一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法
【专利摘要】本发明提供一种高灵敏度检测和鉴定6种人冠状病毒的方法，该方法是以排除PCR扩增产物污染为前提、以多重PCR–质谱联用为平台的高灵敏度检测和/或鉴定人冠状病毒的方法，本发明检测的6种人类冠状病毒包括：HCoV-229E,HCoV-OC43,HCoV-NL63,HCoV-HKU1,SARS-CoV和MERS-CoV，检测部位为6种病毒基因组中的特异序列区，可实现在一个反应中对6种人冠状病毒进行多基因检测，提高检出率，具有灵敏度高，特异性强，操作简便，快速，高通量的优点，可应用于科研、临床和流行病学调查。
【专利说明】一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病原微生物的检测方法，特别涉及一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法。
【背景技术】
[0002]人冠状病毒(human coronavirus, HCoV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus )，是单链正义RNA病毒。病毒粒子呈不规则形状，外包脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白:刺突糖蛋白(S, Spike Protein);小包膜糖蛋白(E, Envelope Protein);膜糖蛋白(M, Membrane Protein)。
[0003]HCoV是是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。目前已发现的HCoV有6种:HCoV-229E, HCoV_0C43，SARS-CoV, HC0V-NL63，HCoV-HKUl和MERS-CoV。其中，最早发现的HCoV_229E和HCoV_0C43主要引起上呼吸道感染，症状较轻。2002年11月底，在我国广东地区发生了一种不明原因的以近距离空气飞沫和密切接触传播为主的呼吸道急性传染病，国内称之为传染性非典型肺炎，即“非典”;世界卫生组织将其命名为严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)，后证实由SARS-CoV引起。SARS是本世纪新发现的一种严重传染病，播及到30多个国家和地区，其中以东南亚为主要疫区。之后，HCoV-NL63，HCoV-HKUl相继被发现，其中HCoV-NL63可引起上呼吸道感染，细支气管炎和肺炎，感染小儿时可出现严重下呼吸道症状；而HCoV-HKUl感染多表现为细支气管炎和肺炎。2012年9月，一种新的冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)被发现，它可引起人类严重急性呼吸道感染(severe acute respiratory infection, SARI),截止 2013 年 6 月 18 日，已发现64位患者，其中38人死亡。
[0004]由于HCoV可引起严重呼`吸系统疾病，因此对它的快速检测显得尤为重要。经典的检测方法包括病毒培养和血清学检测，但是由于耗时长，灵敏度低，已不能满足临床需求。基于核酸检测的RT-PCR及荧光定量PCR方法成为新的主要检测手段，常用的方法是针对单个病毒的，由于通量低，造成检测工作量加大，严重影响了 HCoV与人类疾病关系的深入研究。因此开发高通量多重检测方法成为迫切需要。如中国专利申请CN102732638A采取5种荧光，对 HCoV-229E, HCoV-0C43, SARS-CoV, HCoV-NL63 和 HCoV-HKUl 进行检测，就是在这种背景下产生的。但是由于这种方法需要使用荧光染料，对实际操作要求较高。而且，这种方法针对每种HCoV只采用一条探针进行检测。由于HCoV基因组存在一定变异，这种方法会造成一定程度的漏检。目前对6种HCoV在一个反应中进行检测的方法未见报道。
【发明内容】
[0005]为克服上述技术的缺陷，本发明提供了一种基于质谱平台的高灵敏度、高通量、采用多探针可同时检测6种HCoV的方法。
[0006]本发明检测的6 种 HCoV 包括:HCoV-229E, HCoV_0C43，HCoV-NL63, HCoV-HKUl, SARS-CoV和MERS-CoV，检测部位为病毒基因组中特异序列。
[0007]本发明的检测方法，包括以下步骤:
[0008]1、引物设计:涵盖2013年6月之前公开发表的6种HCoV，包括:HCoV_229E，HCoV-0C43, HCoV-NL63, HCoV-HKUl, SARS-CoV和MERS-CoV。根据待测人冠状病毒全序列，选择每种病毒的特异性保守序列，设计PCR引物，在引物的5 ’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少30Da。各种人冠状病毒扩增引物序列见表1，其对应的喊基延伸探针见表2。
[0009]2、PCR反应:在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了 PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
[0010]3、虾碱性磷酸酶(SAP)处理:使未结合的剩余核酸(dNTPs)脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
[0011]4、碱基延伸反应:在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da,
[0012]5、树脂脱盐:纯`化延伸反应产物。
[0013]6、质谱检测:将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MASS)系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HCoV类别，软件自动处理报告每种病毒的检测结果和可信程度。
[0014]本发明的检测方法，优选的包括以下步骤:
[0015](I)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区中的保守序列设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；
[0016](2)第一次PCR扩增反应，将dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
[0017](3)用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；
[0018](4)第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da ；
[0019](5)采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；
[0020](6)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HCoV的类型。[0021]其中所述步骤(1)引物设计中每一种待测HCoV，采用特异序列区。引物序列为SEQID N0.1 至 SEQ ID N0.28，探针序列为 SEQ ID N0.31 至SEQ ID N0.44。
[0022]所述步骤(1)中，优选的采用了样品质量控制参照，引物序列为SEQ ID N0.29和SEQ ID N0.30，探针序列为 SEQ ID N0.45。
[0023]优选的在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水。
[0024]本发明的方法，检测浓度低至10拷贝/ul。
[0025]表1
[0026]
【权利要求】
1.一种可同时检测6种人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含SEQ IDN0.1-SEQ ID N0.45 的多核苷酸。
2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述人冠状病毒包括:humancoronavirus229E (HCoV-229E), human coronavirus 0C43 (HCoV-0C43), human coronavirusNL63(HCoV-NL63), human coronavirus HKUl(HCoV-HKUl), SARS coronavirus(SARS-CoV)和 MERS coronavirus(MERS-CoV)。
3.根据权利要求1的试剂盒，其中，SEQID N0.1-SEQ ID N0.28为6种人冠状病毒的正向和反向引物序列；SEQ ID N0.31-SEQ ID N0.44为碱基延伸探针序列；SEQ ID N0.29和SEQ ID N0.30为质控引物序列；SEQ ID N0.45为质控碱基延伸探针序列。
4.权利要求1的试剂盒的使用方法，其特征在于，每种病毒采用针对特异基因区序列探针检测，所述方法包括以下步骤: (1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区域中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该病毒特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基； (2)第一次PCR扩增反应，将dUTP/dATP/dGTP/dCTP混合物、UNG酶、Taq酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物； (3)用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活； (4)第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs或类似核酸末端终止剂加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端， 延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少30Da ； (5)采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物； (6)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人冠状病毒的类型。
【文档编号】C12Q1/68GK103484564SQ201310309972
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月23日 优先权日:2013年7月23日
【发明者】彭俊平, 郭军华, 金奇 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所, 郭军华