专利名称：皮肤病的局部治疗的制作方法
描述本发明涉及一种用于治疗炎性和/或变应性皮肤病的方法，包括局部给予取代的羟基吲哚。
磷酸二酯酶(PDE)的同工酶通过调节环核苷酸水平而涉及细胞信号转导级联的调节。迄今为止，已经鉴定了11种PDE同工酶基因家族(Giembycz，2000)。这些同工酶的区别在于它们的细胞分布和生化功能。在特应性皮炎患者，特别是儿童的白细胞中，发现了较高的PDE4活性(Butler等人，1983；Cooper等人，1985)。PDE4是炎性细胞，如单核细胞和单核细胞衍生的巨嗜细胞(Gantner等人，1997)、嗜酸性粒细胞(Dent等人，1994)和B淋巴细胞(Cooper等人，1985)中的主要同工酶。PDE4抑制剂通过增加胞内cAMP水平而显示出非常强的抗炎作用。通过抑制cAMP降解，PDE4抑制剂可调节胞内功能(例如，减弱过氧化物的产生)和基因转录(例如，抑制炎性细胞因子的合成和/或释放)(Giembycz，2000，Kuss等人，2002)。因为PDE4也在角质形成细胞中表达，因此这些细胞可成为使用PDE4抑制剂控制皮肤炎性疾病的其它可能的药理学靶(Chujor等人，1998)。
羟基吲哚，它们作为PDE4抑制剂的用途以及它们的制备方法在WO99/55696中公开。这些化合物可用于和嗜酸性粒细胞活性有关的疾病，特别是炎性气管疾病，如支气管哮喘、变应性鼻炎、变应性结膜炎、特应性皮炎、湿疹、变应性脉管炎、炎症和增生性皮肤病，如牛皮癣或角化病中。这些化合物可能的给药形式是口服、肠胃外、静脉内、透皮、局部、吸入和鼻内制剂。特别优选的化合物是AWD 12-281。
PDE4抑制剂AWD 12-281(N-(3，5-二氯-4-吡啶基)-2-[1-(4-氟-苄基)-5-羟基-1H-吲哚-3-基]-2-氧代乙酰胺)已在变应性支气管狭窄模型中成功进行了试验。它可显著降低变应原在被动致敏的人类气管中的支气管痉挛作用(Schmidt等人，2000)。AWD 12-281可抑制抗原刺激的人类细胞中的炎性介质从鼻息肉释放，如GM-CSF(粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子)、TNF-α(肿瘤坏死因子)和组胺(Kuss等人，2002)。此外，AWD 12-281可体外抑制人类嗜酸性粒细胞脱粒(Ezeamuzie，2001)。在对致敏Brown Norway大鼠中的抗原作出气管反应的后期，在支气管肺泡灌洗期间，AWD 12-281可体内显著降低嗜酸性粒细胞的积聚。它还对家猪中LPS诱导的肺中性白细胞增多症显示出抑制作用(Kuss等人，2002)。
其它PDE4抑制剂是cilomilast，现在正相对于哮喘(Griswold等人，1998，Giembycz，2000)和慢性阻塞性肺病的治疗对其进行评价。特别是，有关慢性阻塞行肺病的II/III期临床试验已经证实了在临床上可显著增加肺功能(Giembycz，2001，Dyke & Montana，2002)。
为了刺激免疫炎症，已经建立了(Ehinger等人，2000)小鼠耳肿胀试验(MEST)，其中按照Gad等人(1986)所述，使用甲苯-2，4-二异氰酸盐(TDI)将小鼠致敏。它是由Dearman等人(1996)证实的，其中皮肤的TDI致敏导致BALB/c小鼠中产生Th2-型细胞因子。来源于接触TDI动物的活化淋巴结细胞产生大量白介素4和10，但仅产生较低水平的干扰素γ。根据致敏方法的不同，接触变应原TDI诱导IgE-非依赖性(短时间接触)或IgE-依赖性(长时间接触)变应性皮炎(Scheerens等人，1999)。较高的IgE值只能通过长时间接触致敏获得。在其中一项研究中，进行120天的致敏。
进行研究以获得有关不同的PDE4抑制剂对变应性和/或炎性反应的治疗作用有效性的信息。为了改善TDI诱导的耳肿胀，测量治疗过的小鼠耳朵中的细胞因子白介素(IL)4、IL-6和MIP-2。
人们发现，TDI攻击后，作为治疗干预，AWD 12-281的局部给药可显著抑制耳肿胀。与其相比，作为参照化合物的PDE4抑制剂cilomilast(SB207499)则不能达到这种作用。该结果表明局部给药的羟基吲哚，如AWD 12-281可有效预防和治疗变应性或炎性皮肤病。
因此，本发明涉及一种用于治疗皮肤病的方法，包括对有此需要的受治疗者局部给予治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐
其中R1是(i)直链或支链的-C1-12-烷基或单-或多不饱和的-C2-C12烯基，所述基因任选被下列基团单-或多取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO3H、-SO2R6、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R6、-COOH、-(CO)R6、具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，其中C6-14芳基和碳环-及杂环取代基可任选被R4单-或多取代，(ii)具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环或具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，或具有3-10个环原子的碳环-或杂环饱和的或单-或多不饱和的螺环，其中杂环系统包含1-6个杂原子，所述杂原子优选N、O和S，所述环任选被下列基团单-或多取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO3H、-SO2R6、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R6、-COOH、-(CO)R6、具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，其中C6-14芳基和碳环-及杂环取代基可任选被R4单-或多取代，R5是具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环或具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，或具有3-10个环原子的碳环-或杂环饱和的或单-或多不饱和的螺环，其中杂环系统包含1-6个杂原子，所述杂原子优选N、O和S，
所述环任选被下列基团单-或多取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO3H、-SO2R6、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R6、-COOH、-(CO)R6、具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，其中C6-14芳基和碳环-及杂环取代基可任选被R4单-或多取代，条件是R5包含选自-F、-Cl、-Br、-I的至少一个取代基；R2、R3是氢或-OH，其中两个取代基中至少有一个必须是-OH；R4是-H、-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-COOH、-(CO)R6、-(CS)R6、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO2R6、-C1-C6-烷基，其中每个芳基或烷基都可被-OH、-F、-Cl、-Br、-I单-或多取代；R6是-H、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基，直链或支链的-C1-12-烷基，单-或多不饱和的、直链或支链的-C2-12-烯基，具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S；A是一个键，或-(CH2)m-、-(CH2)m-(CH＝CH)n-(CH2)p-、-(CHOZ)m-、-(C＝O)-、-(C＝S)-、-(C＝N-Z)-、-O-、-S-、-NZ-，其中，m、p＝0-3且n＝0-2且
Z是-H、或直链或支链的-C1-12-烷基，单-或多不饱和的、直链或支链的-C2-12-烯基，具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S；B是碳或硫，或-(S＝O)-；D是氧、硫、CH2或N-Z，其中，如果B是碳，则D是S或CH2；E是一个键，或-(CH2)m-、-O-、-S-、-(N-Z)-，其中m和Z具有上面已经描述过的含义。
本发明还涉及通式(I)化合物的药学上可接受的盐。
在通式(I)的化合物中，R5优选自具有至少一个卤素取代基的单环饱和的或单-或多不饱和的碳环及杂环，更优选具有至少一个，例如2或3个卤素取代基的单环芳族碳环及杂环。R5特别优选的例子是具有至少一个卤素取代基的吡啶环或苯环，如3，5-二氯-4-吡啶基、2，6-二氯苯基、2，6-二氯-4-三氟甲基苯基、2，6-二氯-4-三氟甲氧基苯基等。
R1优选自任选被碳环，例如苯环取代的C1-C12烷基，例如C1-C4烷基。R1特别优选的例子是乙基、丙基(正丙基或异丙基)、苄基和卤素取代的苄基，例如4-氟苄基、2，6-二氟苄基等。此外，R1可选自被任选取代的单环饱和的或单-或多不饱和的碳环或杂环。
R2优选OH且R3优选H。A优选自-(C＝O)-和-(CHOH)-。B优选是C，D优选是O且E优选-(N-H)-。化合物(I)特别优选的例子是AWD 12-281(N-3，5-二氯-4-吡啶基)-2[1-(4-氟苄基)-5-羟基-1H-吲哚-3-基]-2-氧代乙酰胺)或其药学上可接受的盐。
本发明的化合物特别适合用于治疗炎性和/或变应性皮肤病，特别是与病理性增加的PDE4-活性有关的皮肤病，例如变应性疾病，如变应性皮炎。
通常，通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐可制备用于人类或其它哺乳动物中任何疾病状况的预防性或治疗性处理的药物，其是由皮肤的炎性反应、以及皮肤细胞的干扰增殖和分化引起的。通式(I)化合物可用于治疗皮肤样巩膜炎、局限性硬皮病、丹毒、寻常天疱疮、落叶状天疱疮和大疱性类天疱疮的炎性反应。所述化合物对由活化T-细胞或免疫系统其它细胞，像粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞或这些免疫细胞释放的介质，如细胞因子引起的炎性皮肤病(例如，扁平红苔癣)也具有有益的作用。此外，这些化合物还可有效治疗自身免疫疾病，像皮肤肌炎、红斑狼疮等的皮肤表现形式。
因为这些化合物能够升高环AMP水平，因此它们可用于治疗人类或除人类以外的哺乳动物中的良性及恶性增生性皮肤病。当在此处使用时，术语‘增生性皮肤病’是指良性及恶性的增生性皮肤病，它们的特征在于细胞在表皮、真皮或其附件中的分化加速，与不完全的组织分化有关。这类疾病包括牛皮癣、特应性皮炎、非-特异性皮炎、原发刺激性接触性皮炎、变应性接触性皮炎、或变应性疾病如特异性变态反应、荨麻疹、湿疹、角膜结膜炎、皮肤的基底和鳞状上皮细胞癌、层板状鱼鳞病、表皮松懈性角化过度、单纯大疱性表皮松懈、恶化前日光诱导的角化病、非-恶性角化病、痤疮和皮脂溢性皮炎、莱尔综合征、人类肉芽肿性皮肤损害和特应性皮炎、瘙痒和驯养动物的兽疥癣。
因为化合物能够减少炎性反应，因此它们可用于治疗由细菌、病毒、真菌或寄生虫感染诱导的皮肤病。这些疾病的例子是游走性红斑、结核性皮肤、莱姆病、皮肤利什曼病、毒性表皮坏死松懈、脓皮病、癣和痔疮。
通式(I)的化合物还可用于治疗皮肤样巩膜炎、局限性硬皮病、丹毒、寻常天疱疮、落叶状天疱疮和大疱性类天疱疮。
因为皮肤细胞的增殖受到胞内cAMP水平的影响，因此通式(I)的化合物可支持伤口愈合。
化合物(I)是作为局部，例如透皮制剂给药的，优选含有活性成分和适宜的药学上可接受载体、稀释剂和助剂的水性或油性混悬液的形式。
通常，通式(I)的化合物，或如果其适宜的药学上可接受的盐，可与常规的局部赋形剂联合作为局部制剂给药。局部制剂可以，例如，软膏剂、糊剂、搽剂、滴剂、霜剂或洗剂、浸渍敷料、凝胶、胶棒、喷雾剂和气溶胶的形式提供，且可包含适宜的常规添加剂如防腐剂，促进药物渗透的溶剂以及软膏剂和霜剂中的软化剂。所述制剂可含有相容的常规载体，如霜剂或软膏剂的基质以及洗剂所用的乙醇或油醇。适宜的霜剂、洗剂、凝胶、棒状物、软膏剂、喷雾剂或气溶胶制剂均可用于通式I的化合物或其适宜的药学上可接受的盐。如果是指直肠和肛门皮肤粘膜的治疗，则通式(I)化合物可作为栓剂给药。
活性化合物的剂量可根据患者的年龄和体重、所治疗疾病的性质和严重程度以及类似的因素而改变。每日剂量可以单个剂量的形式给药或再分成两个或多个每日剂量给药，且可以为0.01-5000mg。
在本发明特别优选的实施方案中，将所述化合物给予已患病的皮肤区域。例如，在变应性攻击后，即所要治疗的患者已经与变应原接触且优选在已经观察到第一个变应性症状后给予所述化合物。特别是，化合物的第一次给药可在变应性攻击后最长达48小时，优选最长达24小时进行。然后，给药将持续到已经获得所需的效果。
所述化合物(I)可作为单独的活性成分给药或与至少一种其它药剂联合给药。例如，通式(I)化合物可与刺激cAMP产生的药物联合给药，例如可包括拟交感神经胺如异丙肾上腺素、新异丙肾上腺素、沙丁胺醇、去氧肾上腺素和麻黄碱；黄嘌呤衍生物如茶碱和氨茶碱以及皮质类固醇如强的松龙和肾上腺刺激剂如ACTH。对免疫系统具有作用的药剂像类固醇、免疫抑制剂(例如，他克莫司、西罗莫司、环孢素、pimecrolimus)、环加氧酶抑制剂(例如，吲哚美辛、双氯酚酸钠、布洛芬)、或抗组胺(苯海拉明、羟嗪、氯雷他定、西替利嗪)可组合在一起。通式(I)化合物可与治疗或处理皮肤病的其它药剂，例如视黄酸、地蒽酚、维生素D衍生物、alefacept、daclizumab、etanercept等同时给药。由细菌、病毒、真菌或寄生虫感染引起的皮肤病的治疗可用抗生素，例如磺胺、红霉素和四环素来支持。因为蛋白，像趋化因子(IP-10)或细胞因子(例如，IL1β、IL-2)可影响皮肤细胞的分化和增殖，因此用这些介质或抗体补充对于治疗皮肤病而言具有益处。
另外，将通过下列附图和实施例更详细地解释本发明。
图1使用“Franz”渗滤池和鼠背部皮肤测量的14C AWD 12-281的皮肤渗透。在360分钟的培养过程中，测量血浆中的14C AWD 12-281活性。两个独立实验的结果。将15μl(110322970dpm)14C AWD 12-281(溶于丙酮/DMSO 1∶1中)涂在剃过的皮肤上。
图2在TDI攻击前2小时，单独局部应用AWD 12-281、cilomilast和二氟松对TDI致敏小鼠耳朵的作用。竖条代表与TDI攻击前获得的值相比，TDI攻击后1、5和24小时的耳肿胀。与没有处理过的对照组(白条)相比，TDI处理过的小鼠(黑条)耳肿胀明显增加。AWD12-281(1％，垂直画影线的条)以及cilomilast(3％，交叉画影线的条)和二氟松(0.05％，灰条)在所有测量时间都可显著抑制肿胀。与TDI处理过的动物相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(每组n＝6(TDI＝12))。
图3TDI-攻击后1小时，AWD 12-281、cilomilast和二氟松的单一局部应用对TDI致敏小鼠耳朵的作用(治疗性干预)。竖条代表TDI攻击后5和24小时的耳肿胀。攻击后5小时，处理过的组之间没有显著差异。与TDI攻击的对照小鼠相比，AWD 12-281(1％，白条)以及二氟松(0.05％，灰条)可在攻击24小时后显著抑制肿胀。Cilomilast(3％，交叉画影线的条)没有引起显著的抑制。**P＜0.01，(每组n＝6(TDI＝12))。
图4使用长期(120天)反复接触致敏方式，AWD 12-281对TDI致敏小鼠中TDI诱导的耳肿胀的作用。竖条代表TDI攻击后1、5和24小时的耳肿胀。攻击后1和5小时的组之间没有显著性差异。与TDI处理过的对照小鼠(白条)相比，在TDI攻击后1小时给药的AWD12-281(3％，黑条)可在攻击后24小时显著抑制肿胀。**P＜0.01，(每组n＝5)。
图5TDI攻击后24小时，匀化小鼠耳朵中白介素4(A)、白介素6(B)和巨噬细胞炎性蛋白2(C)的浓度。样品是从局部治疗实验采集的(见图2)。在TDI攻击的小鼠耳朵中，白介素4、白介素6和巨噬细胞炎性蛋白2显著增加。AWD 12-281(1％)可降低轻微增加(IL-4、MIP-2)或显著减少(IL-6).Cilomilast(3％)以及二氟松(0.05％)可显著降低所有介质的浓度。与TDI处理过的动物相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(每组n＝6(TDI＝12))。
图6PDE4抑制剂对小鼠中TDI诱导的耳肿胀的作用。小鼠耳朵是用0.5％TDI处理的。1小时后(灰条)，用3％AWD 12-281、10％cilomilast处理这些小鼠或不处理(TDI).24小时后，测定耳肿胀(黑条)。而AWD 12-281可显著减少耳肿胀，cilomilast则没有表现出显著的抑制作用(p＝0.09)。
实施例1.材料和方法1.1 致敏过程雌性BALB/c-小鼠是从Charles River(Sulzfeld，Germany)获得的，8周大(体重20g)。所有动物都是健康的且在笼中饲养，每个笼子6只小鼠，温度22℃，12-h光照/黑暗-循环。可随意获得水和标准饮食(Altromin，Lage/Lippe，Germany)。
适应1周后，剪开腹部皮肤并用Veet脱毛。随后，用胶带共10次将腹部皮肤的表皮角质层剥去。为了进行有效致敏，在接下来的4天里，将100μl 5％TDI丙酮溶液用于剥下来的表皮。
21天后，通过在左耳的内表面和外表面上给予10μl 0.5％TDI的丙酮溶液而加强变应性反应，以检验致敏状态。攻击之前以及攻击后24小时，用cutimeter(7309型，Mitutoyo，Neuss，Germany)测量耳朵的厚度。通过比较攻击之前与攻击后24小时的值而计算肿胀。与早期评价的个体基础值(约230μm)相比，攻击后24小时的平均肿胀差值小于20％的动物被排除，这是因为它们未被致敏。根据其它小鼠的肿胀强度而将它们平均分配到治疗组(n＝6)中，使每组均包括应答不同程度的动物。它们要休息到7天后耳朵的厚度已经几乎达到正常水平。为了排除耳朵上剩余的变应原，将没有处理过的右耳用于主要实验。
1.2 局部应用其中一组小鼠(n＝6)没有被致敏和攻击。第二组(n＝12)是通过给右耳20μl(内表面和外表面两侧各10μl)0.5％TDI的丙酮溶液而局部攻击的。TDI攻击前2小时，将20μl(内表面和外表面两侧各10μl)AWD12-281(1％＝200μg)或20μl cilomilast(3％＝600μg；溶于丙酮/DMSO9∶1中)给予第三组和第四组的右耳。二氟松(20μl，0.05％＝10μg，溶于丙酮中)用作肾上腺皮质激素的阳性对照(n＝6)。在TDI攻击后24小时通过颈部脱位处死这些小鼠并采集耳朵(见下面)。
为了模拟治疗条件，在TDI攻击后1小时，即测量耳朵厚度后，其它3组(n＝6)直接局部接受AWD 12-281(1％)、citomilast(3％)或二氟松(0.05％)。且测量TDI攻击后5和24小时的耳朵厚度。
第一次攻击后5周，再次攻击用AWD 12-281(1％)和cilomilast(3％)“治疗性”处理的动物。攻击前，用AWD 12-281(3％)治疗其中一组。
此外，进行实验以获得有关AWD 12-281在长期与TDI接触的模型中的治疗性作用。因此，在120天内，以10天为间隔，用100μl 0.5％TDI处理10只小鼠的腹部皮肤。最后一次腹部TDI处理后10天，用20μl 0.5％TDI攻击小鼠左耳，耳的外表面和内表面分别用10μl。TDI攻击后1小时，5只小鼠用AWD 12-281(3％)处理，5只小鼠假处理。攻击之前以及攻击后1、5和24小时，测量耳朵的厚度。
1.3 细胞因子的测定将所采集耳朵的一部分固定在4％甲醛中用于组织学切片，并用苏木紫-曙红染色，显示皮肤厚度和粒细胞积聚。这些参数是在40倍放大的条件下在10个视野中测量的。采样后，立即将剩余组织骤然冷冻并贮存在液氮中。为了测定生化参数，在液氮下将小鼠耳朵匀化。将匀浆放在200μl RPMI 1640培养基中并加入蛋白酶抑制剂Pefabloc(1mmol)，将样品混合在一起。离心后(10000g，10分钟，4℃)，收集上清液并测定蛋白含量。将样品-80℃贮存，直到测定细胞因子。使用可商业得到的试剂盒，按照制造商的说明，通过ELISA测量样品中的白介素(IL)4、IL-6和MIP-2。
1.414C AWD 12-281通过鼠背部皮肤渗透14C AWD 12-281通过鼠背部皮肤渗透的能力是在渗滤池(Franzcell)中试验的。将干燥的剪下来的鼠背部皮肤放在渗滤池上，使1.5cm(直径)的皮肤一侧与温热的(34℃)的缓冲液(牛血清)接触。将15μl(110322970dpm)的14C AWD 12-281(溶于丙酮/DMSO 1∶1中)涂在剪下来的皮肤上。在第15、60、120、180、240、300、360分钟采集样品并在β计数器(Beckman，Munich，Germany)中测量放射性。实验进行两次。
1.5 试剂TDI是由Sigma-Aldrich Chemie(Deisenhofen，Germany)提供的。AWD12-281、14C AWD 12-281和cilomilast是从AWD(Dresden，Germany)获得的。丙酮、PEG200和DMSO是从Merck(Darmstadt，Germany)购买的；甲醛溶液是从Fluka(Deisenhofen，Germany)购买的，Miglyol和羟乙基纤维素是从Caesar & Loritz(Hilden，Germany)购买的且RPMI 1640培养基是从Biochrom(Berlin，Germany)购买的。用于测定细胞因子的ELISA是从R & D Systems(Wiesbaden，Germany)购买的。Pefabloc是从Boehringer Mannheim(Germany)购买的。脱毛霜(Veet)是Reckitt & Colman(Hamburg，Germany)的商标。胶带(Tesafilm)是从Beiersdorf(Hamburg，Germany)获得的。用Biorad测(Munchen，Germany)蛋白含量。
1.6 统计学评价结果以平均值和标准偏差表示(SE)。通过Mann-Whitney试验(U-试验)检查不同治疗组的显著性差异。因为TDI处理过的对照小鼠要与3-5个不同的组进行比较，因此在绝大多数实验中，TDI治疗过的小鼠数量都是双倍的(n＝12)。
2.结果2.114C AWD 12-281通过鼠背部皮肤渗透在两个实验中，在缓冲液中测量到的放射性增加表明AWD 12-281的皮肤渗透。使用后360分钟测量的放射性量类似总活性的0.22和0.08％(图1)。
2.2 局部给药小鼠耳肿胀TDI-攻击后1、5和24小时，对照小鼠的耳朵厚度表现出约30％、20％和60％的平均增加。当TDI攻击前2小时给药时，局部给药的AWD12-281(1％)、cilomilast(3％)和二氟松(0.05％)可在所有测量时间显著抑制TDI-诱导的肿胀(图2)。
用于试验AWD 12-281治疗作用的组在TDI攻击后1小时，即给药前立即表现出25-30％的肿胀。给药后，TDI攻击后5小时，没有观察到显著的进一步肿胀且不同治疗组没有显著差异。然而，攻击后24小时，AWD 12-281以及二氟松都可显著抑制TDI诱导的耳肿胀。Cilomilast可诱导轻微但不显著的肿胀减轻(图3)。
在长期(120天)致敏的最后实验中，将TDI涂在耳朵上可在攻击后1小时诱导耳朵厚度增加近40％。局部给药的AWD 12-281(3％)，在攻击后1小时“治疗性”应用的，在攻击后5小时诱导轻微的抑制。与没有治疗过的对照组相比，在攻击后24小时，AWD 12-281可几乎消除肿胀(图4)。
组织学检查TDI攻击后24小时，对小鼠耳朵皮肤进行的组织学检查显示不同程度的水肿和炎性细胞(主要是粒细胞)流入。AWD 12-281、cilomilast和二氟松可显著抑制这些炎性过程(表1)小鼠皮肤中的炎性介质在第一次治疗后5周再次攻击的小鼠耳朵中，细胞因子浓度通常较高。由于耳部皮肤中还残留有炎性细胞，因此这是显而易见的。这些结果分别在表2中提供(TDI与AWD 12-281 3％相比)。
攻击后24小时，TDI处理过的小鼠皮肤中的IL-4显著增加(图5a)。1％AWD 12-281显示出轻微的抑制作用，而3％AWD 12-281(表2)、cilomilast(3％)和二氟松(0.05％)均可显著抑制这种增加。
攻击后24小时，TDI还可显著增加IL-6的浓度。AWD 12-281(1％、3％)、cilomilast(3％)和二氟松(0.05％)可显著抑制这种反应。AWD12-281(3％)、cilomilast和二氟松的抑制作用是可以进行比较的，而AWD 12-281(1％)只显示出轻微的作用(图5b和表2)。
MIP-2，人IL-8的功能性同系物在TDI攻击后也增加。而1％AWD12-281可轻微降低这种增加，3％AWD 12-281、cilomilast(3％)和二氟松(0.05％)可显著降低MIP-2浓度的增加(图5c和表2)。
3.讨论进行研究以试验PDE4抑制剂对TDI诱导的小鼠耳肿胀的作用。给予皮肤的TDI主要诱导Th2-型细胞因子介导的反应，这是通过与TDI接触动物的活化淋巴结细胞中白介素4和10的含量较高而干扰素α水平较低加以证实的(Dearman等人，1996，Hayashi等人，2001)。我们自己的结果表明其它细胞因子例如IL-1β、IL-6和MIP-2也涉及TDI的变应性/炎性皮肤反应。促炎细胞因子的增加还伴有炎性细胞像嗜中性白细胞和嗜酸性粒细胞(表1)的流入以及不同程度的水肿。因此，耳肿胀可用作功能性参数。
进行AWD 12-281的皮肤渗透性试验。在我们的实验中，AWD 12-281可被很好地吸收且能够渗透到缓冲液中。6小时后观察到的分别为0.08和0.22％的累积吸收比氢化可的松的吸收高10倍，这是在Franz渗滤池中相对于人类皮肤测量的(Hueber等人，1994)。
在TDI攻击之前，使用PDE4抑制剂进行局部治疗的结果证实了先前的发现(Ehinger等人，2000)。在该研究中，以较低剂量给予AWD12-281，从而考虑PDE4的不同IC50。AWD 12-281的IC50较之cilomilast约低10倍(Griswold等人，1998，Kuss等人，2002)。
与先前的结果相反，通过改变致敏方案可获得更加不同的阳性对照。通过重复使用本研究中的致敏方案，可在攻击后24小时再现并使对TDI的高度反应标准化(没有给出数据)。由于该时间点的高度反应，我们能够检测大量细胞因子。为了更接近临床环境，决定在已经设置的变应性/炎性反应中检测PDE4抑制剂的作用。因此，PDE4抑制剂是在TDI攻击后1小时给予的，其中炎性过程的开始通过30％的平均耳肿胀反映。虽然以较低剂量(1％)给药，但是AWD 12-281还是可在攻击后24小时显著降低对TDI的炎性反应。这是通过下列研究加以证实的，其中检测了与TDI长期接触的结果。长期接触的其中一个结果是攻击后1小时耳肿胀增加(图4)，这可能是由于更大程度的IgE介导的反应(Scheerens等人，1999)。在该长期接触的研究中，以较高浓度(3％)给药时，AWD 12-281几乎可消除TDI诱导的肿胀(图4)。对使用AWD 12-281治疗过的小鼠进行的组织学检查表明-与阳性对照形成鲜明对比-炎性细胞和血管渗漏几乎完全消失(没有给出)。
为了检测造成TDI诱导的耳肿胀的炎性介质，测量处理过的小鼠耳朵中的细胞因子白介素(IL)4、IL-6和MIP-2。
IL-4的过量产生在特应性皮炎患者的严重受损的皮肤损害处是很明显的(Hanifin等人，1996，Spergel等人，1999)。因此我们对于TDI对IL-4在小鼠皮肤中产生的影响很感兴趣。皮肤中IL-4的来源是有限的，因为角质形成细胞和朗格罕氏细胞不能产生这种细胞因子(Shreedhar等人，1998，Morita等人，2001)。因此，有趣的是这种免疫作用可在阳性对照中见到。肥大细胞(Harvima等人，1994；Dastych等人，1999)和Th2细胞的流入(Shreedhar等人，1998)很明显是皮肤中IL-4的来源。Cilomilast体内抑制IL-4的能力也已经在慢性噁唑酮诱导的接触敏感性模型中加以证实(Griswold等人，1998)。AWD 12-281(1％)所致的不充分调节作用是由于剂量较低，因为3％AWD 12-281可导致IL-4浓度的80％抑制(表2B)。
描述了体外IL-6由于TDI而升高(Mattoli等人，1991)。IL-6是在炎性刺激后由角质形成细胞分泌的(McKenzie等人，1990)。PDE4抑制剂对IL-6释放的抑制也相对于LPS刺激的巨噬细胞而描述(Kambayashi等人，1995)。
MIP-2是嗜中性白细胞趋化性的重要细胞因子。这里证实了TDI诱导的耳肿胀连同嗜中性白细胞的大量流入。Cilomilast、二氟松和AWD 12-281(3％)的抑制作用可解释用PDE4抑制剂或糖皮质激素治疗后嗜中性白细胞流入减少。
这些结果共同表明AWD 12-281以及cilomilast可抑制变应性皮炎模型中的炎性反应。通过局部途径给药的AWD 12-281的抗炎反应是可靠的且与1％相比，3％给药的抑制作用明显更高(图3和4)。虽然口服和腹膜内途径给药的cilomilast(3％)也具有抑制作用，但是当在TDI攻击后给药时缺少显著的抑制作用(图3)。考虑到变应性反应的治疗在临床上比预防性给药更重要，因此这些数据可表明AWD 12-281的优点和相关的羟基吲哚化合物可治疗皮肤病，特别是皮肤变应性/炎性反应。
表1TDI攻击后24小时，小鼠耳朵中细胞流入的组织学检查。组织样品是从局部治疗实验采集的(见图2)。
表2A)TDI攻击后24小时的耳肿胀和TDI攻击后24小时，用AWD12-281(3％)治疗后，匀化小鼠耳朵中IL-4、IL-6和MIP-2(μg/400g蛋白)的平均值(±s.e.平均值)，**P＜0.01。
B)AWD 12-281(3％)、cilomilast(3％)和二氟松(0.05％)抑制作用的比较(TDI诱导的合成的平均抑制(％))。
A)
B)
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权利要求
1.一种用于治疗皮肤病的方法，包括对有此需要的受治疗者局部给予治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐 其中R1是(i)直链或支链的-C1-12-烷基或单-或多不饱和的-C2-C12烯基，所述基因任选被下列基团单-或多取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1- 6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO3H、-SO2R6、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R6、-COOH、-(CO)R6、具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，其中C6-14芳基和碳环-及杂环取代基本身可任选被R4单-或多取代，(ii)具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环或具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，或具有3-10个环原子的碳环-或杂环饱和的或单-或多不饱和的螺环，其中杂环系统包含1-6个杂原子，所述杂原子优选N、O和S，所述环任选被下列基团单-或多取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO3H、-SO2R6、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R6、-COOH、-(CO)R6、具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，其中C6-14芳基和碳环-及杂环取代基可任选被R4单-或多取代，R5是具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环或具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，或具有3-10个环原子的碳环-或杂环饱和的或单-或多不饱和的螺环，其中杂环系统包含1-6个杂原子，所述杂原子优选N、O和S，所述环任选被下列基团单-或多取代-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO3H、-SO2R6、-OSO2C1-6烷基、-OSO2C6-14芳基、-(CS)R6、-COOH、-(CO)R6、具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环、具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S，其中C6-14芳基和碳环-及杂环取代基可任选被R4单-或多取代，条件是R5包含选自-F、-Cl、-Br、-I的至少一个取代基；R2、R3是氢或-OH，其中两个取代基中至少有一个必须是-OH；R4是-H、-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-NHCOR6、-NO2、-CN、-COOH、-(CO)R6、-(CS)R6、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O(CO)R6、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基、-SOR6、-SO2R6、-C1-C6-烷基，其中每个芳基或烷基都可被-OH、-F、-Cl、-Br、-I单-或多取代；R6是-H、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14芳基、-N(C6-14芳基)2、-N(C1-6烷基)(C6-14芳基)、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14芳基，直链或支链的-C1-12-烷基，单-或多不饱和的、直链或支链的-C2-12-烯基，具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S；A是一个键，或-(CH2)m-、-(CH2)m-(CH＝CH)n-(CH2)p-、-(CHOZ)m-、-(C＝O)-、-(C＝S)-、-(C＝N-Z)-、-O-、-S-、-NZ-，其中，m、p＝0-3且n＝0-2且Z是-H、或直链或支链的-C1-12-烷基，单-或多不饱和的、直链或支链的-C2-12-烯基，具有3-14个环原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环原子和1-6个杂原子的单-、二-或三环饱和的或单-或多不饱和的杂环，所述杂原子优选N、O和S；B是碳或硫，或-(S＝O)-；D是氧、硫、CH2或N-Z，其中，如果B是碳，则D是S或CH2；E是一个键，或-(CH2)m-、-O-、-S-、-(N-Z)-，其中m和Z具有上面已经描述过的含义。
2.根据权利要求1所述的方法，其中R5选自具有至少一个卤素取代基的单环饱和的或单-或多不饱和的碳环和杂环。
3.根据权利要求2所述的方法，其中R5选自具有至少一个卤素取代基的单环芳族碳环和杂环。
4.根据权利要求3所述的方法，其中R5是具有至少一个卤素取代基的吡啶环。
5.根据权利要求3所述的方法，其中R5是具有至少一个卤素取代基的苯环。
6.根据权利要求1所述的方法，其中R1选自被任选取代的C1-C12烷基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中R1选自被任选取代的单环饱和的或单-或多不饱和的碳环或杂环。
8.根据权利要求1所述的方法，其中R2是OH且R3是H。
9.根据权利要求1所述的方法，其中A选自-(C＝O)-和-(CHOH)-。
10.根据权利要求1所述的方法，其中B是C。
11.根据权利要求1所述的方法，其中D是O。
12.根据权利要求1所述的方法，其中E是-(N-H)-。
13.根据权利要求1所述的方法，其中化合物(I)是(N-3，5-二氯-4-吡啶基)-2-[1-(4-氟苄基)-5-羟基-1H-吲哚-3-基]-2-氧代乙酰胺)。
14.根据权利要求1-13任何一项所述的方法，其中所述皮肤病是变应性和/或炎性疾病。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述变应性疾病是变应性皮炎。
16.根据权利要求1-15任何一项所述的方法，其中将所述化合物给予患病的皮肤区域。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在变应性攻击后给予所述化合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在变应性攻击后最长达48小时给予所述化合物。
19.根据权利要求1-18任何一项所述的方法，其中所述化合物(I)与至少一种其它药剂共同-给药。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述其它药剂是刺激cAMP产生的药物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述其它药剂是皮质类固醇。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗炎性和/或变应性皮肤病的方法，包括局部给予取代的羟基吲哚。
文档编号A61K45/00GK1681500SQ03821520
公开日2005年10月12日 申请日期2003年7月10日 优先权日2002年7月11日
发明者C·伦德菲尔德特, M·基伊茨曼恩, J·霍普曼恩, W·贝梅, H·库斯, N·霍夫根 申请人:埃尔比昂股份公司