专利名称：二异丙氧基磷酰化二肽甲酯及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及二异丙氧基磷酰化二肽甲酯及其制备方法和应用，特别是涉及二异丙氧基磷酰化二肽甲酯及其制备方法和以其为活性成分的药物。
背景技术：
细胞凋亡，也叫程序性细胞死亡，是由发育生物学家Lockshin和Williams在1965年首先提出的，它是指多细胞有机体为调控有机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。作为一种生理性细胞消亡方式，凋亡普遍存在于生物界。癌症的发生发展与细胞凋亡失衡有密切关系，它不仅是细胞增殖失控和细胞分化异常的结果，同时也与肿瘤细胞凋亡失衡有关，已有证据表明细胞凋亡受阻可能是癌症发病机制之一。随着凋亡研究的逐步深入，人们发现目前使用的化疗药物除了通过作用于核酸、微管蛋白和其他靶点来杀伤肿瘤细胞外，也可以通过诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞，特异性地诱导肿瘤细胞凋亡可能是癌症治疗中最具有广阔前景的尝试。近年来，肿瘤细胞凋亡诱导剂已成为癌症研究领域的热点，有报道二肽甲酯类化合物可以诱导人类U937细胞、HL60，THP-1脊髓瘤等细胞系的凋亡，但机理尚不十分明确。
磷酰基是一种具有较高生物活性的基团，在肽类原有的结构上引入磷酰基可能会出现新的生物活性或者是使原有的生物活性提高。N-磷酰肽具有重要的生物活性和药用价值。但是到目前为止，尚没有关于其能够抑制癌症细胞增殖的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的肿瘤细胞凋亡诱导剂二异丙氧基磷酰化二肽甲酯。
本发明所提供的二异丙氧基磷酰化二肽甲酯由通式(I)所示的结构单元构成。
其中aa1，aa2既可为L-氨基酸，也可为D-氨基酸。
例如，当aa1为L-Val，aa2为L-Phe，本发明化合物的结构式为
本发明的第二个目的是提供一种合成二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物的方法。
一种制备二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物的方法，是将二异丙基亚磷酸酯(DIPPH)-氨基酸和氨基酸甲酯盐酸盐反应生成二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物。
所述二异丙基亚磷酸酯-氨基酸和氨基酸甲酯盐酸盐的反应步骤是向4mmol L-氨基酸甲酯盐酸盐、4mmol NMM和10ml四氢呋喃的混合物中加入4.2mmol N-磷酰氨基酸和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC与5ml四氢呋喃的混合溶液，反应后过滤，残余物用THF洗涤，除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤，干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，残余物用硅胶柱层析或重结晶方法纯化，得到所需产物。具体说是在50ml烧瓶中加入4mmol L-氨基酸甲酯盐酸盐、4mmol NMM和10ml干燥的四氢呋喃，搅拌下加入4.2mmol N-磷酰氨基酸和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC与5ml干燥的四氢呋喃的混合溶液，室温反应过夜后过滤，残余物用THF洗涤三次，合并滤液和洗液，旋蒸除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，充分搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤三次，无水Na2SO4干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，残余物用硅胶柱层析或重结晶方法纯化，得到所需产物。
所述二异丙基亚磷酸酯-氨基酸的合成包括以下步骤1)酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯；2)合成二异丙基亚磷酸酯-氨基酸。
其中所述酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯是向230ml异丙醇及100ml CCl4混合液中滴加87ml PCl3，反应后调pH至6～7，分液，萃取水相，合并有机相，收集80℃/10mmHg馏分。具体的说是在1000ml三颈瓶中加入3mol异丙醇(230ml)及100mlCCl4，装上回流冷凝管和配有干燥管的气体吸收装置，室温下不断搅拌，中速滴加1molPCl3(87ml)，约需1小时，加入过程中自动放热使CCl4回流，继续反应30分钟。用饱和NaHCO3溶液调节pH至6～7，分液，用100ml CCl4萃取水相，合并有机相，无水MgSO4干燥，旋去低沸物，减压蒸馏，收集80℃/10mmHg馏分。所述合成二异丙基亚磷酸酯-氨基酸是将10mmol二异丙基亚磷酸酯与5ml CCl4的混合液滴入由10mmol氨基酸、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺组成的混合液中，反应后除去有机溶剂，加入10ml水，用有机溶剂洗涤，弃去有机相，将水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，除去有机溶剂，得到产品，具体步骤的说是在冰盐浴及搅拌下，将10mmol DIPPH与5ml CCl4的混合液滴入由10mmol氨基酸、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺组成的混合液中，约10分钟滴完，继续于冰浴下搅拌反应30分钟，室温下反应20分钟，在35℃旋蒸除去有机溶剂，然后加入10ml水，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯各洗涤两次，弃去有机相。冰盐浴下用1N HCl将水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸镁干燥，于35℃旋蒸除去有机溶剂，再用油泵抽干得到产品。若产品不纯，固体可用乙酸乙酯～石油醚(30～60℃)重结晶，油状液体可用柱层析纯化。
所述氨基酸甲酯盐酸盐的合成方法有两种，一种是50mmol氨基酸和50ml甲醇，搅拌下通入HCl气体直至固体全部溶解，反应后减压浓缩至干，残余物用甲醇-乙醚重结晶，得到产品。另一种是向-10℃的50ml甲醇中滴加二氯亚砜13ml，搅拌加入50mmol L-氨基酸，室温下搅拌反应，减压旋蒸至干，残余物用甲醇-乙醚重结晶，得到产品。这两种方法具体的说，第一种为在100ml烧瓶中加入50mmol L-氨基酸和50ml干燥甲醇，搅拌下通入干燥HCl气体直至固体全部溶解，室温放置过夜。减压浓缩至干，再加入适量甲醇，反复浓缩三次以除去HCl，残余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重结晶，得到产品；第二种为在100ml烧瓶中加入干燥甲醇50ml，冰盐浴冷却至-10℃，滴加二氯亚砜13ml。滴加过程中维持温度在0℃以下，继续搅拌10分钟，加入50mmol L-氨基酸。半小时后撤去冰浴，室温下搅拌反应，用TLC(硅胶GF254，展开剂叔丁醇∶乙醇∶25％氨水∶水＝5∶6∶1∶3)跟踪监测，直至原料点消失。减压旋蒸至干，再加入适量甲醇，反复浓缩三次以除去HCl，残余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重结晶，得到产品。
本发明的第三个目的是提供一种治疗癌症的药物。
本发明提供的治疗癌症的药物，其活性成分是二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明药物的用量一般为20-50mg/kg体重。
二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，达到抑制肿瘤细胞增殖，治疗癌症的目的。实验表明，二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物具有细胞增殖抑制活性，例如，(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3、DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3、DIPP-L-Leu-L-Phe-OCH3、DIPP-L-Ile-L-Phe-OCH3、DIPP-L-Phe-L-Leu-OCH3、(DIPP-L-Phe)2-L-Lys-OCH3、DIPP-L-Phe-L-Phe-OCH3作用24小时后，对K562细胞系增殖抑制活性的半数有效浓度(IC50)分别为16.2μg/ml、34.68μg/ml、43.54μg/ml、43.77μg/ml、71.40μg/ml、32.69μg/ml以及73.02μg/ml。本发明从形态学和生物化学两个方面研究二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物对K562细胞凋亡的影响。利用Hoechst33258染色荧光显微镜下观察到二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物作用后的K562细胞呈现出典型的凋亡形态学特征；其总DNA在琼脂糖凝胶电泳显示出明显的“梯状”条带；Annexin v-FITC和PI双染利用流式细胞仪检测到早期的凋亡细胞。证实二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物具有诱导K562细胞凋亡的活性。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的作用浓度与K562细胞增殖抑制率关系曲线。
图2为荧光显微镜下(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用后的K562细胞核。
图3为(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3诱导的K562细胞DNA在核小体间断裂的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为PI单染检测K562细胞早期凋亡。
图5为AnnexinV-FITC和PI双染检测K562细胞早期凋亡。
具体实施例方式
实施例1、(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的合成1.酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯(DIPPH)1000ml三颈瓶中加入3mol异丙醇(230ml)及100ml CCl4，装上回流冷凝管和配有干燥管的气体吸收装置，室温下不断搅拌，中速滴加1mol PCl3(87ml)，约需1小时，加入过程中自动放热使CCl4回流，继续反应30分钟。用饱和NaHCO3溶液调节pH至6～7，分液，用100ml CCl4萃取水相，合并有机相，无水MgSO4干燥，旋去低沸物，减压蒸馏，收集80℃/10mmHg馏分。
产率72％。
结构鉴定31P NMR(ppm)4.9(s)。
1H-NMRδ1.3～1.6(d，12H，OCH3×4)，4.5～5.2(m，2H，OCH×2)，6.9(d，1H，PH)ppmESI-MS(m/z)167[M+H]+证明所得结果正确。
2.DIPP-L-Leu的合成在冰盐浴及搅拌下，将10mmol DIPPH与5ml CCl4的混合液滴入由10mmol L-Leu、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺组成的混合液中，约10分钟滴完，继续于冰浴下搅拌反应30分钟，室温下反应20分钟，在35℃旋蒸除去有机溶剂，然后加入10ml水，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯各洗涤两次，弃去有机相。冰盐浴下用稀HCl将水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸镁干燥，于35℃旋蒸除去有机溶剂，再用油泵抽干得到产品。
产率85％结构鉴定31P NMR(ppm)4.9(s)ESI-MS(m/z)167[M+H]+证明所得结果正确。
3.L-Lys-OCH3的合成在100ml烧瓶中加入干燥甲醇50ml，冰盐浴冷却至-10℃，滴加二氯亚砜13ml。滴加过程中维持温度在0℃以下，继续搅拌10分钟，加入50mmol L-Lys。半小时后撤去冰浴，室温下搅拌反应，用TLC(硅胶GF254，展开剂叔丁醇∶乙醇∶25％氨水∶水＝5∶6∶1∶3)跟踪监测，直至原料点消失。减压旋蒸至干，再加入适量甲醇，反复浓缩三次以除去HCl，残余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重结晶，得到产品。
产率79％结构鉴定ESI-MS(m/z)161.2[M+H]+证明所得结果正确。
4.(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的合成在50ml烧瓶中加入4mmol L-Lys-OCH3、8mmol NMM和10ml干燥的四氢呋喃，搅拌下加入8.4mmol DIPP-Leu和8.4mmol HOBt，冰水浴下滴加8.4mmol DCC与10ml干燥的四氢呋喃的混合溶液，室温反应过夜后过滤，残余物用THF洗涤三次，合并滤液和洗液，旋蒸除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，充分搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤三次，无水Na2SO4干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，用硅胶柱层析得到产品。
产率67％结构鉴定31P NMR(CHCl3)6.55ppm1H NMR(CDCl3)δ0.95(d，12H，Leucine CH3×4)，1.28(m，24H，i-propyl CH3×8)，1.40～1.95(m，10H，Lysine γ-CH2，δ-CH2，β-CH2，Leucine-CH2)，2.50(m，1H，Leucine γ-CH)，3.24(t，2H，Lysineε-CH2)，3.71(m，2H，Leucine α-CH×2)，3.73(s，3H，0CH3)，4.10(m，2H，Leucine NH×2)，4.57(m，5H，OCH×4and Lysine α-CH)，7.28(s，1H，Lysine ε-NH)，7.40(d，1H，Lysine α-NH)ppmESI-MS(m/z)715.6[M+H]+证明所得结果正确。
(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3的合成路线如下式所示
实施例2、(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3诱导细胞凋亡的活性研究1.细胞增殖抑制活性IC50K562细胞经不同浓度的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用24小时后，细胞增殖受到影响，从表1和图1中可以看出，细胞增殖抑制活性的半数有效浓度(IC50)为16.2μg/ml。
表1、(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对K562细胞的增殖抑制率(IR)
1μg/ml5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml40μg/ml 80μg/mlIR％ 15.76 21.15 33.34 58.79 66.47 72.36注阳性对照顺铂在50μg/ml作用浓度时对K562细胞的体外增殖抑制率为75.54％实施例3、Hoechst33258染色检测(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对细胞核的影响取指数生长期的K562细胞，以2×105个/ml的密度接种于6孔板中，3ml/well，于37℃，5％C02的培养箱中培养4小时后加入样品溶液，设10μg/ml和40μg/ml两个浓度(孔中甲醇终浓度为1％)，同时设阴性对照(仅含1％的甲醇)和阳性对照(50μg/ml的顺铂)。继续培养24小时，2000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，用PBS洗一次。加入0.5％KCl溶液500μl，室温静置15分钟，使细胞溶胀，胞膜通透性增强，有利于染料渗入。离心除去上清，向沉淀的细胞中加入固定液100μl，4℃固定10分钟。将细胞打匀，约20μl滴于载玻片上，待固定液挥发干后，加一滴5μg/ml的Hoechst33258染料，盖上盖玻片，将荧光显微镜的激发光调至紫外光，观察并照相(20×10)。
如图2所示，K562细胞在10μg/ml的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3处理24小时后，部分细胞核变小、皱缩，可见致密强荧光，反映了凋亡早期染色质的变化情况(C)；当(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3浓度为40μg/ml时，部分细胞核荧光呈颗粒状(D)，与阳性对照相一致(B)；而阴性对照细胞核所发荧光较弱且均匀(A)。
实施例4、琼脂糖凝胶电泳检测(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对DNA降解的影响取指数生长期的K562细胞，以2×105个/ml的密度接种于6孔板中，3ml/well，于37℃，5％CO2的培养箱中培养4小时后加入样品溶液，设1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml和40μg/ml四个浓度(孔中甲醇终浓度为1％)，同时设阴性对照(仅含1％的甲醇)和阳性对照(50μg/ml的顺铂)。继续培养24小时，2000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，用PBS洗一次。向各组细胞沉淀中加200μl细胞裂解液，37℃反应过夜，以裂解细胞蛋白。
次日，加入高浓度的NaCl溶液，使之终浓度为1.5mol/L，-20℃放置2个小时后，12000rpm，4℃，离心30分钟除去蛋白质。向上清中加入无水乙醇至终浓度为75％，-20℃放置2个小时使DNA沉淀析出。12000rpm，4℃，离心30分钟，所得沉淀即为总DNA，在通风橱内将乙醇溶液挥干。向DNA沉淀中加入TE缓冲液使之溶解，再加入1mg/ml RNA酶(使其终浓度为200μg/ml)，37℃反应2小时以除去RNA。
向上述DNA溶液中加入上样缓冲液，混匀，取15μl加到2％琼脂糖凝胶上样孔中，于1×TBE缓冲液中，恒压70V，电泳3小时。用5μg/mlEB染色10分钟，在紫外透射反射仪下检测，并利用电泳凝胶自动成像系统拍照。
结果如图3所示，其中A为100bpDNA分子量标准，B为未处理的K562细胞，C为阳性对照(50μg/ml的顺铂)，D-G分别为经1，5，20，40μg/ml的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3处理24h的K562细胞。结果表明，K562细胞经不同浓度的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用24小时后，其DNA琼脂糖凝胶电泳图谱显示出细胞凋亡时典型的“梯状”条带，并且随着作用浓度的增加，梯状条带越明显。进一步证明了(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3具有诱导K562细胞凋亡的活性。
实施例5、流式细胞仪碘化丙啶单染法检测(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对细胞周期的影响取对数生长期的K562细胞，以2×105个/ml的密度接种于12孔板，1ml/well，于37℃，5％CO2的培养箱中培养4小时后加入样品溶液，设1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml六个浓度(孔中甲醇终浓度为1％)，同时设阴性对照(仅含1％的甲醇)和阳性对照(50μg/ml的顺铂)。继续培养24小时，2000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，用PBS洗一次，70％的乙醇固定过夜，加入200μl 1mg/ml的RNA酶A，37℃反应2小时以除去RNA。5000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，加入200μl5mg/ml PI染色液，4℃，避光染色30min，加400μl PBS稀释后，利用流式细胞仪测定细胞内DNA分布情况，单光束，激发波长为488nm。
未处理的细胞经碘化丙啶染色后在流式细胞仪直方图上的2倍体峰、4倍体峰以及介于2倍体和4倍体之间的区段，分别代表处于细胞周期的G0/G1期、G2/M期和S期；当细胞发生凋亡时，在流式细胞仪上会出现一群DNA含量少于2倍体的细胞，在流式细胞仪直方图2倍体峰之前，形成亚二倍体峰，称为SubG0期细胞。图4表明，K562细胞经不同浓度的(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用24小时后，流式细胞仪直方图上出现亚二倍体峰，并且随着作用浓度的升高，相应的亚二倍体峰也逐渐升高。
实施例5、流式细胞仪异硫氰酸荧光素标记的连接素(AnnexinV-FITC)和碘化丙碇(PI)双染检测(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3对细胞膜的影响取对数生长期的K562细胞，以2×105个/ml的密度接种于12孔板，1ml/well，于37℃，5％CO2的培养箱中培养4小时后加入样品溶液，设10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml四个浓度(孔中甲醇终浓度为1％)，同时设阴性对照(仅含1％的甲醇)和阳性对照(50μg/ml的顺铂)。继续培养24小时，2000rpm，4℃，离心5分钟收集细胞，用1×binding buffer清洗细胞一次。将细胞重新悬浮于200μl的binding buffer中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，室温下避光反应5～15分钟，利用流式细胞仪进行分析，单光束，激发波长为488nm。
正常细胞磷脂在胞膜内外表面之间呈不对称分布，凋亡早期时，细胞膜内表面的PS外翻至细胞膜外表面，在Ca2+存在时与外环境中的AnnexinV-FITC结合发出绿色荧光，并且由于此时细胞仍维持其膜的完整性，使变性染色质着色的荧光染料PI不能进入细胞；坏死或凋亡晚期继发性坏死的细胞由于细胞膜已经失去其完整性同时能够AnnexinV-FITC和PI结合；机械性损伤的细胞只能与PI结合，这样在流式细胞仪直方图上就会出现四个细胞群体，分别用E1、E2、E3、E4区代表。在图5中A为阴性对照(1％的甲醇)；B为阳性对照(50μg/ml的顺铂)；C为10μg/ml(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3；D为20μg/ml(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3；E为40μg/ml(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3；F为80μg/ml(DIPP-L-Leu)x-L-Lys-OCH3E1区代表机械性损伤的细胞；E2区代表坏死细胞或晚期凋亡继发性坏死细胞；E3区代表正常活细胞；E4代表早期凋亡细胞。结果表明，(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3作用后的K562细胞在流式细胞仪上可以检测到早期的凋亡细胞(E4区)。从而有力地证明了(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3具有诱导K562细胞凋亡的作用。
综合以上实验结果，无论是从形态学还是从生物化学角度的检测方法，都证实了(DIPP-Leu)2-Lys-OCH3具有诱导K562细胞凋亡的活性。可以用于抑制癌症细胞增殖，治疗癌症。
实施例6，DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3的合成及细胞凋亡活性研究DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3的合成路线为
具体合成步骤如下所述1.酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯(DIPPH)1000ml三颈瓶中加入3mol异丙醇(230ml)及100ml CCl4，装上回流冷凝管和配有干燥管的气体吸收装置，室温下不断搅拌，中速滴加1mol PCl3(87ml)，约需1小时，加入过程中自动放热使CCl4回流，继续反应30分钟。用饱和NaHCO3溶液调节pH至6～7，分液，用100ml CCl4萃取水相，合并有机相，无水MgSO4干燥，旋去低沸物，减压蒸馏，收集80℃/10mmHg馏分。
产率72％。
结构鉴定31P NMR(ppm)4.9(s)。
1H-NMRδ1.3～1.6(d，12H，OCH3×4)，4.5～5.2(m，2H，OCH×2)，6.9(d，1H，PH)ppmESI-MS(m/z)167[M+H]+证明所得结果正确。
2.DIPP-L-Val的合成在冰盐浴及搅拌下，将10mmol DIPPH与5ml CCl4的混合液滴入由10mmol L-Val、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺组成的混合液中，约10分钟滴完，继续于冰浴下搅拌反应30分钟，室温下反应20分钟，在35℃旋蒸除去有机溶剂，然后加入10ml水，用石油醚、乙醚、乙酸乙酯各洗涤两次，弃去有机相。冰盐浴下用稀HCl将水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸镁干燥，于35℃旋蒸除去有机溶剂，再用油泵抽干得到产品。
产率88％结构鉴定31P NMR(ppm)7.7(s)ESI-MS(m/z)282.2[M+H]+证明所得结果正确。
3.L-Phe-OCH3的合成在100ml烧瓶中加入干燥甲醇50ml，冰盐浴冷却至-10℃，滴加二氯亚砜13ml。滴加过程中维持温度在0℃以下，继续搅拌10分钟，加入50mmol L-Phe。半小时后撤去冰浴，室温下搅拌反应，用TLC(硅胶GF254，展开剂叔丁醇∶乙醇∶25％氨水∶水＝5∶6∶1∶3)跟踪监测，直至原料点消失。减压旋蒸至干，再加入适量甲醇，反复浓缩三次以除去HCl，残余物用甲醇～乙醚(30～60℃)重结晶，得到产品。
产率85％
结构鉴定ESI-MS(m/z)180.3[M+H]+证明所得结果正确。
4.DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3的合成在50ml烧瓶中加入4mmol L-Phe-OCH3、4mmol NMM和10ml干燥的四氢呋喃，搅拌下加入4.2mmol DIPP-Val和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC与10ml干燥的四氢呋喃的混合溶液，室温反应过夜后过滤，残余物用THF洗涤三次，合并滤液和洗液，旋蒸除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，充分搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤三次，无水Na2SO4干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，用硅胶柱层析得到产品。
产率75.7％结构鉴定31P NMR(CHCl3)6.68ppm1H NMR(CDCl3)δ0.74～0.94(d×d，6H，Valine CH3×2)，1.26(m，12H，i-PropylCH3×4)，2.16(m，1H，Valine β-CH)3.03～3.12(m，3H，Phenylalanine β-CH2and Valine α-CH)，3.52(d×t，1H，Phenylalanine α-CH)，3.68(s，3H，OCH3)，4.51～4.60(m，2H，OCH)，4.83～4.87(q，1H，Valine NH)，6.86～6.90(d，1H，Phenylalanine NH)，7.12～7.26(m，5H，Ph-H)ppmESI-MS(m/z)443.3[M+H]+证明所得结果正确。
DIPP-L-Val-L-Phe-OCH3对K562细胞增殖抑制活性的半数有效浓度(IC50)为34.68μg/ml。
权利要求
1.二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物，由通式(I)所示的结构单元构成，其中aa1、aa2为氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于结构单元中aa1，aa2为L-氨基酸。
3.一种制备权利要求1所述化合物的方法，是将二异丙基亚磷酸酯-氨基酸和氨基酸甲酯盐酸盐反应生成二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述二异丙基亚磷酸酯-氨基酸和氨基酸甲酯盐酸盐的反应步骤是向4mmol L-氨基酸甲酯盐酸盐、4mmol NMM和10ml四氢呋喃的混合物中加入4.2mmol N-磷酰氨基酸和4.2mmol HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol DCC与5ml四氢呋喃的混合溶液，反应后过滤，残余物用THF洗涤，除去溶剂，残余物加饱和NaHCO3溶液，搅拌后用氯仿萃取，合并萃取液依次用饱和NaHCO3溶液、10％柠檬酸、饱和NaCl溶液洗涤，干燥，过滤、洗涤、旋蒸除去氯仿，残余物用硅胶柱层析或重结晶方法纯化，得到所需产物。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的二异丙基亚磷酸酯-氨基酸的合成包括以下步骤1)酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯；2)合成二异丙基亚磷酸酯-氨基酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述酸碱中和法合成二异丙基亚磷酸酯的具体步骤是向230ml异丙醇及100ml CCl4混合液中滴加87ml PCl3，反应后调pH至6～7，分液，萃取水相，合并有机相，收集80℃/10mmHg馏分；所述合成二异丙基亚磷酸酯-氨基酸的具体步骤是将10mmol二异丙基亚磷酸酯与5ml CCl4的混合液滴入由10mmol氨基酸、5ml乙醇、10ml H2O及10ml三乙胺组成的混合液中，反应后除去有机溶剂，加入10ml水，用有机溶剂洗涤，弃去有机相，将水相酸化至pH＝3～4，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，除去有机溶剂，得到产品。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述氨基酸甲酯盐酸盐的合成方法是50mmol氨基酸和50ml甲醇，搅拌下通入HCl气体直至固体全部溶解，反应后减压浓缩至干，残余物用甲醇-乙醚重结晶，得到产品。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述氨基酸甲酯盐酸盐的合成方法是向-10℃的50ml甲醇中滴加二氯亚砜13ml，搅拌加入50mmol L-氨基酸，室温下搅拌反应，减压旋蒸至干，残余物用甲醇-乙醚重结晶，得到产品。
9.一种抗癌药物，其活性成分是二异丙氧基磷酰化二肽甲酯。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于所述药物中还含有人体可接受的药用载体。
全文摘要
本发明公开了二异丙氧基磷酰化二肽甲酯及其制备方法和以其为活性成分的药物。此种药物的活性成分是二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物，其结构单元为通式(I)的化合物。二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物的制备方法是将DIPP－L－氨基酸和L－氨基酸甲酯盐酸盐作用生成DIPP二肽甲酯。二异丙氧基磷酰化二肽甲酯类化合物的主要用途是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖，治疗癌症等作用。
文档编号A61P35/00GK1515586SQ0310017
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月8日 优先权日2003年1月8日
发明者蒋宇扬, 杜伟, 牛艳玲, 曹胜利, 赵玉芬 申请人:清华大学