胞的选择(亲和力成熟)。VH和VHH分散在基因组内(即它们彼此之间是混合出现的)。在VH和VHH cDNA中的相同D片段的鉴定表明，VH和VHH共同使用了D片段。含有VHH的天然抗体缺少重链恒定区的CH1结构域。编码CH1结构域的外显子存在于所述基因组中，但是由于缺少位于CH1外显子5’侧的功能性剪接受体序列而被剪接掉。结果，VDJ区被剪接到CH2外显子上。当VHH重组到所述恒定区(CH2，CH3)上时，就产生了一种起着单链抗体作用的抗体(即有两条重链，没有轻链相互作用的抗体)。抗原结合与常规抗体的抗原结合不同，但是以相同的方式获得了高亲和力，即通过可变区的高变和表达所述高亲和力抗体的细胞的选择而获得。
业已使用NMR和X光晶体学技术测定了分离的VH结构域的结构(Spinell等，(1996)，Nat Structural biol. 3，752)。数据表明，在骆驼VHH结构域中很好地保留了免疫球蛋白折叠。两个β折叠(一个具有四个β链，而另一个具有五个β链)彼此堆积在一起，并且通过C22和C92之间的保守的结构域内二硫键稳定化。骆驼VHH结构域的侧面相当于Fv中的正常VH上的VL界面，它具有差别很大的结构。与人VH相比，在该区域具有四个氨基酸取代。
通过检查所有人和小鼠VH抗原结合环结构，发现仅有有限数量的可能的构像。分别披露了第一和第二抗原结合环的三种和四种不同的构像。这种规范结构是通过所述环的长度和特定残基在关键位点上的存在决定的。H3环在长度和序列方面是高度可变的(Wu等(1993)Proteinsstructure，funct and genet.，16，1)。令人惊奇的是，骆驼VH结构域的抗原结合环背离了人和小鼠VHH结构域的规范环定义。这种背离是无法预测的，因为在骆驼VH和人VH之间环的长度和关键位点上的残基是非常类似的。骆驼VH结构域中的所述额外规范环结构使得其抗原互补位的结构成分大于来自常规抗体的Fv片段中的VH结构域的结构成分。另外，与人或小鼠抗体相比，第一抗原结合环周围的高变区被扩大了。人们认为，与常规抗体上的VH相比第一可变区的延长，和同时出现的抗原结合表面的扩大，部分补偿了VL结构域的缺乏(Riechmann，L. & Muyldermans，S(1999)，231 25-38)。
单结构域骆驼VHH抗体，以及比更大的重链和轻链抗体分子更适合于结构分析，还提供了一种小而有效的抗原结合单位。这种抗体具有多种和可变的治疗潜力。另外，业已发现，骆驼单链抗原能结合同时具有重链和轻链的抗体无法接触的抗原。人们认为这种能力是由于存在一个大的具有10个或10个以上氨基酸的突出的第三高变环，该高变环可以插入抗原表面的沟槽内。这一点是特别重要的，因为酶的催化位点通常位于其蛋白表面的最大的沟槽内(Ladowski，R.A(1996).Protein Science 5，2438)。所述位点对于常规抗体来说通常不是免疫原性的(Novotny，J等，(1986)Proc Nat Acad Sci USA，83，226)。在骆驼VHH cAb-Lys3的结构中，24个残基的H3环深深地穿透进入溶菌酶的活性位点(Transue，T.R等(1998)ProtStructure，Functand Genet，32，515)，这表明骆驼重链抗体具有形成特异性酶抑制剂的潜力。
最近，业已在细菌中制备了分离的骆驼VHH结构域(Riechmann，L等Journal of Immunological Methods 231(1999)，25-38)。不过，细菌表达系统具有不能进行翻译后修饰的缺陷。所述修饰，特别是糖基化事件对于抗体有效行使功能来说是重要的，特别是在体内环境下更是如此。
在相同的研究中，将编码骆驼VHH结构域的基因插入了表达载体内，并且在Cos细胞中表达，以便制备多结构域蛋白。在一种例子中，通过将特定的骆驼VHH克隆在人IgG1的铰链和效应功能结构域之前，制备了仅有完整的单重链的抗体。在Cos细胞中的表达与细菌表达系统相比所具有的优点是，在这些细胞中发生了翻译后修饰事件。与之一致的是，发现所述抗体在抗原结合方面具有完整活性。用于制备所述构建体的DNA通常是从用B细胞制备的成熟抗体(即经历了亲和力成熟的抗体)中分离的。尽管在哺乳动物细胞中表达的所述单链抗体在体外环境下能够结合一个或多个抗原，但是它们不能进行类(同种型)转换和亲和力成熟(高变)过程。因此，在Cos细胞中表达的单链抗体不能经历在哺乳动物中产生的天然存在的抗体的抗体进化过程。正是这种抗体进化过程导致了能以高亲和力结合的特异性抗体的产生。因此，本领域仍然需要一种可以在哺乳动物中制备单链VHH抗体的方法，以便可以进行正常的抗体进化过程。
另外，业已通过噬菌体展示技术，选择并且表达了骆驼单链抗体(Riechmann，L. & Davies，S.J.Bio.mol.NMR，6，141)。另外，尽管所述抗体构建体是用从成熟的B细胞或体细胞中分离的核酸制备的，因此，与上述情形相同，所表达的抗体不能经历类转换，和体细胞高变(亲和力成熟)，这种变化是生产能以选择性和高亲和力结合其抗原的特殊抗体所必须的。
本发明人认为，如果能够了解在B细胞早期抗体发育阶段骆驼单链抗体分子进化的机制(类转换和亲和力成熟)，就可以在体内重建该系统。这样就可以制备大量的进化单链抗体，用于结构、治疗和诊断应用。
发明概述包括重链和轻链的抗体分子在B细胞发育期间进行类转换。骨髓中的发育的B细胞首先表达膜结合IgM。在发育期间，表达了分泌型IgG。对于具有轻链和重链的抗体来说，将J区重组到Cμ区上，以便产生包括VHH，D和J区的IgM。通过转变成不同的重链恒定区，使IgM生产细胞进一步成熟，以便产生例如IgA。重组机制包括与IgM的VH部分重组的假轻链，所述假轻链存在于早期B细胞系。
本发明人认为，了解在前B细胞发育期间单链抗体类转换和/或发生亲和力成熟(抗体进化)的机制，可以制备本文所定义的VHH基因座，它会导致特异性单链VHH抗体的产生，这种抗体经历了与在其天然环境中产生的骆驼抗体相似或相同的进化过程。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种用于在哺乳动物中生产VHH单重链抗体的方法，包括在所述哺乳动物中表达异源VHH重链基因座的步骤。
VHH重链基因座优选包括(a)至少一个各自包括一个VHH外显子的VHH区，至少一个各自包括一个D外显子的D区，和至少一个各自包括一个J外显子的J区，其中，所述VHH区，D区和J区能够重组形成VDJ编码序列。
(b)包括至少一个Cγ恒定重链基因和至少一个Cμ恒定重链基因的恒定重链区，并且当它表达时，既不表达功能性CH1结构域，也不表达功能性CH4结构域，并且，当所述基因座表达时，能够形成完整的单重链IgG分子(scIgG)。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物中生产骆驼化VH单重链抗体的方法，包括在所述哺乳动物中表达骆驼化VH重链基因座的步骤。
所述骆驼化VH重链基因座优选包括(a)各自包括一个VH外显子的VH区，该VH外显子是突变的，以便其核酸序列与骆驼VHH外显子(‘骆驼化VH外显子’)相同，包括一个D外显子的D区，和包括一个J外显子的J区，其中，所述VH区，D区和J区能够重组形成VDJ编码序列，和(b)包括至少一个Cγ恒定重链基因和至少一个Cμ恒定重链基因的恒定重链区，并且当它表达时，既不表达功能性CH1结构域，也不表达功能性CH4结构域，并且，当所述基因座表达时，能够形成完整的单重链IgG分子(scIgG)。
在本发明这一方面的一种优选实施方案中，所述基因座包括一个或多个FRT(flp重组靶)位点(http//www.esb.utexus.edu)，以及两个或两个以上LoxP位点(它是由两个13bp的反向重复序列组成的，这两个重复序列通过8bp的非对称间隔区隔开)(Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol 225，890-900)根据本发明，在一个基因座中优选存在至少两个lox位点。
FRT位点在所述基因座中的存在，使得能够产生单拷贝转基因，而Lox位点的存在，使得在必要时缺失IgM和IgD重链基因。
本发明人业已证实，对于单重链抗体来说，发生了形成scAb(完整的单重链抗体多肽链)的类转换，该机制包括将步骤(a)的J区与步骤(b)的Cμ重链基因重组，以便首先形成膜结合IgM(使用CH4外显子，而不是CH3外显子)。这种中间产物构成了生产可溶性IgM的基础(使用CH3外显子，而不是CH4外显子)。然后使诸如Cδ，Cα，Cγ的另一种恒定区发生类转换，以便导致诸如IgD，IgA，IgG等的产生。
对于本发明来说，所述哺乳动物不是人。所述转基因哺乳动物优选比骆驼小，并且容易维持并且用需要的抗原进行免疫。理想的是，所述转基因哺乳动物是啮齿类动物，如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特别优选的是小鼠。还可以使用其他哺乳动物，包括山羊、绵羊、猫、狗和其他家养和野生哺乳动物。
当根据本发明的方法表达单链抗体时，优选使哺乳动物的内源重链基因座缺失或沉默。用于实现后一种目的的合适技术披露于以下文献中WO00/26373或WO96/33266和(Li和Baker(2000)Genetics156(2)809-821；Kitamura和Rajewsky(1992)；Kitamura和Rajewsky，(1992)Nature356，154-156)。
本发明所使用的术语‘VHH单重链抗体’表示仅由重链(通常为2个)组成的抗体分子，并且不包括任何轻链。每一个重链包括一个可变区(由VHH，D和J外显子编码)和一个恒定区。恒定区还包括一定数量的CH(恒定重链结构域)，它优选包括两个一个CH2结构域和一个CH3结构域，它们是由一个恒定区基因编码的。本文所定义的VHH单链抗体不具备功能性CH1结构域，并且还缺乏功能性CH4结构域。正是由于功能性CH1结构域的缺乏(在常规抗体中，具有用于锚定轻链恒定区的锚定部位)，导致了本发明的重链抗体不能与轻链结合，以便形成常规抗体。
本发明的术语‘骆驼化(camelised)VH单重链抗体’表示仅由重链(通常为2条)组成的抗体分子，并且不包括任何轻链。每一个重链包括一个可变区(由‘骆驼化VH外显子’D和J外显子编码)和一个恒定区。恒定区包括至少一个恒定区基因。每一个恒定区基因包括多个恒定区外显子，每一个外显子编码一个恒定区CH结构域。一般，恒定区包括两个CH结构域一个CH2结构域和一个CH3结构域。本文所定义的骆驼化VH单链抗体不具有功能性CH1结构域，此外，它还缺乏功能性CH4结构域。正是由于功能性CH1结构域的缺乏(在常规抗体中，具有用于锚定轻链恒定区的锚定部位)，导致了本发明的重链抗体不能与轻链结合，以便形成常规抗体。
在本发明中，术语‘异源’表示本文所定义的VHH重链基因座不是所述哺乳动物内源的。就是说，当所述哺乳动物是骆驼类，即双峰驼或无峰驼时，所述表达是正常情况下不存在于双峰驼或无峰驼体内的VHH基因座的表达。
本发明的‘VHH重链基因座’由一个‘VHH区’，一个‘J区’，一个‘D区’和一个‘恒定重链区’组成。每一个VHH区包括一个VHH外显子，每一个J区包括一个J外显子，而每一个D区包括一个D外显子，并且每一个重链恒定区包括一个或多个重链恒定区基因。另外，每一个VHH区基本上不包括一个或多个功能性VH外显子。
本发明的‘VHH外显子/区’表示天然存在的VHH编码序列，如存在于骆驼体内的编码序列及其任何同源物，衍生物或片段，只要当所述核酸表达时所得到的外显子/区能与本发明的D外显子/区，J外显子/区和恒定重链区(包括若干外显子)重组，以便产生本文所定义的VHH单链抗体。
本发明的‘骆驼化VH重链基因座’由本文所定义的一个‘骆驼化VH区’，一个‘J区’，一个‘D区’和一个‘恒定重链区’组成。每一个骆驼化VH区包括一个骆驼化VH外显子，每一个J区包括一个J外显子，而每一个D区包括一个D外显子，并且每一个重链恒定区包括一个或多个重链恒定区外显子。
本发明的‘骆驼化VH外显子/区’表示源于除了骆驼以外的哺乳动物的天然存在的VH编码序列，例如，发生了突变的人VH编码序列，以便所述序列与骆驼外显子的序列相同。本发明的骆驼化VH外显子在其范围内还包括所述外显子的任何同源物，衍生物或片段，只要外显子/区能与D区/外显子，J区/外显子和包括本发明的一个或多个外显子的恒定重链区重组，以便产生本文所定义的骆驼化VH单链抗体。
VHH和VH外显子可以来自天然存在的来源，或者它们可以是用本领域技术人员所熟悉的并且在本文中所披露的方法合成的。
同样，在本发明中，术语‘D外显子’和‘J外显子’包括天然存在的D和J外显子序列，这些序列存在于骆驼或其他哺乳动物物种中。术语D外显子和J外显子的范围内还包括它的衍生物，同源物和片段，因为所得到的外显子能与本文所披露的重链抗体基因座的其余部分重组(骆驼化VH或VHH)，以便产生本文所披露的单链抗体。D和J外显子/区可源于天然存在的来源或可以用本领域技术人员所熟悉的、并且披露于本文中的方法合成。
另外，本发明的重链抗体基因座(VHH或骆驼化VH)包括编码恒定重链多肽的DNA区(恒定重链区)的DNA。
每一个恒定重链区主要包括至少一个恒定区重链基因，该基因是Cγ，以便可以产生单链IgG。每一个恒定重链基因包括一个或多个恒定重链外显子，它可以是来源于骆驼或非骆驼的，并且是从Cμ、Cδ，Cγ1-4，Cε和Cα1-2中选择的。在本发明的重链抗体基因座中的至少一个重链恒定区外显子优选是源于人、小鼠或兔的。优选至少一个C γ重链外显子是源于人的。在表达时，所述恒定重链区缺少存在于双链抗体中的功能性CH1和CH2结构域。优选在本发明的恒定重链区中只存在一个或多个具有修饰过的(无功能的)CH1结构域的Cγ2和/或Cγ3基因。
本文所定义的‘恒定重链基因座外显子’(‘CH外显子’)包括天然存在的CH外显子序列，如存在于骆驼类或人或包括兔和小鼠在内的其他哺乳动物中的CH外显子。术语‘CH外显子’的范围还包括它的衍生物、同源物和片段，只要当它是恒定重链区的成分时，CH外显子能够形成功能性单重链抗体(包括由VHH外显子或骆驼化VH外显子编码的区)。
一般，CH基因包括三个或四个外显子(CH1-CH4)，它能编码每一个恒定重链多肽的不同结构域，通常由两个多肽构成本文所定义的单重链抗体。不过，正如上文所披露的，VHH和骆驼化VH单链抗体不具有功能性CH1(含有轻链结构域锚定区)或CH4。因此，本发明的单重链抗体基因座具有一个或多个不能表达功能性CH1或CH4结构域的基因。这种现象可能通过所述恒定重链区基因的CH1和CH4外显子的突变、缺失、取代或其他处理产生。
在本发明的一种优选实施方案中，单链VHH基因座包括至少一个恒定重链基因，其中编码CH1和CH4的结构域的核酸是突变、缺失或取代或以其他方式处理过的，以便所表达的本文所定义的VHH单链抗体的恒定重链不包括功能性CH1结构域和CH4结构域。
为了消除疑问，上文所提到的术语‘来源于兔的’或‘来源于人的’，表示包括本发明的重链抗体基因座(骆驼化VH或VHH)的一个或多个外显子的核酸序列与一个或多个天然存在的兔或人抗体基因座外显子相同。本领域技术人员可以理解的是，所述外显子可源于天然来源，或者可以用本领域技术人员所熟悉的和本文所披露的方法合成。
每一个VHH或‘骆驼化VH区’分别包括一个VHH外显子或‘骆驼化VH外显子’，每一个J区和D区分别包括一个J和D外显子。优选的是，每一个重链基因座包括一个以上，两个以上，三个以上，四个以上，五个以上，六个以上J和/或D区外显子。最优选的是，本发明的VHH基因座或骆驼化VH基因座包括与骆驼相同数量的VHH外显子/区和/或D外显子/区和/或J外显子/区。
优选的是，本发明这一方面的方法是通过表达VHH重链基因座或骆驼化VH重链基因座生产单链抗体，所述基因座包括一个或多个本文所定义的来源于人、兔或小鼠的恒定重链外显子。就是说，本发明的单重链抗体优选是通过杂合的骆驼/人基因座或杂合的骆驼/兔基因座或杂合的骆驼/小鼠基因座的表达产生的。在本发明这一方面的特别优选的实施方案中，根据本发明方法表达的单重链基因座包括来源于骆驼的所有VHH外显子和来源于人、兔或小鼠的所有D、J和恒定重链区外显子。在本发明这一方面的另一种优选实施方案中，根据本发明方法表达的单重链基因座包括所有骆驼化VH外显子，和来源于人或兔或小鼠的所有D、J和恒定重链区外显子。
在本发明上述方面的一种优选实施方案中，所述重链基因座还包括一个或多个盒位点，所述位点允许基因座从一个载体装盒(cassetting)到另一个载体中。优选一个或多个盒位点位于所述基因座的5’前导序列中和/或位于所述基因座的3’非翻译区。优选有一个或多个盒位点同时位于所述基因座的5’前导序列中和所述基因座的3’非翻译区。例如，所述直接装盒，允许将核酸转移到细菌表达载体中，以便添加标记和信号等。
上述所披露的这种用于制备杂合单重链抗体的方法可以特别适用于制备用于人治疗的抗体，通常将抗体施用于与所述抗体的来源不同的脊椎动物时，导致出现针对所施用抗体的免疫应答。因此，杂合的骆驼/人单链抗体在给人施用时很可能比骆驼单链抗体具有更低的免疫原性。
在本发明中，所述抗体包括基本上相同的成分。基本上相同表示具有超过80％的同源性，更优选超过85％，90％，95％的同源性。更优选超过96％，97％，98％的同源性。最优选的是，基本上相同表示突变的人VH区与骆驼VHH区的同源性超过99％。
在另一方面，本发明提供了一种可以通过本发明方法获得的VHH单重链抗体，其中，所述抗体的由VHH外显子编码的部分是由来源于骆驼的外显子编码，而所述抗体分子的其余部分是由来源于人的外显子编码。
在另一方面，本发明提供了一种可以通过本发明方法获得的VHH单重链抗体，其中，所述抗体的由VHH外显子编码的部分是由来源于骆驼的外显子编码的，而恒定重链区是由来源于兔的一个或多个外显子编码的。
在另一方面，本发明提供了一种可以通过本发明方法获得的VHH单重链抗体，其中，所述抗体的由VHH外显子编码的部分是由来源于骆驼的外显子编码的，而恒定重链区是由来源于小鼠的一个或多个外显子编码的。
在另一方面，本发明提供了一种可以通过本发明方法获得的骆驼化单重链抗体。
优选的是，本发明这一方面的骆驼化VH单重链抗体完全是由本文所定义的来源于人的外显子编码的。
在本发明这一方面的另一种优选实施方案中，骆驼化VH单重链抗体包括由来源于兔的一个或多个外显子编码的恒定重链区。
在另一种实施方案中，根据本发明这一方面的骆驼化VH单重链抗体包括由来源于小鼠的一个或多个外显子编码的恒定重链区。
与现有技术的抗体相比，通过本发明方法生产的抗体的优点是，它能经历与在它的正常环境中产生的单链骆驼抗体相似或相同的类转换过程。可以通过本发明方法获得的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。它们优选是单克隆抗体。抗体可以用本领域技术人员所公知的方法制备。优选将杂交瘤用于制备单克隆抗体。有关技术是本领域技术人员所熟悉的，并且披露于本文中。
在另一方面，本发明提供了一种包括本发明的VHH重链基因座的载体。
在另一方面，本发明提供了一种包括本发明的骆驼化VH重链基因座的载体。
合适的载体为本领域技术人员所熟知。有利的是，优选适合插入大量核酸，足以编码完整的免疫球蛋白重链基因座的载体。合适载体包括酵母和细菌人工染色体，如YACs和BACs。有利的是，构建载体，以便将编码本文所定义的单重链抗体基因座的核酸直接装盒到不同的载体中。例如，可以将编码单重链抗体的逆转录cDNA‘装盒’到细菌表达载体中，以便添加标记、信号或表位等。
在另一方面，本发明提供了一种用本发明的VHH基因座转化过的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了一种表达本发明的异源VHH重链基因座的转基因哺乳动物。
在另一方面，本发明提供了一种表达本发明的骆驼化VH重链基因座的转基因哺乳动物。
在本发明中，术语‘转基因哺乳动物’的范围不包括转基因人。本发明的转基因哺乳动物优选是比骆驼类小的哺乳动物。所述哺乳动物优选选自下列一组小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴子和兔。优选是小鼠。
在本发明的转基因哺乳动物中，优选使所述转基因动物的内源重链基因座缺失或沉默。用于后一种目的的合适技术披露于以下文献中WO00/26373或WO96/33266和(Li和Baker(2000)Genetics156(2)809-821；Kitamura和Rajewsky(1992)；Kitamura和Rajewsky，(1992)Nature356，154-156)。
抗体生产细胞可源于本发明的转基因动物，并且用于，例如，制备用来生产本文所定义的VHH单链抗体的杂交瘤。作为补充或替代方案，使用本领域技术人员所熟悉的重组DNA技术可以从本发明的转基因哺乳动物中分离核酸序列，并且用于生产单链抗体。作为替代或补充方案，可以通过对本发明的转基因动物进行免疫，制备特殊的单链抗体。
因此，在另一方面，本发明提供了一种通过用一种抗原免疫本发明的转基因哺乳动物而生产单链抗体的方法。
在本发明这一方面的一种优选实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。
在本发明中，术语‘免疫’哺乳动物，表示给本发明的转基因哺乳动物施用一种抗原，以便诱导针对这种抗原的免疫应答。用于免疫所述哺乳动物的合适方法为本领域技术人员所熟知，并且披露于本文中。合适的抗原可以是天然存在的或合成的。天然存在的抗原包括蛋白，例如，它可能是酶或辅因子，肽和核酸分子。本领域技术人员可以理解的是，以上所列举的例子并非是穷举性的。
在另一方面，本发明提供了本文所披露的单重链抗体用作细胞内结合试剂的用途。
在另一方面，本发明提供了本发明的单链抗体作为酶抑制剂的用途。
在另一方面，本发明提供了通过本发明方法可获得的抗体在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
在最后一方面，本发明提供了本发明的重链抗体基因座在预防和治疗疾病中的用途。
定义‘基因’包括编码完整mRNA的一个或多个外显子。‘抗体基因’包括V，D，J外显子，它们能重组形成VDJ编码区，该编码区随后进一步与包括一个或多个恒定重链外显子的恒定重链区重组。有许多V，DJ和C外显子的亚型。一个特定的V区具有一个外显子，一个D区具有一个外显子，一个J区具有一个外显子，以及一个C区具有若干外显子。当选择了一个V外显子，一个D外显子，一个J外显子和一个C区时，在重组之后它们共同形成一个完整基因。
‘外显子’和‘内含子’。外显子是脱氧核苷酸的编码序列或信使序列。就是说，它是真核生物的最终会以成熟的mRNA或rRNA分子形式表达的任何DNA序列。在外显子之间通常分散有内含子。内含子是非编码DNA序列。就是说，它们是最终不会以成熟RNA分子形式表达的DNA序列。为了制备成熟mRNA，将内含子从新转录的RNA上剪切掉。
本发明的‘VHH重链基因座’由‘VHH区’，‘J区/外显子’，‘D区/外显子’和‘恒定重链区’组成。每一个VHH区包括一个VHH外显子，每一个J区包括一个J外显子，而每一个D区包括一个D外显子，以及每一个重链恒定区包括一个或多个重链恒定区外显子。
本发明的‘VHH外显子/区’表示天然存在的VHH编码序列，如存在于骆驼体内的序列，及其任何同源物、衍生物或片段，只要当所述核酸表达时，当本文所定义的VHH区的成分与本发明的至少一个D区，至少一个J区和至少一个恒定重链区重组时，所得到的外显子能够产生本文所定义的VHH单链抗体。
本发明的‘骆驼化VH基因座’由一个或多个本文所定义‘骆驼化VH区’，一个或多个‘J区’，一个或多个‘D区’，和‘恒定重链区’组成。每一个骆驼化VH区包括一个骆驼化VH外显子，每一个J区包括一个J外显子，而每一个D区包括一个D外显子，并且每一个重链恒定区包括一个或多个重链恒定区基因。
在本文中，‘骆驼化VH外显子/区’表示源于除了骆驼以外的哺乳动物，例如，业已突变了的人的天然存在的VH编码区，以便所述序列与骆驼外显子的序列相同。本发明的骆驼化VH外显子的范围，还包括所述外显子的任何同源物、衍生物或片段，只要当本文所定义的骆驼化VH区的成分与本发明的至少一个D区，一个J区，和一个恒定重链区重组时所得到的外显子能够产生本文所定义的骆驼化VH单链抗体。
本文所定义的‘恒定重链区外显子’(‘CH外显子’)包括天然存在的CH外显子序列，例如存在于骆驼或人或包括兔和小鼠在内的其他哺乳动物中的序列。术语‘CH外显子’的范围还包括其衍生物，同源物，和片段，只要当所述CH外显子是恒定重链区的一种成分时，它能够形成本文所定义的功能性单重链抗体。一般，CH外显子具有四种不同类型(CH1-CH4)，它们编码每一种恒定重链多肽的不同部分(结构域)。不过，本发明的VHH和骆驼化VH单链抗体不具有功能性CH1结构域(含有轻链结构域锚定区)，也不具有功能性CH4结构域。存在大量的恒定重链区外显子的亚型。不同的抗体类型具有不同的CH外显子，例如，IgM分子具有一个或多个Cμ恒定区外显子，而IgG分子具有一个或多个Cγ外显子。
本发明的‘VHH单重链抗体’表示仅由重链(通常为2条)组成的抗体分子，而不包括任何轻链。每一个重链包括一个可变区(由VHH、D和J外显子编码)，和一个恒定区。恒定区还包括多个由恒定重链区外显子编码的CH结构域，通常它包括两个结构域一个CH2结构域和一个CH3结构域。本文所披露的VHH单链抗体不具有功能性CH1结构域，也不具有功能性CH4结构域。正是由于缺乏功能性CH1结构域(在常规抗体中具有用于锚定轻链恒定区的锚定位置)，导致了本发明的重链抗体不能与轻链缔合形成常规抗体。被称为scIgG2和/或scIgG3的抗体的亚类仅包括Cγ2和/或Cγ3基因。
本发明的术语‘骆驼化VH单重链抗体’表示仅由重链(通常为2条)组成的抗体分子，而不包括任何轻链。每一个重链包括一个可变区(由‘骆驼化VH外显子’，D和J外显子编码)和一个恒定区。由恒定区外显子编码的恒定区另外编码多个CH结构域，通常包括两个一个CH2结构域和一个CH3结构域。本文所定义的骆驼化VH单链抗体不具有功能性CH1结构域或功能性CH4结构域。由于缺乏功能性CH1结构域(在常规抗体中具有用于锚定轻链恒定区的锚定位置)本发明的重链抗体不能与轻链缔合形成常规抗体。
本文所使用的‘抗体’表示能够结合选定靶位的抗体或抗体片段，并且包括单克隆抗体和多克隆抗体，工程化抗体，包括嵌合的、CDR-嫁接的和人源化的抗体，以及通过噬菌体展示或其他技术生产的人工选择的抗体。小的抗体片段具有用于根据其小的大小和同时具有的优良组织分布能力进行用于诊断和治疗用途的优良特性。
‘抗体进化’表示在抗体发育期间出现的类转换和亲和力成熟(体细胞高变)的过程，它会导致能选择性地结合，并且具有高亲和力的抗体的产生。
附图简述
图1表示本发明的优选单链抗体基因座。
发明详述一般技术除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所普遍理解的相同含义(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)。将标准技术用于分子、遗传学和生物化学方法(一般参见，Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocolsin Molecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley & Sons，Inc.。以上文献被收作本文参考)和化学方法。另外，有关标准免疫学技术可以参见Harlow & Lane.，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor，N.Y.。
本发明的VH/h重链基因座在第一方面，本发明提供了一种用于在哺乳动物中生产VHH单重链抗体的方法，包括在所述哺乳动物中表达异源VHH重链基因座的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种用于生产在哺乳动物中生产骆驼化VH单重链抗体的方法，包括在所述哺乳动物中表达骆驼化VH重链基因座的步骤。
有关基因座构建的细节在本发明的概述部分有详细说明。
优选的是，本发明的基因座包括一个或多个FRT(flp重组靶)位点(http//www.esb.utexus.edu)，和两个或两个以上LoxP位点(它由两个1 3bp的反向重复序列组成，这两个序列由8bp的不对称间隔区隔开)(Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol225，890-900)。
在本发明的基因座中优选具有至少两个LoxP位点。FRT位点在所述基因座中的存在使得可以生产单拷贝转基因，而Lox位点的存在使得在必要时可以缺失IgM和IgD重链基因。
(A)载体本发明还提供了包括本发明构建体的载体。主要提供了两种类型的载体，复制载体和转化载体。
(I)复制载体可以将本发明的构建体掺入到诸如BAC载体的重组可复制载体中。可以将所述载体用于在相容的宿主细胞中复制所述构建体。因此，在另一种实施方案中，本发明提供了一种制备本发明构建体的方法，包括将本发明的构建体导入可复制载体，将所述载体导入相容的宿主细胞，并且在所述构建体能够复制的条件下生长所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收所述构建体。合适的宿主细胞包括诸如大肠杆菌的细菌、酵母、哺乳动物细胞系和其他真核细胞系，如昆虫Sf9细胞(杆状病毒)。
(II)转化载体还可以将本发明的构建体掺入到能够将所述构建体插入受体基因组、并因此实现转化的载体中。除了本发明的构建体之外，所述转化载体可以包括一个或多个以下成分。
启动子启动子通常是从能够在哺乳动物细胞中起作用的启动子中选择的，不过，也可以使用原核启动子和能够在其他真核细胞中起作用的启动子。启动子通常源于病毒或真核基因的启动子序列。例如，它可以是源于发生表达的细胞的基因组的启动子。对于真核启动子来说，它可以是以遍在方式起作用的启动子(如α-肌动蛋白、β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)或以组织特异性方式起作用的启动子(如免疫球蛋白基因的启动子)。它们还可以是对特殊刺激有反应的启动子，例如，能结合甾体激素受体的启动子。还可以使用病毒启动子，例如，Moloney鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)启动子，Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。另外有利的是，所述启动子是诱导型的，以便异源基因的表达水平，在细胞的生命时间内是可以调节的。诱导型表示用启动子可以调节获得的表达水平。
另外，可以通过添加其他调节序列，例如增强子序列，对上述任一种启动子进行修饰。优选能够调节在抗体生产细胞中表达的组织特异性增强子。具体地讲，可以包括成功地在体内激活抗体基因座所需要的重链增强子(Serwe，M.，和Sablitzky，F.，EMBO J.12，p2321-2321，1993)。还可以使用基因座控制区(LCRs)，特别是免疫球蛋白LCR。还可以使用包括来自两个或两个以上不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
其他载体成分除了启动子和所述构建体之外，本发明的载体优选包括可用于优化所述载体在插入了该载体的哺乳动物中的功能的其他元件。这些元件为本领域技术人员所熟知，并且，举例来说，披露于以下文献中Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。
载体的构建用于转化哺乳动物胚胎的载体是使用本领域众所周知的方法构建的，包括，但不限于限制性内切核酸酶消化、连接、质粒和DNA和RNA纯化、DNA测序等标准化技术，例如，这些技术披露于以下文献中Sambrook，Fritsch，和Maniatis，eds.，Molecular CloningALaboratory Manual.，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。一般，载体构建包括以下步骤a)使内源小鼠基因座失活，例如，使用公开的剔除方法之一(例如，Kitamara，D和Rajewski K.，Nature352，p154-156，1992)。
b)本文所披露的合适重链区的DJ和IgM区是作为重组DNA从人PAC，BAC或YAC文库中定位的，并且是作为限制酶片段，例如Sall片段克隆的。该区还包括用于在体内成功地激活抗体基因座所需要的重链增强子(参见Serwe，M.，Sablitzky，F.，EMBO J.12，p2321-2321，1993)。
c)首先，通过用常规技术构建合适的基因组DNA文库，将大量VHH或‘骆驼化VH外显子’克隆为粘粒。由于VHH外显子定位在本文所披露的VH外显子之间，这些外显子随后随同VHH外显子一起克隆。因此，产生了一系列VH和VHH外显子。这一系列的基因可以作为MluI(或其他限制酶)片段分离。
d)3′人免疫球蛋白重链LCR-所述基因座表达所需要的调节区是作为SceI限制片段克隆的。
e)所述恒定区重链外显子是作为分离的限制片段克隆的。通过在细菌内进行同源重组(Imam等，2000)，通过除去CH1外显子和/或CH4外显子的剪接受体序列(Nguyen等，同上)，使得由相应的外显子编码的CH1和/或CH4结构域没有功能。
步骤b-e提供了‘VHH重链基因座’或‘骆驼化VH重链基因座’的片段(图3)，这些片段将接管在步骤a)中披露的失活的小鼠基因座的功能。所述基因座是通过将每一个片段以合适的顺序克隆到合适的载体，例如，含有包括上述所有限制位点的接头区的BAC载体中而构建的(图1)。按照本发明方法制备的基因座，其大小通常为200-250kb。可以通过本领域技术人员所熟知的标准实验室技术从所述载体中分离并且纯化所述基因座。然后，可以将编码本发明的‘VHH重链基因座’或‘骆驼化VH重链基因座’的纯化核酸(图3)通过标准技术导入源于在步骤a)中所披露的剔除小鼠的小鼠受精卵内，以便获得能表达一个或多个本发明基因座的转基因小鼠。
本发明的单链抗体应当理解的是，本发明的术语‘单重链抗体’和‘VHH重链基因座’还包括从任何来源获得的同源多肽和核酸序列，例如，相关的细胞同源物，来自其他物种的同源物及其变体或衍生物。
因此，本发明包括本文所披露的单重链抗体和VHH重链基因座的变体、同源物或衍生物。
在本发明中，同源序列包括在氨基酸水平上，超过至少30，优选50，70，90或100个氨基酸，具有至少80，85，90，95，96，97，98，99，99.5，99.6，99.7，99.8，99.9％的同一性的氨基酸序列。尽管同源性还可以被理解成相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，在本发明中，它优选表示序列同一性方面的同源性。
同源性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是，借助于可方便获得的序列比较程序进行。这些市场上出售的计算机程序可以计算两个或两个以上序列之间的百分同源性。百分同源性可以在连续序列中计算，即一个序列与另一个序列比对，并且将一个序列中的每一个氨基酸直接与另一个序列中的相应的氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这种比较被称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对仅在相对较少数量的残基上进行(例如少于50个连续氨基酸)。
尽管这是一种非常简单和一致的方法，但是它无法考虑，例如，本来应该相同的序列对，由于一个插入或缺失，将会导致随后的氨基酸残基不能恰当比对，因此，在进行总体比对时，很有可能导致百分同源性的显著降低。因此，大多数序列比较方法被设计用于产生考虑到了可能的插入和缺失的最佳比对，而不会过度对总体同源性罚分。这一目的是通过在序列比对中插入“空位”以便使局部同源性最大化而实现的。
不过，这种更复杂的方法为存在于比对中的每一个空位规定了“空位罚分”，以便对于相同数量的相同氨基酸来说，具有尽可能少的空位的序列比对——体现了两个比较序列之间的更的相关性——将获得比具有很多空位的序列更高的得分。通常使用“亲族空位成本(affinegap costs)”，它通常用于对空位的存在罚相对高的分，并且对所述空位中每一个后续的残基罚相对少的分。这是最常用的空位评分系统。高的空位罚分，理所当然地会产生具有较少空位的最优比队。大多数比对程序允许对空位罚分进行修改。不过，在将所述软件用于序列比较时，优选使用缺省值。当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(参见下文)时，对于空位的氨基酸序列的缺省空位罚分为-12，而对于每一个延伸来说为-4。
因此，最大百分同源性的计算，首先需要产生最优比对，这种比对考虑到了空位罚分。用于进行这种比对的一种合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)。可以进行序列比较的其他软件的例子包括，但不局限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999，同上，第18章)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS成组比较工具。BLAST和FASTA都可用于脱机和联机检索(参见Ausubel等，1999，同上，第7-58到7-60页)。不过，优选使用GCG Bestfit程序。
尽管能够以同一性形式测量最终百分同源性，所述比对过程本身通常不基于全或无的成对比较。相反，通常使用一种成比例的相似性评分矩阵，它能根据化学相似性或进化距离为每一种成对的比较确定得分。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-用于BLAST程序组的缺省矩阵。如果已经提供，GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值或客户符号比较表(更多的细节参见用户手册)。对于GCG软件包来说，优选使用公共缺省值。或对于其他软件来说，使用诸如BLOSUM62的缺省矩阵。
一旦所述软件产生了最优比对，就可以计算百分同源性，优选百分序列同一性。所述软件通常是将其作为序列比较的一部分而进行的，并且产生了数字结果。
用于生产本发明单链抗体的方法(A)转基因动物可以将本发明的基因座和载体导入一种动物，以便产生转基因动物。因此，本发明还提供了包括本文所披露的构建体的转基因动物。
可以通过本领域技术人员所了解的任何技术将所述基因座插入受体动物的基因组中，例如，通过显微注射。在将核酸导入受精卵之后，用本领域技术人员所熟知的标准方法进行重新植入。通常，对替代宿主进行麻醉，并且将所述卵插入输卵管。植入特定宿主体内的卵的数量有所不同，但是通常与该物种天然产生的后代的数量相当。
另外，可以将所述DNA导入胚胎干细胞(ES)，可以将这种细胞插入宿主胚胎，以便通过标准技术产生转基因小鼠。
在另一种实施方案中，可以将所述DNA导入任何细胞。用所述细胞的细胞核取代来自任何物种的受精卵的细胞核，以便产生转基因动物。这种核转移技术为本领域技术人员所熟知。
可以通过任何合适的方法筛选替代宿主的转基因后代中转基因的存在。筛选通常是通过Southern或Northern分析进行的，使用至少与所述转基因的一部分互补的探针。可以使用对由所述转基因编码的抗体特异的配体进行的Western印迹分析作为筛选的替代或补充方案。通常，检测被认为以最高水平表达转基因的组织或细胞，不过，任何组织或细胞类型都可用于这种分析。
所述转基因哺乳动物的后代可以通过让所述转基因哺乳动物与合适的配偶体交配，或通过从所述转基因哺乳动物获得的卵和/或精子的体外受精而获得。在采用体外受精时，可以将受精的胚胎植入替代宿主，或在体外温育，或进行这两种操作。在通过交配产生转基因后代时，可以让所述转基因哺乳动物与亲代系回交。无论采用哪一种方法，都可以用上述方法或其他合适的方法评估所述后代中转基因的存在。
所述动物可以改变，只要是哺乳动物就行。所述动物优选是非人哺乳动物，如啮齿类，更优选是大鼠或小鼠。就此而言，所述受体动物还优选不能产生包括轻链的抗体，或者最起码产生这种抗体的能力降低。为此，所述受体动物可以是“剔除”动物，它可能具有产生轻链被关闭或阻遏的抗体所需要的一个或多个基因。
通过使用不能产生包括轻链的抗体或起码具有降低的产生这种抗体的能力的宿主动物，本发明的方法在用特定抗原刺激时，能够有效生产大量的单链抗体和来自本发明转基因动物的抗体生产细胞。
(B)噬菌体展示技术用于噬菌体展示的载体将所编码的多肽融合于，例如，基因III蛋白(pIII)或基因VIII蛋白(pVIII)，以便展示在丝状噬菌体，如M13的表面。参见Barbas等，Phage DisplayA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001)(ISBN 0-87969-546-3)；Kay等(eds.)，Phase Display of Peptides and ProteinsA LaboratorvManual，San DiegoAcademic Press，Inc.，1996；Abelson等(eds.)，Combinatorial Chemistry，Methods in Enzymology vol.267，Academic Press(May1996)。
原核宿主特别适用于生产本发明的噬菌体展示抗体。现在业已完善了噬菌体展示抗体的技术，其中，将抗体可变区片段融合于，例如，基因III蛋白(pIII)或基因VIII蛋白(pVIII)上，以便展示在如M13的丝状噬菌体表面上，Sidhu，Curr.Opin.Biotechnol.11(6)610-6(2000)；Griffiths等，Curr.Opin.Biotechnol.9(1)102-8(1998)；Hoogenboom等，Immunotechnology，4(1)1-20(1998)；Rader等，Current Opinion in Biotechnology 8503-508(1997)；Aujame等，Human Antibodies 8155-168(1997)；Hoogenboom，Trendsin Biotechnol.1562-70(1997)；de Kruif等，17453-455(1996)；Barbas等，Trends in Biotechnol.14230-234(1996)；Winter等，Ann.Rev.Immunol.433-455(1994)，最近业已汇编了制备、繁殖、筛选(淘选)和使用所述文库的抗体片段所需要的技术和方法，Barbas等，Phage DisplayA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)(ISBN 0-87969-546-3)；Kay等(eds.)，Phage Display of Peptides and ProteinsA Laboratory Manual，Academic Press，Inc.(1996)；Abelson等(eds.)，CombinatorialChemistry，Methods in Enzymology vol.267，Academic Press(May1996)，以上文献被以其全文形式收作本文参考。
对于本文所述的包括其片段的抗体的噬菌体展示来说，它们优选与噬菌体g3p蛋白融合。
(C)杂交瘤可以用业已建立的方法，利用重组DNA技术在细菌，优选在哺乳动物细胞培养物中生产本发明的单链抗体。所选择的细胞培养系统优选能分泌单链抗体产物。
杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外繁殖是在合适的培养基中进行的，这些培养基是常见的标准培养基，例如，Dulbecco′s改进的Eagle培养基(DMEM)或RPMI1640培养基，任选补充了哺乳动物血清，例如，胎牛血清或微量元素和生长维持添加剂，例如，饲养细胞，如正常小鼠腹膜溢泌细胞，体细胞，骨髓巨噬细胞，2-氨基乙醇，胰岛素，运铁蛋白，低密度脂蛋白，或油酸等。诸如细菌细胞或酵母细胞的宿主细胞的扩增，同样是在本领域所公知的合适培养基中进行，例如，对于细菌来说，使用LB，NZCYM，NZYM，NZM，Terrific培养液，SOB，SOC，2×YT，或M9基本培养基，而对于酵母来说，使用YPD，YEPD，基本培养基，或完全基本Dropout培养基。
在体外生产中，提供了相对纯的免疫球蛋白制剂，并且可以放大以提供大量的需要的免疫球蛋白。用于细菌细胞、酵母或哺乳动物细胞培养的技术为本领域技术人员所公知，并且包括均匀悬浮培养，例如，在气升式反应器或在连续搅拌反应器，或固定化或限制细胞培养物中培养，例如在空心纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷柱上培养。
还可以通过在体内扩增哺乳动物细胞获得大量需要的免疫球蛋白。为此，将产生需要的免疫球蛋白的杂交瘤细胞注射到组织相容性哺乳动物中，导致抗体生产肿瘤的生长。在注射之前，任选用烃激发所述动物，特别是使用诸如降植烷(四甲基-十五烷)的矿物油。在1-3周之后，从所述哺乳动物的体液中分离免疫球蛋白。例如，杂交瘤细胞是通过以下方法获得的通过将合适的骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的抗体生产脾细胞融合，或将源于能产生需要的抗体的杂交瘤细胞系Sp2/0的转染过的细胞经腹膜内途径注射到任选用降植烷处理过的Balb/c小鼠体内，并且在1-2周之后，从所述动物中采集腹水。
例如，上述及其他技术披露于以下文献中Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor，这些文献被收作本文参考。用于制备重组抗体分子的技术披露于上述文献中，并且还披露于诸如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597的文献中，这些文献被收作本文参考。
在所述细胞培养上清液中筛选需要的抗体，优选通过免疫印迹，通过酶免疫测定，例如，夹心测定或斑点测定，或放射免疫测定对表达需要的靶的细胞进行免疫荧光染色而筛选。
为了分离所述抗体，可以浓缩存在于所述培养上清液或腹水中的抗体，例如，通过用硫酸铵沉淀，用诸如聚乙二醇的吸湿材料透析，或通过选择性膜过滤等。如果必要和/或需要的话，通过常用的层析方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析，用DEAE-纤维素层析和/或(免疫)亲和层析，例如，用靶分子或用蛋白-A进行的亲和层析。
(3)转基因动物的免疫在另一方面，本发明提供了一种用于生产本发明单链抗体的方法，包括给本发明的转基因动物施用一种抗原。
由本发明的转基因动物生产的单链抗体包括多克隆和单克隆单链抗体及其片段。如果需要多克隆抗体，可以用来自收集的，并且按本发明方法处理过的免疫动物的抗原和血清免疫所述转基因动物(例如，小鼠、兔、山羊、马等)。如果含有多克隆抗体的血清含有针对其他抗原的抗体的话，可以通过免疫亲和层析和本领域技术人员所熟知的类似技术，纯化感兴趣的多克隆抗体。用于纯化和加工多克隆抗血清的技术同样为本领域所公知。
本发明单链抗体的用途本发明的单链抗体，包括其片段可用于体内治疗和预防用途，用于体外和体内诊断用途，用于体外测定和试剂用途等。
本发明单链抗体的治疗和预防用途包括给诸如人的受体哺乳动物施用上述抗体。
与骆驼VHH单链抗体分子相比，在人治疗方面‘骆驼化VH单链重链抗体’具有若干优点。例如，骆驼化VH单链抗体在基于VH3基因家族的抗体的情况下具有蛋白A结合位点。另外，在给人施用时，骆驼化VH单链抗体预期具有比骆驼VH单链抗体低的免疫原性。
还应当理解的是，与常规双链抗体相比，‘骆驼化VH单重链抗体’和‘骆驼VHH单重链抗体’具有某些不同的物理特征。例如，由于缺少功能性CH1重链结构域，本发明的抗体不能结合与补体的典型途径的激活相关的补体分子C1q。
基本上纯的单链抗体，包括其至少为90-95％均质的片段优选用于给哺乳动物施用，98-99％或更高的均质性最优选用于药物学用途，特别是当所述哺乳动物是人时。一旦根据需要进行了部分或纯化至均质，即可将本文所披露的单链抗体用于诊断或治疗(包括身体外的治疗)，或用于开发和实施采用本领域技术人员所公知的程序的测定方法。
本发明的选定的单链抗体通常可用于预防、抑制或治疗炎症状态，变应性过敏，癌症，细菌或病毒感染，以及自身免疫疾病(包括，但不局限于I型糖尿病，多发性硬化，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，克隆氏病和重症肌无力)，以及用于预防移植排斥。例如，消除调节性T细胞或干扰募集可导致增强了的免疫应答，这可能特别适用于治疗可能逃脱正常免疫应答的感染。
另外，选定的单链抗体，包括其片段可用于在它们在脊椎动物中正常不定位的区域调节免疫应答。例如，可以使用本领域技术人员所公知的技术将本文所披露的一种或多种抗体用于输注、注射到脊椎动物组织中。本文所披露的抗体在所述异位环境中的存在可被用于例如，在移植排斥期间调节免疫应答等。
在本申请中，术语“预防”包括在诱导疾病之前施用所述预防性组合物。“阻遏”表示在诱导事件之后，但是在所述疾病的临床出现之前施用所述组合物。“治疗”包括在疾病症状开始表现之后施用所述预防性组合物。
可以获得动物模型系统，该系统可用于筛选本发明的选定抗体在预防或治疗疾病方面的效果。用于检测易感的小鼠系统性红斑狼疮(SLE)的方法为本领域所公知(Knight等(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等(1978)New Eng.J.Med.，299515)。通过用来自另一种物种的可溶性AchR蛋白诱导所述疾病，在SJL/J雌性小鼠中检测重症肌无力(MG)(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42233)。关节炎是通过注射II型胶原在小鼠的易感株中诱导的(Stuart等(1984)Ann.Rev.Immunol.，42233)。业已披露了通过注射分支杆菌热激蛋白在易感大鼠体内诱导佐剂关节炎的模型(VanEden等(1988)Nature，331171)。通过按公开方法施用甲状腺球蛋白，在小鼠体内诱导甲状腺炎(Maron等(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)在某些小鼠株中可以天然存在或可以诱导，如通过Kanasawa等(1984)Diabetologia，27113所披露的方法诱导。小鼠和大鼠体内的EAE被用作人MS的模型。在该模型中，通过施用髓鞘碱性蛋白诱导了脱髓鞘疾病(参见Paterson(1986)Textbook of Immunopathology，Mischer等，eds.，Grune和Stratton，New York，pp.179-213；McFarlin等(1973)Science，179478和Satoh等(1987)J.Immunol.，138179)。
一般，本发明的选定的单链抗体是以纯化形式与药理学合适的载体一起使用的。通常，所述载体包括水溶液或醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和/或缓冲培养基的任何溶液。肠胃外载体包括氯化钠溶液，Ringer′s右旋糖，右旋糖和氯化钠以及乳酸化Ringer′s。如果必须在悬浮液中保持多肽复合物，合适的、生理学上可以接受的佐剂可以从增稠剂中选择，如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，凝胶和藻酸盐。
静脉内载体包括液体和营养添加剂和电解质添加剂，如基于Ringer′s右旋糖的添加剂。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的选定的单链抗体，包括其片段可以被用作单独施用的组合物使用或与其他制剂组合使用。其中可以包括各种免疫治疗药物，如环孢菌素、氨甲蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性或其他试剂与选定抗体，或本发明的T细胞或甚至是本发明选定抗体的组合的“鸡尾酒”。
本发明药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员所公知的任何途径。对于治疗来说，包括，但不局限于免疫治疗，可以按照标准技术给任何患者施用本发明的选定抗体、受体或其结合蛋白。所述施用可以是任何合适的方式，包括肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、经肺途径，或者还可以通过用导管直接输注。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状况，同时施用的其他药物，禁忌症和医生考虑的其他参数。
具体地讲，本发明的单链抗体和/或其片段和/或组合物特别适合用作抗病毒和/或抗细菌药物外部使用，例如，以霜剂形式用于皮肤，用于阴道等。另外，本发明的抗体片段和组合物还可用于治疗设备，如用于经常会出现偶然机会性感染的场所。例如，抗体、其片段和组合物特别适用于医院环境，特别是密集的护理单位。另外，本发明的抗体、其片段和组合物可用于治疗人工或天然组织的移植物质。例如，支架或受CMV或其他病毒感染的骨髓。
本发明的抗体、其片段和组合物还可用于内部使用，用来治疗多种疾病，如脑膜炎，和用于治疗抗细菌毒素。另外，抗体、其片段和组合物可用于治疗多种疾病和/或炎症，诸如类风湿关节炎。
本发明的选定的抗体可以冷冻干燥以便保存，并且，在使用之前在合适的载体中重配。可以采用已知的冷冻干燥和重配技术。本领域技术人员可以理解的是，冷冻干燥和重配可以导致不同程度的功能活性丧失，并且，必须将用量上调以便进行补偿。
另外，本发明的抗体可用于诊断目的。例如，本文所披露的抗体可以用在疾病状态下特异性表达的抗原制备或产生，或者在特定疾病状态期间其水平发生改变。
对于诸如诊断或示踪目的的某些用途来说，可以添加标记物。合适的标记物包括，但不局限于下列任意一种放射性标记，NMR自己旋标记和荧光标记。用于检测标记的方法为本领域技术人员所熟知。
合适的放射性标记的例子包括锝99m(99mTc)或碘-123(123I)。诸如碘-123，碘-313，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，镓，锰或铁的标记物，使得这些标记物可以通过NMR进行检测。诸如11C甲硫氨酸和FDG的标记物适用于正电子发射体层摄影术的技术。使用PET的方法和方案的说明为本领域技术人员所熟知。
合适的荧光团是GFP或其突变体。GFP及其突变体可以按照本领域众所周知的方法通过作为融合多肽表达与本发明的抗体或靶分子一起合成。例如，转录单位可以作为所需要的GFP或免疫球蛋白或靶分子的框内融合体形式构建，并且通过常规PCR克隆和连接技术插入上述载体。
本发明的抗体可以用能够产生信号的任何试剂标记。所述信号可以是任何可检测的信号，如诱导可检测基因产物的表达。可检测基因产物的例子包括生物发光多肽，如荧光素酶和GFP，可以通过特殊测定检测的多肽，如β-半乳糖苷酶和CAT，以及调节宿主细胞生长特征的多肽，如代谢所需要的酶，如HIS3，或抗生素抗性基因，如G418。
为了进行预防和/或治疗性治疗，可以施用含有本发明的选定抗体的组合物或它的混合物。在某些治疗用途中，可以在选定细胞群中获得至少部分抑制、阻遏、调节、杀灭、或某些其他可测定参数的合适用量，被定义为“治疗有效剂量”。为了达到上述剂量所需要的量取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，不过一般为0.00005-5.0mg选定的单链抗体/kg体重，更常用的剂量为0.0005-2.0mg/kg/剂。对于预防性用途来说，还可以以类似的或略低一些的剂量施用含有本发明的选定多肽的组合物或其混合物。
含有一种或多种本发明的选定抗体的组合物可用于预防性和治疗性设置，以便有助于改变、灭活、杀灭或除去哺乳动物中的选定靶细胞群。另外，还可将本文所披露的多肽的选定组成成分用于在体外选择性地杀灭、消除或有效除去异质细胞收集物中的靶细胞群。可以在体外将来自哺乳动物的血液与选定的抗体、细胞表面受体或其结合蛋白混合，以便杀灭或除去所述血液中的不需要的细胞，以便按照标准技术送回到所述哺乳动物中。
在另一方面，本发明提供了将本文所披露的单重链抗体用作细胞内结合试剂的用途。
本发明的抗体可以在任何细胞类型中表达，并且可以结合并且影响任何细胞内成分的功能。例如，细胞内成分可以是细胞骨骼成分，参与基因表达和/或表达调节的分子，参与细胞成分功能调节的酶或分子。本领域技术人员可以理解的是，以上所列举的并非是穷举性的。例如，当所述成分是酶抑制剂时，本发明的抗体可以增强或减弱所述酶的活性。酶的活性位点通常位于蛋白表面上最大的沟槽中。所述位点对于常规抗体来说，通常是没有免疫原性的(Novotny等，(1986)Proc.Nat.Acad USA，83，226)。本发明单链抗体的长的H3环深深地穿透至酶的活性位点，使得它们起着有效酶抑制剂的作用。
另外，可以给本发明的抗体附加其他功能，如转运肽和/或提供一种酶活性的功能性成分，例如激酶，蛋白酶，磷酸酶，脱乙酰酶，乙酰酶，遍在化酶，sumolation酶，甲基化酶等。另外，可以将其他抗体连接在本发明的单链抗体或其片段上。本领域技术人员可以理解的是，以上所列举的并非是穷举性的。
另外，抗体或其片段可以作为纯化试剂使用，通过将单链抗体或其片段连接在其他表面上，可以纯化其他表面上的抗原(即亲和纯化)。
另外，本发明的抗体或其片段可用作诊断工具。例如，可将其用于检测存在于血液中的肿瘤特异性蛋白，从而可以早期检测肿瘤特异性蛋白。另外，本发明的抗体或其片段能够以阵列形式用于诊断目的，从而有效地同时检测抗体及其片段和配体之间的多种分子相互作用。
在上面的说明书中所提到的所有文献都被收作本文参考。在不超出本发明范围和构思的前提下，本发明所披露的各种方法和系统的各种改进，对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管业已结合具体优选实施方案对本发明进行了说明，应当理解的是，要求保护的发明不应当被过度局限于所述具体实施方案。实际上，对所披露的用于实施本发明的方案的各种改进对于生物化学、分子生物学和生物技术或相关领域的技术人员来说是显而易见的，这些改进被认为属于以下权利要求书的范围。
权利要求
1.一种用于在哺乳动物中生产VHH单重链抗体的方法，包括在所述哺乳动物中表达异源VHH重链基因座的步骤。
2.如权利要求1的方法，其中，所述VHH重链基因座包括(a)至少一个各自包括一个VHH外显子的VHH区，至少一个各自包括一个D外显子的D区，和至少一个各自包括一个J外显子的J区，其中，所述VHH区，D区和J区能够重组形成VDJ编码序列，(b)包括至少一个Cγ恒定重链基因和至少一个Cμ恒定重链基因的恒定重链区，并且当它表达时，既不表达功能性CH1结构域，也不表达功能性CH4结构域，并且，当所述基因座表达时，能够形成完整的单重链IgG分子(scIgG)。
3.一种在哺乳动物中生产骆驼化VH单重链抗体的方法，包括在所述哺乳动物中表达骆驼化VH重链基因座的步骤。
4.如权利要求3的方法，其中，所述骆驼化VH重链基因座包括(a)至少一个各自包括一个VH外显子的VH区，该VH外显子是突变的，以便其核酸序列与骆驼VHH外显子(‘骆驼化VH外显子’)相同，至少一个各自包括一个D外显子的D区，和至少一个包括一个J外显子的J区，其中，所述VH区，D区和J区能够重组形成VDJ编码序列，和(b)包括至少一个Cγ恒定重链基因和至少一个Cμ恒定重链基因的恒定重链区，并且当它表达时，既不表达功能性CH1结构域，也不表达功能性CH4结构域，并且，当所述基因座表达时，能够形成完整的单重链IgG分子(scIgG)。
5.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述基因座包括一个或多个FRT位点。
6.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述基因座包括两个或两个以上LoxP位点。
7.如权利要求1、2、5和6的方法，其中，所述VHH重链基因座包括至少一个来源于人的D区和至少一个来源于人的J区。
8.如权利要求3或4、5和6的方法，其中，所述骆驼化VH重链基因座包括至少一个来源于人的D区和至少一个来源于人的J区。
9.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述恒定重链区包括至少一个来源于骆驼的恒定重链基因。
10.如权利要求1-8中任意一项的方法，其中，所述恒定重链区包括至少一个非骆驼来源的恒定区重链基因。
11.如权利要求10的方法，其中，至少一个恒定区重链基因来源于人。
12.如权利要求11的方法，其中，至少一个恒定区重链基因来源于兔。
13.如权利要求12的方法，其中，至少一个恒定区重链基因来源于小鼠。
14.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述重链基因座还包括使所述基因座能够装盒的一个或多个盒位点。
15.如权利要求14的方法，其中，所述一个或多个盒位点位于所述重链基因座中，位于该基因座的5’前导序列中。
16.如权利要求15的方法，其中，所述一个或多个盒位点位于所述重链基因座中，位于该基因座的3’非翻译区中。
17.通过权利要求1、2和5-16中任意一项的方法可获得的VHH单重链抗体，其中，由VHH外显子编码的抗体部分是由来源于骆驼的外显子编码的，而所述抗体分子的其余部分是由一个或多个来源于人的区域编码的。
18.通过权利要求1、2和5-16中任意一项的方法可获得的VHH单重链抗体，其中，由VHH外显子编码的抗体部分是由来源于骆驼的外显子编码的，而恒定重链区是由一个或多个来源于兔的区域编码的。
19.通过权利要求1、2和5-16中任意一项的方法可获得的VHH单重链抗体，其中，由VHH外显子编码的抗体部分是由来源于骆驼的外显子编码的，而恒定重链区是由一个或多个来源于小鼠的区域编码的。
20.一种用权利要求3，4和5-16中任意一项的方法可获得的骆驼化VH单重链抗体。
21.如权利要求20的骆驼化VH单重链抗体，其中，整个抗体是由一个或多个来源于人的区域编码的。
22.如权利要求20的骆驼化VH单重链抗体，其中，编码恒定重链区的所述抗体部分是由一个或多个来源于兔的区域编码的。
23.如权利要求20的骆驼化VH单重链抗体，其中，编码恒定重链区的所述抗体部分是由一个或多个来源于小鼠的区域编码的。
24.如权利要求20-23中任意一项的骆驼化VH单重链抗体，它是单克隆抗体。
25.一种载体，包括权利要求1，2和5-16中任意一项所述的VHH重链基因座。
26.一种载体，包括权利要求3，4和5-16中任意一项所述的骆驼化VH重链基因座。
27.一种用权利要求25和26中任意一项的载体转化过的宿主细胞。
28.一种表达如权利要求2和5-16中任意一项所述的异源VHH重链基因座的转基因哺乳动物。
29.一种表达如权利要求4和5-16中任意一项所述的骆驼化VH重链基因座的转基因哺乳动物。
30.如权利要求28或29的转基因哺乳动物，它是小鼠。
31.一种通过用一种抗原免疫权利要求28-30中任意一项的转基因哺乳动物而生产单链抗体的方法。
32.权利要求17-24中任意一项的单重链抗体在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种在哺乳动物中生产单链免疫球蛋白的方法。具体地讲，本发明涉及一种用于在哺乳动物中生产单链骆驼VHH抗体的方法，它会经历出现在抗体生产B细胞内的类转换和亲和力成熟的过程。还披露了用本发明方法制备的单链抗体及其用途。
文档编号A61P1/04GK1518559SQ02812599
公开日2004年8月4日 申请日期2002年4月24日 优先权日2001年4月24日
发明者F·格罗斯维尔德, F 格罗斯维尔德 申请人:鹿特丹伊拉兹马斯大学