专利名称：一种制备预防流感抗血清的方法
技术领域：
本发明属生物制品领域，具体涉及一种制备预防流感的抗血清的方法。
陈则等将病毒株A/PR/8/34的HA、NA、M1、NP和NS1的编码基因分别克隆入小鸡的β肌动蛋白表达载体(pCAGGSP7)中，比较不同的表达质粒在BALB/c小鼠中的免疫保护能力。结果显示，接种HA或NA核酸疫苗的小鼠能有效抵抗病毒感染。用同样的方法，将HA、NA和NP的表达质粒接种BALB/c(H-2d)、B10(H-2b)和C3H(H-2k)三个品系的小鼠。结果显示，NA表达质粒在所有三种小鼠中均表现出很高的保护水平，而HA表达质粒只在BALB/c小鼠中有效，NP表达质粒则全无效果，只引发低滴度的抗体反应。由此证明，NA基因为流感核酸疫苗的重要组成部分。之后，又用HA和NA的表达质粒联合免疫小鼠，其免疫效果要明显好于用HA或NA质粒单独免疫小鼠。在此基础上，对NA表达质粒的交叉保护效果做了研究。从A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/Aichi/2/68(H3N2)和A/PR/8/34(H1N1)中获得3种NA表达质粒，对BALB/c小鼠分别接种，加强免疫后用致死量的A/Guizhou/54/89攻击。结果显示接种A/Guizhou NA质粒的小鼠能完全抵抗同源病毒的攻击，接种A/AichiNA质粒的小鼠对变异株(A/Guizhou)的攻击也有很高的交叉保护效果，而接种PR8 NA质粒的小鼠则无法抵抗不同亚型病毒株的攻击。NA对流感变异株的交叉保护效果被再一次证明。
基于以上对比分析，可以看出所述流感生物预防制品制备的现有技术中存在的共同不足是制备工艺相对繁琐，导致生产制备周期增长，生产成本增加。其次，由于这些流感生物预防制品基本为疫苗产品，其免疫保护机理是在接种者体内产生主动应答，因此对于老人和婴幼儿以及免疫肾衰或其他免疫抑制病人，所述疫苗无法诱发具有保护性水平的抗体反应。对于DNA疫苗而言，直接用于人体还存在着安全性问题。
本方法采用流感DNA疫苗免疫动物，产生抗血清，以此抗血清被动免疫动物，起到预防保护效果。经实验证明，由流感DNA疫苗产生的抗血清具有保护效果。本发明方法不需制备抗原蛋白，用DNA疫苗免疫动物，获得抗血清.本流感预防用抗血清克服了已知流感预防制品的不足，提供了一种较为安全、有效的流感预防制品的制备方法。
本发明方法通过如下技术方案和步骤实现，1)提取流感病毒抗原HA、NA基因；2)构建HA、NA DNA疫苗；3)鉴定HA、NA DNA疫苗；4)选择实验动物；5)HA、NADNA疫苗免疫动物；6)测定抗HA、NA抗血清效价；7)采集抗血清；8)抗血清被动免疫；9)流感病毒攻击实验。
所述病毒DNA按已知方法从在10日龄鸡胚中繁殖得到的PR8病毒中提取。RNA经逆转录反应得单链cDNA。以cDNA为模板，对HA和NA基因进行PCR扩增，各自的引物为本领域所公知，均含有Xho I和Sma I酶切位点。PCR产物用Xho I-Sma I消化，克隆入经同样酶切处理的表达载体pCAGGSP7中。PCAGGSP7含鸡β-actin启动子成分和SV40的复制起始部位(Ori)。
将流感病毒株A/PR/8/34(PR8，H1N1)的HA和NA基因克隆入表达载体pCAGGSP7，获得重组质粒pCAGGSP7/HA，pCAGGSP7/NA。
编码HA和NA的质粒在Escherichia coli XL1-blue中扩增，用纯化试剂盒(市购)纯化。测序证实HA和NA DNA核酸序列。用紫外风光光度法测定质粒的浓度和纯度。
本发明所述DNA疫苗的导入方式，有肌肉注射、皮内注射、鼻内滴注或鼻腔喷雾、脂质体法以及基因枪免疫和活体电击免疫等。本发明方法涉及的抗血清制备，可根据动物种属差异，抗血清量和型的需要及抗原要求，选择1)动物，包括马、骡，或家兔、豚鼠，或山羊和家兔；2)免疫剂量、时间和途径，其中大动物抗原剂量(以蛋白抗原为准)约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。免疫注射的途径一般采用多点注射，总点数约为8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下。免疫间隔时间以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔为7～10天；3)动物采血在末次免疫后5～7天，采用用颈动脉放血，心脏采血和静脉多次采血法；4)抗血清分离多采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝块收缩；5)抗血清效价鉴定，采用双向免疫扩散法或ELISA进行测试以及血凝抑制试验和放射免疫技术。
本发明方法涉及的免疫程序，可采用一次DNA疫苗免疫，两次DNA疫苗免疫，三次DNA疫苗免疫或先用DNA疫苗免疫再用蛋白疫苗加强的多种免疫程序。
HA、NA DNA疫苗免疫动物；选取6～8周龄BALB/c小鼠。
腹腔注射全身麻醉小鼠后，注射溶于TE的DNA溶液入右后腿股四头肌，在注射部位两侧插入两根电击仪的电极，相距0.5cm，进行电击(电压100v，电击时间50ms，电击正负各三次，间隔1s)，完成一次免疫。本方法采用3种不同的免疫程序对小鼠进行免疫1)第0、3周各免疫1次，共2次。每次每只小鼠50μgDNA(1μg/μl)。设未插入基因的载体DNA免疫小鼠为阴性对照。第4周用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。2)第0、3周各免疫1次，共2次。每次每只小鼠50μgDNA(1μg/μl)。设未插入基因的载体DNA免疫小鼠为阴性对照。第6周用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。3)第0、3、6周各免疫1次，共3次。每次每只小鼠50μgDNA(1μg/μl)。用未插入基因的载体DNA免疫小鼠作为阴性对照。第9周用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。
取小鼠血清样本作ELISA，测IgG抗体。用10μg/mL的A/PR/8/34灭活疫苗包被96孔酶标板37℃2小时，PBS-T洗三次后加入封闭液，4℃过夜。用封闭液以2的倍数稀释血清后，加入酶标板，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入用生物素标记的山羊抗鼠IgG二抗，37℃温育1小时。PBS-T洗三次后，加入碱性磷酸酶标记的链菌蛋白，37℃温育1小时。最后，PBS-T洗三次后，加入p-NPP显色。在30分钟内，用酶标仪利用双波长(414nm-405nm)测出OD值，最终确定抗体IgG的最高稀释度，以此来确定抗体量的高低。
用氯仿麻醉小鼠，从心脏采血。收集的血液置于室温1小时。凝固后析出血清。4000转/分离心10分钟。在无菌条件下吸出血清，混匀后按每管50～200μl分装，-20度冰箱保存。
实施例2抗血清被动免疫动物用HA、NA抗血清被动免疫6～8周龄的小鼠。注射器吸取抗血清并排气，温水浸泡鼠尾使血管扩张，用70％乙醇擦拭并固定鼠尾。抗血清尾静脉注射，24小时后，用A/PR/8/34(H1N1)病毒(20LD50)通过滴鼻法(17μl病毒悬液)攻击小鼠。观察小鼠体重变化和存活率判定HA和NA抗血清的保护效果。病毒攻击后第3天，HA和NA实验组小鼠平均体重均下降10％左右，对照组小鼠平均体重下降20％左右。病毒攻击后第6天，实验组小鼠平均体重均下降20％左右，对照组小鼠平均体重下降35％左右。实验表明，用100μl HA和NA抗血清被动免疫的小鼠存活率均为90％，用300μl HA和NA抗血清被动免疫的小鼠存活率均为100％。结果证实，用HA、NA DNA疫苗免疫的小鼠产生的抗血清被动免疫成年小鼠，可使之抵抗致死量流感病毒攻击，起到保护效果。
本发明所采用DNA疫苗与传统用于传染病预防的疫苗如灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等相比，有以下特点(1)免疫效果好，与普通蛋白疫苗不同，基因疫苗能在自身细胞中产生外源性蛋白，这种蛋白较之在原核生物表达系统中产生的蛋白质更象天然分子，其递生过程与自然感染十分相似。因此，这样的免疫原将含有在构象上相关的表位，诱导产生对应于天然抗原的免疫应答。另外，核酸疫苗对已有免疫力的个体接种仍可起作用。
(2)核酸疫苗与减毒活疫苗和载体活疫苗一样引起CTL应答，但却不存在后两者毒力回升的危险，也不存在散毒，病毒污染及个体传染源的敏感性相关的毒力改变，对于常规疫苗难以培养或危险的致病体，核酸疫苗则易于构建。
(3)免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，它可以持续地给免疫系统提供刺激，因此，很微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答。
(4)方法简便，价格低廉。核酸疫苗仅需在细菌中生产，构建高效表达质粒，与普通疫苗相比，核酸疫苗的制作省去了抗原提取和纯化等繁琐耗时的过程，使得制备周期大大缩短。核酸疫苗用量少，比其它疫苗更经济。
(5)核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能。基因免疫只对表达的抗原而不对载体产生免疫应答，故同一质粒可以用于转运不同的靶基因而多次使用，也可在一个载体上构建表达多种抗原的被称为″复合疫苗″或多价疫苗的多功能疫苗，达到一次免疫能取得多次不同免疫相同的免疫效果。
(6)核酸疫苗可以加工成干燥的小粒便于贮藏和运输。干燥的DNA小粒在室温下相对稳定，不需要冷藏设备，因此对边远地区的使用也较为方便。核酸疫苗在给与前即刻加水就能简单地恢复原状，在经济上和公共卫生方面都有利。
权利要求
1.一种制备预防流感抗血清的方法，其特征在于采用流感DNA疫苗免疫动物，产生抗血清，以此抗血清被动免疫动物。
2.根据权利要求1所述的制备预防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤，1)提取流感病毒抗原HA、NA基因；2)构建HA、NA DNA疫苗；3)鉴定HA、NA DNA疫苗；4)选择实验动物；5)HA、NA DNA疫苗免疫动物；6)测定抗HA、NA抗血清效价；7)采集抗血清；8)抗血清被动免疫；9)流感病毒攻击实验。
3.根据权利要求1所述的制备预防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法其中用DNA疫苗免疫动物，免疫方式采用活体电击免疫，基因枪免疫和肌注免疫方式。
4.根据权利要求1所述的制备预防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法其中用DNA疫苗免疫动物，免疫程序采用一次DNA疫苗免疫，两次DNA疫苗免疫，三次DNA疫苗免疫或先用DNA疫苗免疫再用蛋白疫苗加强免疫。
5.根据权利要求1和4所述的制备预防流感抗血清的方法，其特征在于所述方法其中用DNA疫苗免疫动物，免疫程序采用DNA疫苗免疫再用蛋白疫苗加强免疫。
6.根据权利要求1所述的制备流感预防抗血清的方法，其特征是所述方法其中构建HA、NA DNA疫苗所述表达载体是pCAGGSP7，重组质粒是pCAGGSP7/HA，pCAGGSP7/NA。
全文摘要
本发明属生物制品领域，具体涉及一种制备预防流感的抗血清的方法。本方法采用流感DNA疫苗免疫动物，产生抗血清，以此抗血清被动免疫动物，起到预防保护效果。本发明方法不需制备抗原蛋白，用DNA疫苗免疫动物，获得抗血清，制备方法简便，价格低廉，使用方便，免疫效果好，克服了已知流感预防制品的不足，提供了一种较为安全、有效的流感预防制品的制备方法。
文档编号A61P31/16GK1452984SQ0312887
公开日2003年11月5日 申请日期2003年5月26日 优先权日2003年5月26日
发明者朱威, 陈则 申请人:上海生物制品研究所