专利名称：治疗心脑血管疾病的注射剂的制造方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及纯中药技术领域，特别是一种治疗心血管疾病的注射剂(商品名为疏血通)的制造方法及其产品。
目前治疗心血管疾病的中西药物虽然很多，但是高效、速效、安全的特效药却不多见，造成心血管疾病的死亡率及后遗症的发生率居高不下。为此，研制一种高效、速效、安全的药物，降低病死率和后遗症发生率就成为医药界的主攻方向。
本发明的目的是这样实现的一种治疗心脑血管疾病的注射剂的制造方法，其特征是它包括如下步骤(1)原料选择及低温浸渍在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2～4倍的生理盐水中，于低温0～4℃浸渍15～30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；(2)捣碎研磨将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5μm的匀浆液；(3)冷冻及解融将匀浆液在-15℃以下冷冻15～30小时后取出，于低温0～4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次；(4)分离和纯化将上述冷冻和解融液置于离心机离心分离，再将上清液通过分子量为5万的滤柱进行粗滤，滤液经105～136℃热压10～30分钟；再通过分子量为1万的超滤柱进一步过滤纯化；(5)配液将分别提取的水蛭溶液和地龙溶液以一定比例混合均匀，包括制成1-20ml/支的注射剂，或50-200ml/瓶的注射剂，或脱水干燥成粉针剂，经检测后包装。
该水蛭和/或地龙原料包括干品和/或鲜品。该步骤(3)的冷冻及解融中，其匀浆液为在-20℃冷冻20小时。
本发明还提供一种治疗心血管疾病的注射剂，其特征是它包含有水蛭生理盐水提取液33％～84％和地龙生理盐水提取液16％～67％。
本发明的治疗心脑血管疾病注射剂的重要意义是进一步发掘和继承祖国医药学中的宝贵遗产；其次针对心脑血管疾病起病急骤、变化迅速、病情危急的特点，发掘出一种高效、速效、安全的注射剂药物，开创了动物类中药复方注射剂的先河，最大限度降低心脑血管疾病的病死率和中风后遗症；通过对动物类药物全方位的研究，在传统中药基础上采用现代生化技术加以提高，充分发挥动物类中药的优势，使其更好地造福于人类。
下面结合较佳实施例和附图
进一步说明。
图2是本发明的制造50-500ml/瓶注射剂的工艺流程示意图。
图3是本发明的制造粉针注射剂的工艺流程示意图。
5、配液、灌封至成品将分别提取的水蛭和地龙溶液混和均匀，加生理盐水至2000ml，灌封，每支2ml，灭菌、检测、包装。
6、检测结果总氨基酸5.90mg/支；总糖15.20mg/支；次黄嘌呤0.136mg/支；总固体25.16mg/支；可控指标占总固体84.40％。
需要说明的是在配液时，加入的生理盐水可以是2000-5000ml，作成系列不同浓度的注射剂，以满足不同病人的需求。
实施例2参阅图2所示，本发明实施例2的治疗心脑血管疾病的瓶注射剂的制造方法包括如下步骤1、原料选择及低温浸渍主要药材原料是水蛭和地龙，水蛭655g(干品)及地龙345g(干品)，在室温条件下，分别用生理盐水浸泡2.5小时左右，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于4倍的生理盐水中，于低温(0～4℃)浸渍15小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；2、捣碎研磨将药渣采用高速组织捣碎机(1000rpm)，利用高速转动的刀片将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合，使用匀浆器利用其两个磨砂面相互摩擦，将组织磨碎成直径小于0.5μm的匀浆液；3、冷冻及解融将匀浆液在-15℃以下冷冻25小时后取出，于低温0～4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复4次；4、分离和纯化将上述冷冻和解融液置于离心机(5000r/min)离心分离，再将上清液通过分子量为5万的滤柱进行粗滤，滤液经121℃热压20分钟；再通过分子量为1万的超滤柱进一步过滤纯化；5、配液、分装至成品将分别提取的水蛭和地龙溶液混合均匀，加生理盐水至50000ml，分装，每瓶100ml，灭菌、检验、包装6、检测结果总氨基酸9.00mg/瓶；总糖29.0mg/瓶；次黄嘌呤0.331mg/瓶；总固体45.52mg/瓶；可控指标占总固体84.21％。
实施例3
参阅图3所示，本发明实施例3的治疗心脑血管疾病的冻干粉针剂的制造方法包括如下步骤1、原料选择及低温浸渍主要药材原料是水蛭和地龙，水蛭715g(干品)及地龙285g(干品)，在室温条件下，分别用生理盐水浸泡2小时左右，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于3倍的生理盐水中，于低温(0～4℃)浸渍25小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；2、捣碎研磨将药渣采用高速组织捣碎机(1000rpm)，利用高速转动的刀片将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合，使用匀浆器利用其两个磨砂面相互摩擦，将组织磨碎成直径小于0.5μm的匀浆液；3、冷冻及解融将匀浆液在-20℃冷冻15小时后取出，于低温0～4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复5次；4、分离和纯化将上述冷冻和解融液置于离心机(5000r/min)离心分离，再将上清液通过分子量为5万的滤柱进行粗滤，滤液经130℃热压10分钟；再通过分子量为1万的超滤柱进一步过滤纯化；5、配液、分装、冻干将分别提取的水蛭和地龙溶液混合均匀，加入5％甘露醇，加生理盐水至2000ml，先经分子量为1万的超滤柱过滤，再经0.22μm微孔滤膜终端除菌过滤，分装于西林瓶或安瓿中，在-40℃至-60℃预冻3～4小时，随后抽真空(真空度低于15pa)，线性升温、干燥时间20～36小时，即可制成冻干粉针剂。
6、检测结果总氨基酸8.44mg/支；总糖28.8mg/支；次黄嘌呤0.344mg/支；总固体44.56mg/支；可控指标占总固体84.34％。
关于本发明的制造方法的创造性的进一步说明如下1、关于原料及剂型的选择水蛭做为一味常用的活血化瘀中药，其适应症治疗重点，也由以往的妇科疾患，转移到现在的心脑血管疾病上。传统的水蛭用于治疗心脑血管疾病上，有以复方辨证施治的，更多的则是单味药的投治，都收到了较好效果，由于都是口服途径给药，其有效物质的生物利用度较低，造成其疗效较为缓慢，不适应急性心脑血管病的需求。
地龙的药用价值常用于咳喘、中风后遗症、慢性肾小球肾炎、腮腺炎、跌打损伤等，无论是复方组合，还是单方施治，都有较好的临床疗效。但是，由于都是口服途径给药，其有效物质的生物利用度较低，造成其疗效较为缓慢，不适应急性心脑血管病的需求。
本发明将以上二者合用，达到破血逐瘀之中具有活血通络之意，软坚活血有助于通络，可谓相得益彰，由于注射剂具有起效迅速可靠，适用于不宜或不能口服给药的危重病人，而心脑血管疾病，尤其是急性心脑血管疾病，多以起病急骤、变化迅速及病情危重为特点，因此，注射剂为治疗心脑血管疾病的首选给药途径。通过将水蛭和地龙配伍，制成小容量注射针剂、大容量注射剂或粉针剂，达到高效速效共奏活血化瘀，通经活络的作用，以及治疗心血管疾病的目的。
2、关于原料的前处理的方法为了便于保存和运输，中药材大多采用干品，本发明使用的中药原料水蛭和地龙前处理方法是在室温条件下，分别用生理盐水浸泡3小时左右，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，其浸泡液经过“纸色谱法”(中国药典2000年-部附录VI A)试验，未发现其中有氨基酸，该处理方法即达到使干燥药材展开，清除杂质污垢，又不使有效成分损失的目的。
3、关于提取中药的有效成分的工艺方法对于提取中药的有效成分的传统方法是采用醇提取法或水煎煮法，本发明人将醇提取法和水煎煮法与本发明的方法分别制备相同浓度的提取液应用于大鼠，测定凝血时间，结果见表1所示。
表1
从表1可见三种提取液对大鼠全凝血时间(CTg)的影响，说明本发明的方法最佳。
4、关于细胞的破碎方法本发明所使用的水蛭和地龙通常是干品，经过清洗后再浸泡，组织虽然已变软，但直接研磨成匀浆液，还是相当费时又困难，因此，本发明先采用高速组织捣碎机(1000rpm)，利用高速转动的锋利的刀片将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合，使用匀浆器利用其两个磨砂面相互摩擦，将组织磨碎成直径小于0.5μm的匀浆液；在机械破碎的基础上，进一步采用物理破碎法，即反复冷冻法，即于低温(-15～-20℃)使之冻固，然后再缓慢地解融，如此反复地操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏，其原理是由于渗透压的变化，使结合水冻结，产生组织的变形，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质类可溶性成分溶解于溶液中，同时，可以使脂蛋白冻结变性，以利于清除。
5、关于滤过条件与热压条件的选择本发明的产品为静脉注射剂，又是从动物体提取的制剂，因此，不能有蛋白质等大分子物质，否则其后果不堪设想。本发明所采用的方法是首先选择5万分子量左右的滤柱进行粗滤，这样可以使低于5万分子量的物质通过，除去5万以上的蛋白质等大分子量物质；第二步选用分子量1万以下的超滤柱过滤，使保留1万以下的小分子多肽，除去较大分子肽。
由于低聚肽的性质与氨基酸相似，其既溶于水，也溶于醇，且受热不凝固，很难除去，其无论使用高浓度醇，或采用煮沸冷藏、或活性炭吸附等均不能将其除去。本发明经过大量的实验研究，创造出使滤液经105～136℃热压10～45分钟处理，一方面可以使部分低聚肽进一步分解成氨基酸，溶解于提取液中；另一方面可以使部分低聚肽凝固析出沉淀，以便除去。
以下是关于本发明的方法制造的治疗心血管疾病的注射剂(商品名为疏血通)的药效学、药理学、质量标准、药品稳定性和临床试验等的试验研究。
委托中国医学科学院药物研究所、中国药品生物制品检定所，中国科学院物理所进一步按照“中药注射剂研制指导原则(试行)”的要求，对药效学、药理学、质量标准和药品稳定性等进行了全面系统的试验研究。现将试验研究结果综述如下(一)药效学及一般药理的试验研究1、对小鼠凝血时间的影响分别给小鼠尾iv注射2.5和5.0g/kg(生药量，以下同)本发明的注射剂后，测量其凝血时间，结果表明凝血时间均显著延长；2、对大鼠血小板的影响(1)对大鼠血小板的影响分别给大鼠尾iv注射1.0、2.5和5.0g/kg本发明的注射剂后，测量其血小板数，结果表明均具有轻度降低血小板数，显著降低血小板的粘附的作用，有利于减少血栓的形成；(2)对大鼠血小板聚集的影响分别给大鼠尾iv注射0.5、1.0和2.5g/kg本发明的注射剂后，测量其血小板聚集，结果表明均可使ADP、花生四烯酸和凝血酶诱导的血小板聚集减少，并显示出一定的剂量效应关系；3、对血栓的影响(1)对预防血栓形成的影响分别给大鼠尾iv注射0.5、1.0和2.5g/kg本发明的注射剂后，进行其体外血栓和体内静脉血栓试验，结果表明所形成的血栓重量均有不同程度的减轻，说明具有抑制血栓形成的作用；对大鼠动脉预防性血栓形成的影响分别给大鼠舌静脉注射0.5、1.0和2.5g/kg本发明的注射剂后，进行其血栓试验，结果表明均使血栓形成的时间延长；(2)溶血栓的作用①对股动脉血栓狗的动脉血流量的影响给狗注射30g/kg本发明的注射剂30分钟后，测量其血流量，结果表明血流量明显增加；②不同剂量的本发明的注射剂和UK，对纤维蛋白原的影响给狗注射30g/kg本发明的注射剂30分钟后，测量其纤维蛋白原的含量，结果表明均无明显的变化，表明本发明的注射剂对纤维蛋白原无影响；③对股动脉血栓狗的血浆优球蛋白溶解时间的影响给股动脉血栓狗注射15g/kg和30g/kg本发明的注射剂30分钟后，测量其优球蛋白溶解的时间，结果表明均明显的缩短，与给药前比较差异显著；④对狗股脉血栓重量的影响给股动脉血栓狗注射30g/kg本发明的注射剂30分钟后，测量其股动脉血栓重量，结果表明股动脉血栓重量明显减轻，左右股动脉血栓重量分别减少35.8％和34.9％；给股动脉血栓狗注射15g/kg本发明的注射剂30分钟后，左右股动脉血栓重量分别减少17.8％和32.6％。表明本发明的注射剂具有溶解血栓的作用；4、对大鼠大脑中动脉结扎引起缺血的影响本发明的注射剂按照1.0、2.5和5.0g/kg给药，使结扎大鼠大脑动脉引起的缺血行为障碍减轻，脑缺血面积分别减少28.4％、35.8％和71.7％，表明本发明的注射剂对缺血性脑血管病和中风具有良好的治疗作用。
5、对正常麻醉犬的试验给正常麻醉的犬iv注射本发明的注射剂，按照0.75和1.5g/kg给药，测量BP和HR均无明显改变，但是按照3.0g/kg给药，测量BP和HR，则明显减慢HR，而对BP无明显影响。提示本发明的注射剂对抗脑缺血性疾病和血栓可能不是通过扩张脑血管实现的。
6、一般药理实验将本发明的注射剂按照1.0、2.5和5.0g/kg给昆明种小鼠尾iv注射后，未发现活动和外观行为异常，表明该药对神经系统及外观行为无明显影响；且对小鼠自主活动无明显影。
另将本发明的注射剂以0.5和2.0g/kg给犬iv注射，对犬的呼吸深度、频率、血压，心率及II导电图均无明显的影响。
(二)毒理试验研究1、急性毒性试验通过大量的动物试验表明静脉注射给小鼠的LD50为112.5g/kg(按照生药量计算)，腹腔注射的LD50为173.83g/kg，灌胃给药的最大耐受量为390g/kg。腹腔用药相当临床人用药量的4345倍；静滴用药量相当临床人用药量的2800倍(关于此点的计算方法是小鼠的LD50为112.5g/kg，临床用针剂为0.5g/ml(生药)；成人每日用4ml，相当静滴入2g生药，按体重50kg估算，每人每日静滴入0.04g/kg计，给小鼠静注的LD50值为112.5g/kg，相当于人临床用药的2800倍)，表明本发明的注射剂的毒性较低，临床用药属于安全。
2、长期毒性试验①将本发明的注射剂按照0.4、2.5和15.0g/kg的三个剂量给大鼠静脉注射，连续30天的结果和恢复期的结果，表明各给药组的一般行为表现、摄食量、体重增长率、血液学、血清生化学检查、脏器系数和组织病理学检查等指标，与空白对照组比较，均无明显差异，说明本发明的注射剂在0、4～15.0g/kg(相当临床拟用量10～375倍)剂量范围内，对大鼠无明显毒副作用。
②将本发明的注射剂按照0.5、1.0和3.0g/kg的三个剂量给Beagla犬静脉注射，连续30天的结果和恢复期的结果，一般观察，未见异常；在给药2～4周和恢复期进行血液学、血液生化学检查、脏器系统和心电图，均未见异常；组织病理学检查和脏器均无明显差异，说明本发明的注射剂在0、5～3.0g/kg(大剂量组相当临床拟用量75倍)剂量范围内，对犬无明显毒副作用。可视本发明的注射剂为安全的药物。
(三)安全性试验1、刺激性试验
①局部刺激性试验将本发明的注射剂对两只家兔四块股四头肌注射，均为未见无血或坏死现象，根据刺激反应级的分值为0，即为无明显变化；病理检查无明显炎症反应。表明无局部刺激性反应。
②血管刺激性试验将本发明的注射剂对家兔按照1.0g/kg的剂量耳部注射，连续3次，末次给药后24小时处死家兔，均为未见无血或坏死现象，取注射部位的耳片固定，常规病理组织学检查，在显微镜下，未观察到注射局部的血管有组织变性或坏死等刺激性的反应。
2、过敏性试验按照“中药注射剂指导原则(试行)”附件一过敏性试验要求，对豚鼠注射本发明的注射剂后15分钟内均未见竖毛、呼吸困难、喷嚏、咳嗽、干呕、抽搐、虚脱、死亡等反应现象，表明本发明的注射剂对豚鼠无过敏性。
3、溶血性试验本发明的注射剂和浓缩液均未发现有溶血现象，亦未见有红细胞凝集作用。
(四)本发明的注射剂的质量标准按照卫生部颁布的“中药注射剂指导原则(试行)”中关于质量标准制订的要求，建立了紫外最大吸收、孔C及凝胶电泳的鉴别；检查项目按照有关规定制订了重金属、砷盐、蛋白质、Ph、相对密度、炽灼残渣、钾离子等项的检查，均符合质量标准的要求；含量测定采取高效液相色谱法测定总氨基酸、多肽氨基酸、和次黄嘌呤；用碘量法测定总糖和多糖；用干燥法测定总固体含量；使可控部分的指标达到总固体的60％以上。
(五)药品稳定性试验采取留样观察法、光照法、40℃恒温恒湿箱中的加速试验法等稳定性试验方法，进行了连续三个月的观察，以质量标准的各项作为考察指标，按期进行检验，结果与0月比较，其理化性质稳定无变化，说明本发明的注射剂的质量稳定。
以下是本发明的注射剂的临床试验研究。
本发明的治疗心血管疾病的注射剂经过大量的临床应用试验研究，证明其具有治疗心血管疾病的特效和速效，且无有毒副作用及具有减少后遗症的功效。以下举例说明。
1、临床试验1通过对10名健康人志愿者试验，本发明的注射剂以每日相当于生药量2克用量静滴21日，无论从临床表现，还是血、尿常规，肝、肾、心功能检查，均未发现毒副作用。
而后提高剂量1.5倍，即本发明的注射剂每日相当于生药量3克用量静滴21日，无论从临床表现，还是血、尿常规，肝、肾、心功能检查，均未发现毒副作用。认为本发明的注射剂每日给药相当生药量3克的用量静滴21日是安全的。
2、临床试验2使用本发明的注射剂对50例脑梗塞病人进行了为期一个疗程(10天)的治疗临床试验，结果表明总有效率达84％，疗效明显优于对照组，对照组使用“曲克芦丁”的总有效率仅为36％；上述两组治疗前后CT检查结果是治疗组好转率达96％，对照组好转率为54％；治疗两周后，其中20例的额颞氏低密度区平均缩小64％，表示大脑中动脉供血改善；其中10例的额顶叶低密度区有占位性病变，经继续治疗，其低密度区平均缩小20％，占位性病变消失。
其中10例脑梗塞原左基底节区呈卵园低密度区边缘清晰，且中线右移，经治疗低密度平均缩小70％，中线右移消失。
3、临床试验3使用本发明的注射剂对30例心血管疾病病人进行临床试验，对照组为使用腹蛇抗栓酶试验，结果表明本发明的注射剂的有效率达90％，而对照组为86％；同时发现本发明的注射剂治疗的病人的血栓素B2和纤维蛋日原及血小板数均比治疗前有非常显著的减少；全血比粘度、血浆比粘度和全血还原粘度均比治疗前明显降低，说明本发明的注射剂能有效降低血粘度，改善血细胞电泳率，降低血小板粘附，使脑梗塞区的供血和脑细胞水肿得到改善，使受损的神经细胞恢复其功能。
综上所述，经过对本发明的注射剂全面、系统的试验研究，表明各项研究内容均符合卫生部发布的“中药注射剂研制指导原则(试行)”及新药审批办法“有关中药部分的修订和补充规定”的要求。
关于本发明的治疗心血管疾病的注射剂的临床应用试验研究的详细内容，请参阅如下附件1～81、附件1共8页 一般药理研究的试验资料；2、附件2共22页 疏血通的主要药效学研究；3、附件3共21页 动物长期毒性试验资料；4、附件4共21页 疏血通注射剂治疗中风病II期临床总结；5、附件5共15页 疏血通注射剂IV期临床总结；6、附件6共7页 疏血通注射剂I期临床试验设计及I期临床试验总结。
7、附件7共8页 疏血通治疗缺血性脑血管病的临床观察与评价。
8、附件8共4页 疏血通治疗脑梗塞的临床疗效及对血液流变学的影响。
权利要求
1.一种治疗心脑血管疾病的注射剂的制造方法，其特征是它包括如下步骤(1)原料选择及低温浸渍在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2～4倍的生理盐水中，于低温0～4℃浸渍15～30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；(2)捣碎研磨将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5μm的匀浆液；(3)冷冻及解融将匀浆液在-15℃以下冷冻15～30小时后取出，于低温0～4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次；(4)分离和纯化将上述冷冻和解融液置于离心机离心分离，再将上清液通过分子量为5万的滤柱进行粗滤，滤液经105～136℃热压10～45分钟；再通过分子量为1万的超滤柱进一步过滤纯化；(5)配液将以上制得的两种滤液按照水蛭生理盐水提取液33％～84％和地龙生理盐水提取液16％～67％的比例混合均匀，制成1-20ml/支的注射剂，或50-200ml/瓶的注射剂，或脱水干燥成粉针剂。
2.根据权利要求1所述的治疗心脑血管疾病的注射剂的制造方法，其特征是该水蛭和/或地龙原料包括干品和/或鲜品。
3.根据权利要求1所述的治疗心血管疾病的注射剂的制造方法，其特征是该步骤(3)的冷冻及解融中，其匀浆液为在-20℃冷冻20小时。
4.根据权利要求1所述的治疗心血管疾病的注射剂的制造方法，其特征是该步骤(4)的配液中的脱水干燥成粉针剂包括，将分别提取的水蛭和地龙溶液混合均匀，加入5％甘露醇，加生理盐水至2000ml，先经分子量为1万的超滤柱过滤，再经0.22μm微孔滤膜终端除菌过滤，分装于西林瓶或安瓿中，在-40℃至-60℃预冻3～4小时，随后抽真空(真空度低于15pa)，线性升温、干燥时间20～36小时，即制成冻干粉针剂。
5.一种治疗心血管疾病的注射剂，其特征是它包含有水蛭生理盐水提取液33％～84％和地龙生理盐水提取液16％～67％。
6.根据权利要求5所述的治疗心血管疾病的注射剂，其特征是该注射剂中的总氨基酸、多肽氨基酸、次黄嘌呤、总糖及多糖的含量为总固体的60％以上。
全文摘要
一种治疗心脑血管疾病的注射剂的制造方法及其产品，通过将水蛭和地龙的生理盐水提取液按照一定的配比组成，提供一种高效速效的治疗心脑血管疾病的注射剂，具有降低心脑血管疾病的病死率和后遗症的功效。
文档编号A61K35/56GK1475266SQ0314828
公开日2004年2月18日 申请日期2003年7月1日 优先权日2003年7月1日
发明者李振国 申请人:李振国