专利名称：基因重组人溶菌酶针对冠状病毒sars在制药中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组人溶菌酶的新用途，特别是涉及制药领域中基因重组人溶菌酶在针对冠状病毒SARS的新用途。
背景技术：
抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。21世纪的今天，冠状病毒sars是一种RNA的变异病毒，具有极强的传染性，给人们的生活和工作都带来了很大的影响，目前还没有找到根治的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因重组人溶菌酶在针对冠状病毒SARS在制药中的新用途。
实际上，本发明涉及基因重组人溶菌酶作为制备预防和抑制冠状病毒SARS的制药中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将冻干粉2mg，溶于水中制得针剂即每瓶30000U/mg备用；制得气雾剂、滴剂每瓶5ml每ml10000U备用；制得粉剂2mg备用。
基因重组人溶菌酶药物体外预防、抑制冠状病毒的药效在HELA细胞培养内，采用病毒CPE法，观察不同浓度的重组人溶菌酶药物对冠状病毒的预防、抑制的效果。
实验例一、试验材料1.验证药物重组人溶菌酶 蛋白含量4.3845mg由长春奇龙生物技术研究所提供2.阳性对照药物注射用更昔洛韦批号020802由湖北科益药业股份有限公司提供。
3.细胞人宫颈癌传代细胞(HELA)由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒资源中心提供。
4.病毒冠状病毒04号分离株(SARS病人血清04号标本)由佑安医院提供。
5.CO2培养箱NUAIR US AUTO FLOW提供6.(XSZ-D2)由重庆光学仪器厂生产7.其它试剂、器材等均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒资源中心提供。二、试验方法预备试验1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性测定
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养2小时，加入验证药物，重组人溶菌酶倍比稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，阳性对照药物更昔洛韦稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，37℃5％CO2孵箱培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。2.在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的毒力的测定冠状病毒04号的分离(SARS病人血清分离)HELA细胞以每毫升40万浓度接种试管，37℃5％CO2培养24小时，弃掉培养液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃转鼓培养5小时后，加入维持液1ml，同时设正常细胞对照，33℃转鼓培养5～7天。细胞出现CPE变化后，采用PCR的方法检测冠状病毒，04号标本PCR阳性，确定为冠状病毒分离株。用终末稀释法纯化病毒2次，PCR检测冠状病毒仍为阳性，经免疫荧光测定双份SARS病人血清，IgM阳性，IgG4倍升高，确定为冠状病毒。采用病毒CPE法测定其效价。病毒CPE法HELA细胞以每毫升40万浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2培养24小时，加入病毒液，病毒稀释10-1～10-5，5个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，设正常细胞对照，37℃5％CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)以25％以下变化为“+”，26％～50％变化为“++”，5 1％～75％为“+++”，76％～100％变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID50。正式试验重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用试验目的观察不同浓度的重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用，试验采用病毒细胞(CPE)法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数TI，判断药效。
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入100 TCID50的冠状病毒液，置37℃5％CO2吸附2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即750μg/ml～1.46μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即6000μg/ml～1.46μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。重组人溶菌酶对冠状病毒04号的预防作用试验目的观察不同浓度的重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的预防作用，试验采用病毒细胞(CPE)法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数TI，判断药效。
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即750μg/ml～1.46μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释13个浓度即6000μg/ml～1.46μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小时后，加入100 TCID50的冠状病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。三、试验结果预备试验结果重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性作用由长春奇龙生物技术研究所提供的重组人溶菌酶和阳性对照药物注射用更昔洛韦在HELA细胞培养内，采用细胞形态变化(CPE)法。计算药物最大无毒浓度(TD0)和半数中毒浓度(TD50)，以下试验结果为三次试验结果的均值。1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性试验结果验证药物重组人溶菌酶最大无毒浓度(TD0)为750±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为1500±0μg/ml阳性对照药物注射用更昔洛韦最大无毒浓度(TD0)为＞6000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞6000±0μg/ml。2.在HELA细胞培养内对冠状病毒04号毒力测定结果(TCID50)冠状病毒04号半数感染量(TCID50)为10-3，见图1。正式试验结果，见图1。重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)验证药物重组人溶菌酶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为23.4±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8±0μg/ml，治疗指数(TI)为16。阳性对照药物注射用更昔洛韦CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0，最小有效浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的预防作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)验证药物重组人溶菌酶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为5.9±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7±0μg/ml，治疗指数(TI)为64。阳性对照药物注射用更昔洛韦CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0，最小有效浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。
以上结果，可以得出本发明的优点在于基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。基因重组人溶菌酶使用安全无毒副作用，有很好的药用前景。基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，并可做成各种注射剂、片剂、颗粒剂、气雾剂、滴剂等，使用方便，用法与用量静脉注射成人每日1～3次，每次100万U～300万U，小儿每日1～3次，每次50万U～200万U。气雾剂直接喷雾作用于病灶局部给药，每日1～6次，每次1500u～30000u成人与小儿相同。滴剂直接作用于病灶局部给药每日1～6次，每次1500u～30000u。片剂、胶囊剂、颗粒剂成人每日1～3次，每次100万u～300万u。小儿每日1～3次，每次50万u～150万u。
图1冠状病毒04号。
图2冠状病毒04号半数感染量(TCID50)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、摇床转数为每分钟250转，培养温度为20℃，在恒温床上培养36小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。并将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测得蛋白活性后保存。取人溶菌酶冻干粉1％，磷酸盐缓冲液5mM(pH5.0)90％；制成注射剂，主要用于冠状病毒SARS(非典型性肺炎)疾病。
实施例2将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、在恒温床上培养40小时后，再将培养液进行纯化制成含人溶菌酶冻干粉0.1％、磷酸盐缓冲液20mM(pH7.0)80％、25％丙三醇、5/万吐温80的气雾剂。
实施例3将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、在恒温床上培养36小时后，再将培养液进行纯化制成含人溶菌酶冻干粉0.005％、磷酸盐缓冲液10(pH6.0)80％、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、0.9％水溶性氮酮、3/万吐温80的滴剂。
实施例4将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、在恒温床上培养40小时后，再将培养液进行纯化制成胶囊剂、片剂、颗粒剂。其含人溶菌酶冻干粉10％、药用淀粉50、药用糊精25％、磷酸盐缓冲液10mM(pH6.0)、蔗糖5％。
权利要求
1.基因重组人溶菌酶涉及作为一种制备预防冠状病毒SARS的药中的应用。
2.基因重组人溶菌酶涉及作为一种制备抑制冠状病毒SARS药中的应用。
3.基因重组人溶菌酶涉及作为一种制备预防和抑制冠状病毒SARS的药物包括注射剂、片剂、胶囊、颗粒剂、气雾剂、滴剂。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组人溶菌酶的新用途，特别是涉及制药领域中基因重组人溶菌酶在预防和抑制冠状病毒SARS的新用途。可做成注射剂、片剂、胶囊、颗粒剂、气雾剂、滴剂。其来源丰富，制备工艺简单，使用安全方便，无毒副作用，具有很好的药用前景。
文档编号A61P31/14GK1449822SQ0312701
公开日2003年10月22日 申请日期2003年5月4日 优先权日2003年5月4日
发明者张华 , 安米, 安献禄, 李元 申请人:长春奇龙生物技术研究所