苯乙酰基-(n-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(n-甲基)哌嗪的盐的制作方法

专利名称：苯乙酰基-(n-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(n-甲基)哌嗪的盐的制作方法
技术领域：
本发明是关于苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[化学名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸]的盐，及该盐的制备过程、以及含该盐作为活性成分抑制、改变或防止细胞粘附以及由细胞粘附所介导的病理过程的药物组成，及使用该些盐抑制和防止细胞粘附以及由细胞粘附所介导的病理过程的方法，还包括其用于生产诸如人类等温血动物的治疗或预防剂作为药物的用途，以及制造药物的用途。其特别适用于许多炎性疾病和自身免疫性疾病的治疗。
背景技术：
细胞粘附是细胞之间发生相互联系、细胞移向特定的靶组织或滞留在细胞外的基质中的过程。这种粘附可能需要细胞的激活、迁移、增殖和分化。细胞与细胞以及细胞与基质间相互作用是通过数个细胞粘附分子族，包括筛选因子、整合素和免疫球蛋白所介导的。正如此，细胞粘附是许多生物学现象所蕴涵的基本原理之一，并且在许多病理过程中都发挥着作用，例如在哺乳动物中存在的炎症反应和免疫反应。
总蛋白群中称为整合素的蛋白的是造血细胞之间以及其与微环境之间发生粘附作用的关键介质。[ME.Hemler“整合素族中的VLA(极迟抗原)蛋白结构、功能以及在白细胞内的作用”。Ann.Rev.Immunol.8，P365，1990]。整合素是由a和ss两个亚基组成的非共价的杂合二聚体复合物。目前至少已发现16种不同的a亚基以及至少9种不同的ss亚基。
VLA-4整合素是在CD34表达的造血干细胞上发现的最早期的粘附受体之一(Teixido et al.，J.Clin.Invest.，90358-367，1992)。三个不同的研究小组各自独立地发现了VLA-4整合素杂合二聚体，并且鉴定为淋巴细胞的表面抗原(Sanchez-Madrid et al.，Eur.J.Immunol.，161343-1349，1986；Claybergeret al.，J.Immunol.，1381510-1541，1987；Hemler et al.，J.Biol.Chem.，26211478-11485，1987)。VLA-4的配体包括血管粘附分子-1(VCAM-1)和纤维蛋白结合素的CS-1功能区。VCAM-1是免疫球蛋白系列成员之一，并且在体内由炎症部位的内皮细胞所表达(见R.Lobb et al.“血管细胞粘附分子1”于细胞与分子炎症的机理，C.G.Cochrane and M，A.Gimbrone，Eds.；Acad.Press，SanDiego，1993，P.151.)。VCAM-1是由血管内皮细胞对炎症前细胞因子的响应所产生的(见A.J.H.Gearing and W.Newman，“疾病中的循环粘附分子”，Immunol.Today，14，506，1993)。通过改变纤维结合素的内部连接而产生的CS-1含有25个氨基酸序列(综述见R.O.Hynes“Fibronectins.”，Springer-Velag，NY，1990)。在炎症情况下VLA-4/CS-1相互作用已经提出(见M J.Elices细胞粘附与人类疾病中的“整合素oc4ssl(VLA-4)作为治疗靶点”，Ciba Found.Symp.，John Wiley & Sons，NY，1995，P.79)。
抗VLA-4单克隆抗体(“mAb’s”)在体外与体内已显示出能够抑制依赖VLA-4的细胞粘附反应。体内试验结果提示抑制依赖于VLA-4的细胞粘附反应有可能防止、抑制或改变某些炎症和免疫反应的病理过程。
(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸及其类似物的实例在以下的专利申请中已披露WO0002903，WO9515973 andWO9842656。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的具有药用价值的苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪的盐。
本发明的另一目的是提供上述结构(I)化合物的盐所制备的药用制剂。
本发明进一步的目的是提供上述结构(I)化合物的盐在制备治疗炎症疾病，自身免疫性疾病，关节炎、哮喘、过敏性疾病、多型性硬化症、中枢神经炎的药物中的应用。
本发明是由下面的结构(I)所表达的苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[化学名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸]所形成的盐的一种化合物，这种盐的特性在于由一种无机酸或有机酸与结构(I)的化合物反应所形成；或者这种盐的特性在于由一种金属离子或有机阳离子的碱与结构(I)的化合物反应所形成； 上述的酸是选自无机酸或有机酸且该酸可与结构(I)化合物能形成药学上可接受的盐；上述的碱是选自金属离子碱或有机阳离子碱且该碱可与结构(I)化合物能形成药学上可接受的盐；合适的无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，亚硫酸和亚磷酸，最好是盐酸；合适的有机酸包括琥珀酸，马来酸，醋酸，富马酸，枸橼酸，酒石酸，草酸，苯甲酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，甲磺酸，乙磺酸或萘磺酸，最好是甲磺酸；合适的金属离子碱的离子是铝离子，碱金属离子如锂，钠或钾，碱土金属离子如钙或镁；最好是钠和钾；合适的有机阳离子碱的离子是氨离子或取代的氨离子，像那些低级烷烃的氨如三乙胺，羟基烷烃氨如2-羟基乙胺或者吡啶类。
本发明提供了(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸的盐、以及在研究、诊断、治疗和预防与细胞粘附有关的疾病时有可能用作为的制剂与方法。与细胞粘附有关的疾病有(但不仅限于此)关节炎、哮喘、过敏性疾病、成人呼吸窘迫综合征、心血管疾病、血栓或有害的血小板聚集反应、同种移植排斥反应、肿瘤、银屑病、多型性硬化症、中枢神经炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎以及与炎症有关的肾脏病、糖尿病、眼炎(例如葡萄膜炎)、动脉粥样硬化、各种炎症以及自身免疫性疾病。
结构(I)的盐化合物可单独或与一种或多种治疗剂配伍使用，配伍治疗可用固定的形式或用本发明中的化合物与一种或多种治疗剂错开使用或独立的一种使用，或以固定的配伍与一种或多种治疗剂配伍使用。结构(I)的盐化合物不局限于，尤其是肿瘤治疗中与化疗，放疗，手术或与这些手段的混合相配伍的使用。上述方式根据治疗方式的情况，长期治疗与佐剂治疗是相同可能的。其它可能的治疗是肿瘤退化后保持病人的身份，或甚至化学预防性治疗，例如，病人自担风险。
本发明的化合物不仅用于人类且用于其它热血动物，例如商业上有用的动物。该化合物在以上描述的实验中可用作参考标准与其它化合物对照。
本发明的化合物可能是结晶体或非结晶体，如果是晶体应可以随意水合或溶于水。这项发明包括了它的范围化学计算水合物、这个化合物有不确定量的水。
本发明延续至所有结构(I)的盐化合物的异构体形式，空间异构体和几何异构体，包括对映体和其混合物，如消旋体。不同的异构体形式可以用常规方法分离或拆分，指定的异构体可以用常规合成方法或特殊空间合成或不对称合成或酶催化合成所获得。
可以用各种人工方法来制备与结构(I)的盐化合物有关的无毒前体药物。精通此术的人同样可以认识到很多种无毒的溶剂可以用来溶解发现的化合物，例如水，乙醇，无机油，植物油，二甲亚砜。
具有结构(I)的盐化合物可以通过吸入、喷雾、或直肠的方式，经口、局部或肠外注射给药，药物的成分应该是方便无毒的合适媒介物、辅药和赋形剂。经口给药的剂型是药片、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂等。这里所用的肠外注射方法包括皮下注射、皮肤内、血管内(例如静脉内)、肌肉内、脊柱、鞘内注射或其他类似的注射或灌输技术。此外，这里提供了一种组合包含了结构(I)的盐化合物和适用的载体。具有结构(I)的盐一种或多种化合物应该有一种适合口服的剂型，例如药片、药剂、锭剂、水或油的悬浮液、散粉或细粒、乳浊液、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。
用于口服的药品可采用任何已知的制药方法生产，药品应包含一种以上的下列精选成分甜味剂、香精、色素、和防腐剂，这样可以提供一个精致的成品。药片包含活性成分，药片是含有无毒适用的赋形剂的混合物，这些赋形剂使得药片易于生产。这些赋形剂可以是惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒状和崩解剂如玉米淀粉或藻酸；粘合剂例如淀粉、动物胶；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。药片可以不包衣或包衣，众所周知的包衣技术推迟了药物在胃肠道的崩解和吸收，使其在长时间里维持活性，这些推迟分解的物质如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等。
用于口服的剂型可以是硬动物胶做成的胶囊，其活性成分混合在惰性固体稀释剂中，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者是软动物胶胶囊其活性成分混合在水或油介质中，例如花生油，液体石蜡或橄榄油。制造包含活性成分的水性悬浮液应用适合制造用的赋形剂。这些赋形剂是悬浮剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素钠、氢丙基甲基纤维素钠、藻酸钠、聚乙烯吡咯酮、西黄耆胶和阿拉伯胶；分散剂和润湿剂应该是一种自然形成的磷脂，例如卵磷脂；或者是脂肪酸与烯化氧化物的浓缩物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或者是具有长链脂肪族醇的乙烯氧化物浓缩物，例如17碳乙烯氧基16醇；或者是乙烯氧化物与脂肪酸和己糖醇中部分酯的衍生物例如聚氧乙烯山梨糖醇；或者是乙烯氧化物与从脂肪酸和己糖醇酐中衍生出的部分酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇。水性悬浮液用样应包含一种或多种防腐剂，例如乙烯基、正丙基、对羟基苯酚，也应包含一种或多种色素，一种或多种香精和一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
油性悬浮液的形成是活性成分悬浮在植物油中，例如花生油、橄榄油、芝麻油、椰子油或者是象液体石蜡一样的矿物油。油性悬浮液应有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡、十六烷基乙醇。上述甜味剂和调味剂应该被加到规定的可口的口服成药中。这些成分应该通过加入抗氧化剂如Vc，来达到防腐的目的。
散粉和颗粒经水而成的悬浮液，再加上一些粉末或湿的药剂、悬浮液药剂以及至少一种防腐剂，制成的混合物可以提供活性物质。具体合适的粉末、湿剂与悬浮液前文已经列明，另外一些添加剂，如甜味剂、香精、色素等等也可以加进去。
这种新药的有效成分也可以作成乳浊液的形式，油剂可以选用菜油(如橄榄油、脂肪族醇)或矿物油(如液体石蜡)。合适的乳化剂是自然形成的乳胶，如阿拉伯胶、西黄耆胶；自然形成磷脂如大豆、卵磷脂以及从脂肪酸中衍生而来的酯类；酐例如山梨酸醇。这种乳浊液也可以假如甜味剂和香精。
糖浆和香味由甜味剂产生，甜味剂可以是甘油、1、2-丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。这一类的药剂也可以加入缓释剂、防腐剂、香精和色素。
这种新药的有效成分还可以制成栓剂，适用于直肠和阴道。药栓由药物和无刺激性的成型剂混合而成。这种成型剂在常温下是固体，而在直肠或阴道的温度里则变成液体，这样药栓就融化了并释放出药性。此类原料包括可可油和聚乙二醇。
这种药物也可以作成无菌的、可注射的水状或油状悬浮液。这种悬浮液可采用已知的工艺使用前文提到的合适的粉末或湿剂与溶液构成。这种无菌的可注射的成品也可以是无菌的稀释液或溶液，例如1、3-butanediol溶液。可采用的赋形剂和溶剂是水、林格溶液和等渗性的氯化钠溶液，此外无菌的固态油剂通常被用来作为溶剂或悬浮液介质。包括人造甘油酯或甘油二酯在内的任何无刺激性的固体油剂都普遍适用。另外象油酸这类的脂肪酸有利于注射该种药品。
该种药品也可被精通此术的人用于经皮注射(Chien；WO94/04157)。
结构(I)的盐化合物可以通过无菌载体不经肠道使用。附着在载体上并经浓缩的药物能够悬浮或溶解在载体中，有利的是一些辅药诸如局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂也能够溶解在载体中。
如果用于动物身上，这种药物可以加在动物的食物和水中。药品必须便于和动物的饮食结合起来，以至于动物吃东西的时候就能够摄入适当的药物。如果把药作成一种预先混合物就更便于加到水和食物中。
这里所谈到的关于结构(I)的盐化合物的用法中，每天的服用剂量最好根据体重从0.01mg/Kg到200mg/Kg。每天的注射剂量包括静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射和非肠道注射以及灌肠术等需根据整个体重从0.01mg/Kg到200mg/Kg。每天的局部用量最好从0.01mg到200mg每天一到四次。经皮使用的浓缩物最好保持一天的计量在0.01-200mg/Kg。每天吸入使用的量最好根据体重从0.01mg/Kg到200mg/Kg。
当然对于特别的病人也可以使用不同的剂量，这主要取决于下列因素具体的有效成分、年龄、体重、健康状况、性别、食量、服药时间、服药方式、排泄率、用药禁忌。
更好的此类化合物应具有某些药理学特性，这些特性包括口服生物利用率、低毒性、低血清蛋白凝固性和较好的体内体外半衰期及其他。
分析法可用于预测所需要的药理学属性。用于预测生物利用率的方法包括通过人体肠内单层细胞进行运输，如Caco-2单层细胞。人工肝细胞毒理检验可用于预测化合物的毒性。该化合物对血黏度的影响可通过对实验室的动物静脉注射该药之后进行检测。
血清蛋白粘合度可通过蛋白质粘合度分析来预测。相关分析可参见Oravcova评论。
化合物的半衰期和服用的频率成反比。体外半衰期可通过体外代谢的半衰期来分析预测。
动物模型小鼠哮喘模型的评价一.材料与方法1.试剂配置2mg/mL卵白蛋白卵白蛋白(V级)溶于10％新鲜制备的氢氧化铝凝胶，临用前配。
VLA-4拮抗剂溶液将VLA-4拮抗剂溶液生理盐水中，配成所需溶度。
1％卵白蛋白将卵白蛋白溶于0.9％的生理盐水中，配置成1％的卵白蛋白溶液，临用前配置。
2.动物致敏致敏组用新鲜配置的2mg/mL卵白蛋白作皮下注射，空白对照组仅用10％的氢氧化铝凝胶。每只小鼠在两后足跖、两腹股沟、背部两点、腹腔，共10点，每点皮下注射0.05ml，共计0.35ml。
3.分组及给药实验共分六组即①正常对照组，n＝7，0.9％的生理盐水；②模型组(MD)，n＝10，0.9％的生理盐水；③地塞米松组(1mg/mL)，n＝9；④息喘肽低剂量组(1mg/mL)，n＝11；⑤息喘肽中剂量组(3mg/mL)，n＝11；⑥息喘肽高剂量组(10mg/mL)。上述各组于致敏三周后开始给药，以雾化吸入器雾化各种药物，将小鼠置于2L的密闭玻璃罩内，吸入雾化液20分钟，每日一次，共7天。
4.卵白蛋白攻击致敏三周后，每天给药后1小时雾化吸入10mg/mL卵白蛋白30分钟。
5.肺机械功能测定最后一次卵白蛋白攻击后24小时。腹腔注射250mg/mL乌拉坦4ml/kg麻醉，固定后，行气管插管、颈外静脉插管、胸膜腔插管。利用MedLab生物信号采集处理系统记录给氯化乙酰甲胆碱(Mch)前小鼠潮气量、气道流速和跨肺压，作为基础值。然后给小鼠一次静脉注射溶度为0.125μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg Mch，观察三分钟内小鼠气道流速、潮气量和跨肺压的变化。
6.支气管—肺泡灌洗(BAL)测完气道高反应性的小鼠放血处死后，打开胸腔，结扎左支气管，用1.5ml生理盐水灌洗液灌洗右侧肺叶3次。
7.支气管—肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数和分类计数。
取BALF0.05ml，用白细胞计数液3倍稀释后行白细胞计数。剩余液体以500g离心10min，收集上清液，冻存于-70℃同时，取沉渣涂片，自然干燥，用瑞氏—姬姆萨染色后作白细胞分类计数。
8.肺组织病理切片制作与观察取左侧肺叶浸入10％福尔马林溶液固定3day后，取出肺组织，切取组织块2mm左右厚度制作组织切片，脱水、透明、包埋、切片，用苏木素—伊红染色后观察。根据支气管肺粘膜的嗜酸性粒细胞浸润及小气道重塑的严重程度进行分类。嗜酸性粒细胞浸润主要观察气道和血管之间区域和其在气道壁上的浸润情况，按照各个切片的浸润严重程度分成0~5级，作半定量分析。气道重塑我们选用内径和周长差不多的小气道作为观察对象，以小气道壁的厚度作为衡量指标。
9.统计方法实验数据以x±s表示，采用Sigma Stat统计软件包，用Student-Newman-Keuls比较各组间的差异性，P＜0.05表示有显著性差异。
二.结果1.VLA-4拮抗剂对致敏小鼠气道高反应的影响致敏小鼠在抗原攻击后再吸入Mch，呈剂量依赖关系诱导气道高反应性，与对照组比较，RLPC100(使RL增加100％所需要的Mch浓度)和CdynPC25(使Cdyn降低25％所需要的Mch浓度)明显减小，表明气道反应性明显增高。致敏三周后，每天给息喘肽1mg/mL、3mg/mL和10mg/mL雾化吸入20min，药后1h再雾化吸入卵白蛋白10mg/mL 30min，每天1次，共7d。结果显示VLA-4拮抗剂呈剂量反应抑制Mch诱导的小鼠气道高反应性。
2.VLA-4拮抗剂对致敏小鼠抗原攻击后BALF中白细胞总数及分类计数的影响模型组白细胞总数明显增高，与正常对照组差异显著。VLA-4拮抗剂10mg/mL与模型组比较差异显著(P＜0.05)，但VLA-4拮抗剂1mg/mL与3mg/mL组无显著性差异。模型组嗜酸性粒细胞计数较正常对照组明显增高。用药组嗜酸性粒细胞数目与正常组比较存在显著性差异，且VLA-4拮抗剂中剂量组和高剂量组嗜酸性粒细胞的数目与模型组相比存在显著性差异(P＜0.05)。
3.VLA-4拮抗剂对致敏小鼠支气管肺组织病理影响模型组小鼠肺部出现明显过敏性炎症表现，细支气管、小血管的管壁增厚，炎症细胞浸润，嗜酸性粒细胞数目明显增多，地塞米松组和VLA-4拮抗剂高剂量组肺部表现基本正常，只有轻微的病理变化，与模型组相比有明显的差异。而所有实验组与正常组相比，评分明显增加。
合成路线



具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
有关缩写代表了以下的化合物EDC盐酸1-(3-一二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺CH3CH2＝C＝NCH2CH2CH2N(CH3)2·HClHOBt1-羟基苯并三唑水合物Bzl苯甲基、苄基Boc-Phe-OH叔丁氧-甲酰基-苯丙氨酸Leu白氨酸、亮氨酸DIEA二异丙基乙胺Asp天冬氨酸实施例1苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪盐酸盐[化学名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸盐酸盐]步骤1.合成叔丁氧-甲酰基-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[Boc-Phe-(N-Me)哌嗪盐酸盐]用400ml二甲基甲酰氨(DMF)将40g(151mmol)Boc-Phe-OH溶于1000ml圆底烧瓶中，搅拌然后加入20.4g(151mmol)HOBt并溶解，用乙晴-干冰浴将混合物冷却至-30℃在加入28.9g(151mmol)EDC后再加入16ml(141mmol)的1-甲基哌嗪，将反应混合物升温至室温并放置过夜，减压除去DMF，向残留物中加入1000ml醋酸乙醋(EtOAc)，上述有机溶液依次用饱和的碳酸氢钠(300ml×3)、水(300ml×3)以及盐水(300ml)洗涤，然后再用硫酸镁进行干燥，过滤，蒸发后获得48.9g(141mmol，收率99％)的油状产物Boc-Phe-(N-Me)哌嗪。
步骤2.合成天冬氨酸(O-苯甲基)-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪盐酸盐[HCl·Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪]向48.99克(141mmol)Boc-Phe-(N-Me)哌嗪中加入350ml、4N的盐酸二恶烷溶液立即生成凝胶状固体，上述反应混合物于室温下静止6小时，使反应物完全反应掉，过量的HCl及溶剂蒸发除去，得到的固体产物用乙醚进行破碎(250ml×2)，得到40g(141mmol)HCl·Phe-(N-Me)哌嗪，收率100％。
向上述HCl·Phe(N-Me)哌嗪40g(141mmol)中加入500ml DMF，然后加入24.5ml(141mmol)DIEA以及46.5g(143mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH(第1步产物)，反应混合物溶液呈均相，将此溶液用丙酮-干冰浴冷却至-50℃，在加入27.3g(143mmol)EDC后加入19.3g(143mmol)HOBt，反应混合物升温至室温后过夜，减压除去DMF，向残留物中加入600ml醋酸乙醋，上述有机溶剂依次用饱和碳酸氢钠溶液(300ml×6)，水(300ml×3)以及盐水(300ml)洗涤，然后用硫酸镁进行干燥，过滤，蒸发后得到55g(100mmol)的半固体产物为Boc-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，收率71％，通过高效液相色谱(HPLC)检测其纯度为90％。
将25g(45.3mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪与150ml 4N HCl二恶烷溶液进行反应1小时后反应完全，过量的HCl溶液蒸发除去，生成的固体用250ml乙醚进行破碎，在通入氩气条件下过滤收集固体，得到白色的HCl·Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪固体22g，收率99.5％，纯度为86％。
步骤3.合成(N-甲基)-亮氨酸(O-苯甲基)-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪盐酸盐[HCl·(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪]将一个含有21g(43mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，11g(44.9mmol)Boc-(N-Me)亮氨酸，8.2ml(47.3mmol)DIEA以及200ml DMF的混合物于0℃下搅拌15min，然后向混合物中加9.5g(49.7mmol)EDC以及5.7g(42mmol)HOBt，0℃下搅拌反应混合物3小时，经HPLC检测显示反应完全，减压蒸发除去溶剂，将残留物用200ml醋酸乙醋稀释，上述醋酸乙醋溶液用碳酸氢钠水溶液洗两次，然后再依次用水，盐水洗涤，然后用硫酸钠干燥，浓缩溶液得到Boc-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪。
向上述生成物中加入100ml4N的盐酸二恶烷溶液，然后于室温下搅拌1小时，经HPLC检测显示反应完全，过量的HCl及溶剂通过蒸发除去，残留物用200ml乙醚破碎，在通以氩气的条件下过滤收集固体，得到26g(43mmol)HCl·(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，收率100％，纯度78％。
步骤4.合成苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-(O-苯甲基)天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪]将26g(43mmol)HCl·(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪以及20ml(115mmol)DIEA溶于450ml二氯甲烷(DCM)的混合物于0℃下搅拌15min并于0℃下在45min时间内滴加苯乙酰氯的DCM溶液(9.3ml，70mmol in 50ml二氯甲烷中)，通过HPLC确定反应完全，反应混合物依次用饱和碳酸氢钠溶液(100ml×2)，水(100ml×2)以及盐水(100ml)洗涤，然后用硫酸镁进行干燥，经过滤蒸发后得到29g(42mmol)的苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(Obrl)-Phe-(N-Me)哌嗪粗品，收率98％，纯度76％。
步骤5.合成苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-(O-苯甲基)天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪盐酸盐[苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪·HCl]将29g上述得到的产物通过下述方法转化成盐酸盐将上述生成物溶于200ml乙醚中，然后加入200ml HCl-乙醚溶液，反应混合物放置10分钟，除去上清液，固体再放200ml乙醚洗涤，除去上清液后将残留的乙醚蒸发除去。
上述得到的苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪盐酸盐通过以下几个重结晶方法过程进行纯化1)将上述盐酸盐溶于250ml丙酮中，然后加入250ml乙醚，将上述澄清液于-20℃下放置过夜，在通以氩气的条件下将固体过滤收集，用冷的丙酮/乙醚(1∶1，50ml×2)洗涤两次，然后将固体转移至烧瓶中，漏斗用甲醇冲洗，除去溶剂后得到15.5g，94％纯度的盐酸盐，回收率50％。2)第二次重结晶时用200ml丙酮∶乙醚(1∶1)同样处理，得到15.0g纯度为96.8％的盐酸盐，回收率为97.5％。3)第三次时使用280ml丙酮∶乙醚(1∶1)得到纯度为99.1％的盐酸盐13.8g回收率为95％。4)第四次时使用250ml丙酮∶乙醚(1∶1)，得到纯度为99.5％的盐酸盐13.4g，回收率为97％。
步骤6.合成苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪盐酸盐[苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪·HCl]将上述苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪盐酸盐(13.4g，19mmol)溶于400ml乙醇中，加入2g 10％的钯炭催化剂(Pd/C)，用氢气球向反应混合物中通入氢气进行氢化反应14小时，经HPLC检测表明反应进行完全，用0.2um的尼龙膜过滤除去催化剂，然后减压蒸发除去溶剂，得到的白色粉状固体，在真空炉中于42至43℃高真空度下进一步干燥5天，得到11.1g苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪盐酸盐，收率为95％，经HPLC检测，纯度为99.7％，质谱(M+1)608。
实施例2苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪钠盐[化学名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸步骤1.合成叔丁氧-甲酰基-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪[Boc-Phe-(N-Me)哌嗪钠盐]将30.0g苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBrl)-Phe-(N-Me)哌嗪盐酸盐(参见实施例1步骤5)混合于500ml醋酸乙醋中，将该溶液转移至1000ml分液漏斗中，向上述被中和的盐酸盐加入300ml饱和的碳酸氢钠溶液，充分混合后收集醋酸乙酯相，水溶液用150ml醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯相然后依次用水(250ml×2)以及盐水(250ml)洗涤，然后用硫酸镁进行干燥过滤，蒸发后得到27.0g(38.7mmol)苯乙酰基(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪，纯度为99.5％，回收率为95％。
将上述苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp(OBzl)-Phe-(N-Me)哌嗪(27g 38.7mmol)溶于800ml乙醇中，将上述溶液等体积地分装于两个1000ml烧瓶中，每个烧瓶中加入2g 10％的铂炭催化剂(Pd/C)，用两个氢气球向反应混合物中通入氢气进行氢化反应16小时，经HPLC检测表明两个烧瓶中的反应进行完全，用0.2um的尼龙膜过滤除去催化剂，合并两批滤液，再加入乙醇进行稀释至总体积为2200ml，然后减压蒸发除去溶剂，得到的白色固体基本上呈细粉状，得到23.5g(38.7mmol)苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪(上述通式I)。
将1g(1.6mmol)苯乙酰基-(N-Me)Leu-Asp-Phe-(N-Me)哌嗪与5ml乙醇混合然后加入2N NaOH 33微升于溶液中搅拌加热至40℃ 1小时，蒸发至干得一白色固体即为标题化合物。质谱(M+23)630。
实施例3苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪甲磺酸盐[化学名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸甲磺酸酸盐]
参照实施例2方法制备，最后使用一分子比甲磺酸代替NaOH得标题化合物，质谱(M+1)608。
实施例4苯乙酰基-(N-甲基)亮氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-(N-甲基)哌嗪琥珀酸盐[化学名(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸琥珀酸盐]参照实施例2方法制备，最后使用一分子比琥珀酸代替NaOH得标题化合物，质谱(M+1)608。
权利要求
1.下述结构(I)所形成的盐
2.根据权利要求1所述的结构(I)的盐是由一种无机酸或有机酸与结构(I)的化合物反应所形成的盐；或者是由一种金属离子或有机阳离子的碱与结构(I)的化合物反应所形成盐。
3.根据权利要求1和2所述的结构(I)的盐所用无机酸或有机酸可与结构(I)化合物能形成药学上可接受的盐；或者所用金属离子碱或有机阳离子碱可与结构(I)化合物能形成药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1和2所述的结构(I)的盐所用的与结构(I)的化合物反应所形成的盐的无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，亚硫酸和亚磷酸。
5.根据权利要求1和2所述的结构(I)的盐所用的与结构(I)的化合物反应所形成的盐的有机酸包括琥珀酸，马来酸，醋酸，富马酸，枸橼酸，酒石酸，草酸，苯甲酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，甲磺酸，乙磺酸或萘磺酸。
6.根据权利要求1和2所述的结构(I)的盐所用的与结构(I)的化合物反应所形成的盐的金属离子碱的离子是铝离子，碱金属离子如锂，钠或钾，碱土金属离子如钙或镁。
7.根据权利要求1和2所述的结构(I)的盐所用的与结构(I)的化合物反应所形成的盐的有机阳离子碱的离子是氨离子或取代的氨离子。
8.根据权利要求1和2所述的结构(I)的盐，选自(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸盐酸盐；(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸钠盐；(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸甲磺酸酸盐；(3S)-3-[(2S)-甲基-2-(N-甲基-2-苯乙酰氨基)戊酰氨基]-3-{N-[(1S)-2-(4-甲基哌嗪基)-2-氧代-1-苄乙基]甲氨酰基}-丙酸琥珀酸盐。
9.权利要求1至8项中任意一项的盐所制备的药剂，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂、栓剂、复方制剂。
10.权利要求1至8项中任意一项的盐在制备治疗炎症疾病和自身免疫性疾病的药物中的应用。
11.权利要求1至8项中任意一项的盐在制备治疗关节炎、哮喘、过敏性疾病、多型性硬化症、中枢神经炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明是关于苯乙酰基－(N－甲基)亮氨酸－天冬氨酸－苯丙氨酸－(N－甲基)哌嗪[化学名(3S)－3－[(2S)－甲基－2－(N－甲基－2－苯乙酰氨基)戊酰氨基]－3－{N－[(1S)－2－(4－甲基哌嗪基)－2－氧代－1－苄乙基]甲氨酰基}－丙酸]的盐，及该盐的制备过程、以及含该盐作为活性成分抑制、改变或防止细胞粘附以及由细胞粘附所介导的病理过程的药物组成，及使用该些盐抑制和防止细胞粘附以及由细胞粘附所介导的病理过程的方法，还包括其用于生产诸如人类等温血动物的治疗或预防剂作为药物的应用，以及制造药物的应用。其特别适用于许多炎性疾病和自身免疫性疾病的治疗。
文档编号A61P19/02GK1542006SQ20031010622
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年11月7日
发明者陈国庆, 濮存海 申请人:陈国庆