专利名称：Dc－sign阻断剂及其在预防或治疗病毒感染中的用途的制作方法
发明
背景技术：
领域本发明涉及用于预防或治疗哺乳动物的疾病的方法、用途和组合物，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由一种效应分子(effector molecule)与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合或相互作用所介导。效应分子可以是外来生物体的分子。外来生物体可以是病毒。
本发明还涉及用于鉴别组合物的组合物和方法，其中所述组合物可用于治疗哺乳动物疾病，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由一种效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
本发明还涉及将对象分子(subject molecule)导向表达DC-SIGN受体的细胞(例如树突细胞)的组合物和方法。这些组合物和方法基于导向复合物，其中一或多种对象分子共价结合于一或多种DC-SIGN阻断剂，且通过所述导向复合物的一或多个所述DC-SIGN阻断剂与DC-SIGN结合，所述对象分子被导向表达DC-SIGN受体的细胞。
背景技术：
登革热是一种急性发热性热带疾病，且引起该病的病毒是一种虫媒病毒，由蚊子传播。该疾病的载体是伊蚊属的蚊子，特别是埃及伊蚊(Aedesaegypti)，其最常将其幼虫产于居住地或居住地周围区域。引起疾病的病毒在1951被分离，已经分类为4种不同的抗原类型(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4)。该病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)的黄病毒属(genusflavivirus)。
超过20亿人口居住在疾病流行区，每年感染该病毒的人口被认为超过1亿。特别是登革热，因该病求治住院的人数每年为500000，且每年导致数万人死亡，大部分是儿童。
潜伏5到8天后通常突然出现临床症状，这些症状有，出现混合热型(undifferentiated fever)(DF登革热)，伴随严重的头痛、腰痛、肌肉和关节疼痛以及寒战。自发热期的第3到5天起，开始出现充血性斑丘疹，可持续3到4天(普通登革热(conventional dengue))。
严重的感染可导致出现出血综合征(DHF或登革出血热)，特点是血管通透性升高和凝血异常。尽管大多数患者的病情通常在一周内开始好转，但如出现低血容量休克则可以是致命的(DSS或登革热休克综合征)。这些并发症的发生可能是由于预先存在免疫力，这种免疫力是在初次感染一种不同的登革热病毒(不同血清型)时而获得的。具体而言，在感染登革热病毒的个体中鉴定到两种不同类型的血清学应答从未发生过黄病毒感染且未接受过针对另一种黄病毒(例如黄热病病毒、日本脑炎病毒)的免疫接种的个体会出现初次应答(primary response)，特点是缓慢产生对引起感染的病毒具有特异性的抗体；曾经发生过黄病毒(例如其他登革热血清型)感染或接受过针对另一种黄病毒的免疫接种的个体会出现二次应答(secondary response)，特点是迅速产生抗体。
感染因素是登革热病毒，其属于黄病毒科，黄热病病毒和日本脑炎病毒也属于黄病毒科(T.P.Monath等，(1996)Flaviviruses in B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howly等(eds.)“Fields Virology”PhiladelphiaLippincottRaven Press Publishers)。这些病毒具有单链正极性RNA(single-strandRNA with positive polarity)，其包含11000个核苷酸且编码一种大约3400个氨基酸的多蛋白。通过在共翻译和翻译后的病毒和细胞内蛋白酶裂解，其被分离成三种结构蛋白和七种非结构蛋白，即NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。NS1非结构蛋白由P.K.Russel等(J.Immunol.，(1970)，105，838-845)在1970年首次鉴定，并由G.W.Smith等(J.GenVirol.，(1985)，66，559-571)在1985年表征。这种糖蛋白在黄病毒属中高度保守(T.P.Monath已经提到)，特别是4种登革热病毒血清型中，这种糖蛋白存在一种细胞内形式和一种细胞外形式。这种细胞内形式被认为参与了病毒复制的早期(Hall R.A.等，J.Virol.(1999)，73，10272-10280；RiceC.M.等，J.Virol.，(1997)，71，291-298；Rice C.M.等，J.Virol.，(1996)，222，159-168；Rice C.M.等，J.Virol.，(1997)，71，9608-9617)。在被转运至质膜之前，NS1蛋白发生二聚化。在哺乳动物细胞中(而非昆虫细胞)，NS1蛋白的一部分被释放至细胞外介质中，其可以首先是可溶性蛋白的形式，或者其次是微颗粒形式。如其为可溶性形式，蛋白的形式为寡聚体，特别是五聚体或六聚体(Crooks A.J.等J.Chrom.(1990)，502，59-68和J.Gen.Virol.(1994)，75，3453-3460和Glamand等，J.Virol.(1999)，73，6106-6110)。
目前没有特异性治疗，对于患者的处理均只是对症治疗。对于普通登革热，治疗基于施用止痛剂和退热剂。对于DHF，治疗包括输液以补充血浆丢失，并纠正电解质紊乱以及进行利尿。
针对登革热病毒尚无商品化的疫苗。另一方面，N.Bhamarapravati等以4种登革热病毒血清型的减毒株进行的保护性分析的结果令人不满意(Dengue and Dengue haemorrhagic fever(1997)，367-377)。因此，预防仅仅是基于对付病毒的载体，其结合了破坏幼虫和喷洒“杀成虫剂”。
重度登革热(DEN)病毒感染的发病机制还不完全清楚。在重度DEN病中观察到明显的T细胞激活。在登革出血热和/或登革热休克综合征中，发现多种细胞因子和趋化因子升高。长期以来一直认为巨噬细胞是DEN发病机制的重要成分。如Palucka所强调的，与其他白细胞不同，未成熟的人树突细胞(DC)倾向于容许DEN感染(Wu等，Nat.Med.6816，2000；综述参见Palucka，Nat.Med 6748，2000)。不同于单核细胞/巨噬细胞，特异性抗体并不增强DEN病毒感染(Marovich等，JID Syrnp.Proc.6219，2001)。作为对DEN病毒感染的应答，未成熟的DC可发生成熟。在DC感染后，观察到表面标记B7-1、B7-2、HLA-DR CD11b和DC83的上调以及细胞因子的产生。越来越多的证据表明DEN感染可诱导DC发生功能成熟。这种感染引起表面标记B7-1、B7-2、HLA-DR CD11b和DC83的上调，并刺激产生细胞因子(Ho等，Immunology 1661499，2001)。暴露于DEN病毒的未成熟DC产生TNF-α，后者可干扰内皮细胞的功能。
树突细胞(DC)是专职的抗原呈递细胞(APC)，由于其高表达MHC和共刺激分子，因此参与引起T细胞依赖性免疫应答。髓性DC以未成熟的状态分布于全身，其抗原摄取和加工能力很高。一旦被炎症刺激或感染因素激活，DC则进行成熟过程，迁移到淋巴器官，并获得激活原初(naive)T淋巴细胞的能力。
一个重要的问题是DEN病毒利用了哪一种DC特异性分子作为进入的受体。人DC特异性粘附受体DC-SIGN(抓获ICAM的非整联蛋白(ICAM-grabbing non integrin)或CD-209)是一种II型膜内在蛋白质(integralprotein)，由于其表达主要局限于未成熟DC，因此特别受到关注。已经发现DC-SIGN是ICAM-3的配体，其能够使得DC-T细胞之间发生短暂的相互作用，由此促进初级免疫应答(Geijtenbeek等，Nature 1353，2000)。DC-SIGN似乎是未成熟的来源于髓性单核细胞的DC在成熟过程中所表现出的迁移和T细胞相互作用能力的一种至关重要的介导因素。DC-SIGN表达是IL-4依赖性的且受到IFN-γ、IFN-γ、TGF-β、和抗炎剂的负调节(Relloso等，J.Immunol.1682634，2002)。DC-SIGN多态性还可解释为何一些患者产生了保护性免疫而其他患者则不能。
DC-SIGN是一种C型凝集素，具有一个单一的碳水化合物识别结构域，后者以钙依赖型方式与具有甘露糖或半乳糖侧链的蛋白发生相互作用(Drickammer，Curr.Opin.1mmunol.13585，1999)。现在认为DC-SIGN结合病毒糖蛋白上的高甘露糖寡糖，并由此可捕获有包膜病毒(Feinberg等，Science 2942163，2001)。例如，DC-SIGN结合HIV包膜糖蛋白gp120(Geijtenbeek等，Cell，100587，2000)并由此介导完整的HIV快速内化进入一种非溶酶体结构中(Kwon等，Immunity，16135，2002)。
目前需要开发可调变效应分子与DC-SIGN受体(例如哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体)的特异性结合的方法和组合物。需要此类方法和组合物以便，例如预防和治疗疾病，例如病毒感染，例如登革热病毒感染。就此而言，需要鉴别参与病毒附着和/或融合的细胞蛋白。此外，还需要能够特异性导向表达DC-SIGN受体的细胞的方法和组合物，例如树突细胞或肺泡巨噬细胞，以利于治疗或诊断。
发明内容
本发明人寻求确定DC特异性粘附受体DC-SIGN是否能够促进DEN病毒感染人DC细胞。在此所提供的数据显示，DC-SIGN特异性抗体对DEN-1病毒感染具有阻断作用。这些结果确立了DC-SIGN的一种新的功能，即作为登革热病毒结合蛋白，这很可能是通过与E糖蛋白的相互作用而实现的。由DC-SIGN介导的登革热病毒感染DC的过程，为设计抗病毒化合物提供了一种新的机制。
因此，本发明鉴别了DC-SIGN是一种受体，其参与了HIV以外的病毒与树突细胞的结合。本发明还提供了多种用于治疗哺乳动物疾病包括病毒感染的新的方法、用途和组合物。
本发明的第一个目的在于提供一种预防或治疗哺乳动物疾病的方法，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导，且其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分调变效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂(modulator)，由此预防或治疗该疾病。
本发明的另一个目的在于提供一种预防或治疗哺乳动物疾病的方法，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导，且其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗该疾病。
在一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是所述效应分子的阻断性衍生物。在另一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是抗体。
在DC-SIGN阻断剂是抗体的本发明的实施方案中包括其中所述抗体特异性结合DC-SIGN这样的实施方案，以及其中所述抗体特异性结合效应分子这样的实施方案。
在一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子(mannosylated molecule)。甘露糖基化分子可以是甘露聚糖(mannan)。
本发明的进一步的目的在于提供一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的方法，其中所述病毒感染至少部分由病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导，其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分调变病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂，由此预防或治疗该病毒感染。
本发明的另一个目的在于提供一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的方法，其中所述病毒感染至少部分由病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导，其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗该病毒感染。
在本发明的方法的一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂包含所述病毒效应分子的结合部分。在另一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂包含病毒包膜糖蛋白的结合部分。在另一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是抗体。抗体可特异性结合DC-SIGN或特异性结合病毒效应分子。在其他的实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子。甘露糖基化分子可以是甘露聚糖。
在DC-SIGN阻断剂是抗体的本发明的实施方案中包括以下一些实施方案，其中抗体是单克隆抗体；哺乳动物是人且抗体是人源化的单克隆抗体；抗体特异性结合DC-SIGN；单克隆抗体是Mab 1B10.2.6；抗体特异性结合病毒效应分子；以及抗体特异性结合所述病毒效应分子的结合部分。
在本发明的方法的进一步的实施方案中，病毒效应分子是病毒包膜的一种分子组分。在特定的实施方案中，病毒包膜的分子组分是包膜糖蛋白。
在本发明的方法的另外的实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含所述病毒效应分子的结合部分。在病毒效应分子是病毒包膜的一种分子组分的本发明的一些实施方案中，所用的DC-SIGN阻断剂包含所述包膜糖蛋白的结合部分。
在本发明的一个优选方面，病毒感染是黄病毒科病毒感染，且病毒效应分子是黄病毒科病毒效应分子。在一个更加优选的实施方案中，病毒感染是登革热病毒感染，且病毒效应分子是登革热病毒效应分子。在进一步优选的方面，哺乳动物是人。在一些实施方案中，登革热病毒效应分子是登革热病毒包膜的分子组分。在另一个实施方案中，登革热病毒包膜的分子组分是登革热病毒包膜糖蛋白。在另一个实施方案中，登革热病毒包膜糖蛋白是登革热病毒E糖蛋白。
在病毒感染是登革热病毒感染且病毒效应分子是登革热病毒效应分子的本发明的实施方案中，包括以下一些实施方案，其中DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒效应分子的结合部分；DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分；DC-SIGN阻断剂是重组产生的蛋白质；以及DC-SIGN阻断剂是抗体。在DC-SIGN阻断剂是抗体的实施方案中，包括以下一些实施方案，其中抗体是单克隆抗体；哺乳动物是人且单克隆抗体是人源化的；抗体特异性结合DC-SIGN；单克隆抗体是Mab1B10.2.6；以及抗体特异性结合登革热病毒效应分子。在抗体特异性结合登革热病毒效应分子的实施方案中包括其中登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白的实施方案。
在又一方面本发明提供了一种用于预防或治疗人或猿的HIV或SIV感染的方法，其中所述方法包括给人或猿施用其量足以充分调变HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂，由此预防或治疗HIV或SIV感染。
在另一方面本发明提供了一种用于预防或治疗人或猿的HIV或SIV感染的方法，其中所述方法包括给人或猿施用其量足以充分抑制HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗HIV或SIV感染。在一个优选的实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。在另一个优选的实施方案中，预防或治疗的是人类HIV感染。
在又一方面本发明提供了一种用于预防或治疗哺乳动物的炎症的方法，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合所引起，其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分调变哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与所述哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂，由此预防或治疗炎症。
在另一方面本发明提供了一种用于预防或治疗哺乳动物的炎症的方法，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合所引起，其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与所述哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗炎症。在一个优选的实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。在另一个优选的实施方案中，哺乳动物是人。
本发明的另一个目的是-其量足以充分调变一种效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗一种哺乳动物疾病的药物中的用途，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由所述效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
-其量足以充分抑制一种效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗一种哺乳动物疾病的药物中的用途，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由所述效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
-其量足以调变病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的药物中的用途，其中所述病毒感染至少部分由所述病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
-其量足以充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的药物中的用途，其中所述病毒感染至少部分由所述病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
-其量足以充分调变HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗所述人或猿的HIV或SIV感染的药物中用途。
-其量足以充分抑制HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗所述人或猿的HIV或SIV感染的药物中用途。
-其量足以充分调变哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与所述哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的炎症的药物中的用途，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合引起。
-其量足以充分抑制哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的炎症的药物中的用途，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合引起。在一个优选的实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。在另一个优选的实施方案中，哺乳动物是人。
为上述方法所列的优选的实施方案适用于这些用途。
在又一方面本发明提供了一种药物组合物，其包含a)一种DC-SIGN调变剂，以及b)至少一种药物学可接受的赋形剂；其中所述DC-SIGN调变剂以可达到的治疗浓度存在于组合物中。
在另一方面本发明提供了一种药物组合物，其包含c)一种DC-SIGN阻断剂，以及d)至少一种药物学可接受的赋形剂；其中所述DC-SIGN阻断剂以可达到的治疗浓度存在于组合物中。
在药物组合物的一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是病毒效应分子的衍生物。在一个实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒效应分子的结合部分。在另一个实施方案中，登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白。
在药物组合物的其他一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是抗体。DC-SIGN阻断剂是抗体的实施方案包括以下一些实施方案，其中抗体是单克隆抗体；单克隆抗体是人源化的；抗体特异性结合DC-SIGN；单克隆抗体是Mab 1B10.2.6；抗体特异性结合病毒效应分子；或抗体特异性结合所述病毒效应分子的结合部分。
在又一方面本发明提供了一种鉴别DC-SIGN调变剂的方法，其中所述方法包含a)通过以下步骤确定基线结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定基线结合值；b)通过以下步骤确定测试物质结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.在存在测试物质的情况下将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定测试物质结合值；以及c)通过将所述测试物质结合值除以所述基线结合值确定所述测试物质的测试物质结合调变值，其中代表所述测试物质对所述病毒效应分子与树突细胞的结合产生大约95％的调变的测试物质结合抑制值，表示所述测试物质是充分调变病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的物质。
在一个优选的方面本发明提供了一种鉴别DC-SIGN阻断剂的方法，其中所述方法包含a)通过以下步骤确定基线结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定基线结合值；b)通过以下步骤确定测试物质结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.在存在测试物质的情况下将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定测试物质结合值；以及c)通过将所述测试物质结合值除以所述基线结合值确定所述测试物质的测试物质结合抑制值，其中代表所述测试物质对所述病毒效应分子与树突细胞的结合产生大约95％的抑制的测试物质结合抑制值，表示所述测试物质是充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的物质。
鉴别DC-SIGN阻断剂的方法包括以下一些实施方案，其中培养的细胞是DC；培养的细胞是THP-1细胞；病毒效应分子是登革热病毒效应分子；以及登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白。
在又一方面本发明提供了一种由上述鉴别DC-SIGN阻断剂的方法所鉴别的分离的DC-SIGN阻断剂。
在另一方面本发明提供了一种通过将表达DC-SIGN受体的细胞暴露于导向复合物而将对象分子导向所述细胞的方法，其中所述导向复合物包含对象分子和DC-SIGN阻断剂，且其中所述暴露在使得所述DC-SIGN阻断剂结合表达所述DC-SIGN受体的细胞上的DC-SIGN的条件下进行，由此将所述对象分子导向表达DC-SIGN受体的细胞。
将对象分子导向表达DC-SIGN受体的细胞的方法包括以下一些实施方案，其中DC-SIGN阻断剂是抗体；DC-SIGN阻断剂是单克隆抗体；对象分子是蛋白；对象分子是抗体；对象分子是标记的；暴露在体内进行；以及暴露在体外进行。
以下结合附图对本发明进行更加详细的描述，其中
图1所示为DEN-1病毒对离体(ex-vivo)人DC的感染。将感染了DEN-1病毒株FGA/NA d1d(5Ap61FFU/细胞)的DC在感染后40h以3％PFA(溶于PBS)固定，并以0.1％Triton X-100(溶于PBS)增加其通透性。以抗DEN-1病毒HMAF通过直接免疫荧光观察细胞内DEN蛋白，且细胞核以Hoechst 33258染色。通过荧光观察DEN病毒感染的DC(病毒抗原)和染色质浓聚(凋亡细胞核)。显示了凋亡DC(箭头)。
图2所示为感染了DEN-1病毒的DC的凋亡性DNA片段化。以间接免疫荧光如图1的图例所述检测感染的DC中的DEN抗原(病毒抗原)并同时以TUNEL检测了感染的DC凋亡(TUNEL)。通过荧光观察TUNEL阳性细胞。显示了TUNEL阳性细胞(箭头)。低(A)或高(B)放大倍数。
图3所示为抗DC-SIGN Mab 1B10.2.6阻断DEN-1病毒感染人DC。感染前，将DC与抗DC-SIGN Mab 110(20μg/ml)或抗DEN E Mab 9D12(稀释1∶50)(Desprs等Virology，196209-219，1993)孵育20分钟。在存在Mab的情况下，以DEN-1病毒株FGA/NA d1d感染抗体处理的DC 2小时。如图1的图例所示以间接免疫荧光检测病毒抗原。DC显示了感染42小时后的感染的DC的百分数。
图4所示为THP-1和THP-1/DC-SIGN细胞的黄病毒感染。在感染40小时后，如图1的图例所示，以间接免疫荧光检测感染了DEN-1病毒株FGA/NA did(5AP61FFU/细胞)、YF病毒株17D-204(50 VEROFFU/细胞)或WN病毒株IS-98-ST1(5AP61FFU/细胞)的细胞中的病毒抗原。以抗DEN-1病毒HMAF(AB抗DEN-1)、抗YF病毒HMAF(AB抗YF)或抗WN病毒HMAF(Ab抗WN)观察病毒抗原。(A)感染40小时后的假感染的THP-1细胞(顶部)、或感染了黄病毒的THP-1细胞(底部)和感染的THP-1/DC细胞(底部)(m.o.i.，感染复数(multiplicity ofinfection))。(B)显示了感染细胞的百分数。数值代表一式三份检测的平均值土SD。
图5显示了甘露聚糖、EDTA和抗体特异性DC-SIGN足够DEN-1病毒感染THP-1/DC/SIGN细胞。感染前，将THP-1/DC/SIGN细胞与Mab9D12(稀释1∶50)、Mab BD12.5(20μg/ml)、Mab 1B10.2.6(20μg/ml)、EDTA(5mM)、甘露聚糖(20μg/ml)、或假处理(对照)进行孵育。在存在试剂的情况下，以DEN-1病毒株FGA/NA d1d(5 AP61FFU/细胞)感染处理的细胞2小时。如图1的图例所示以间接免疫荧光检测病毒抗原。显示了感染后48小时的感染细胞的百分数。数值代表一式三份检测的平均值±SD。
图6所示为DEN-1病毒感染表达突变形式的DC-SIGN的THP-1细胞克隆。感染后40小时，如图1的图例所述，以间接免疫荧光检测了感染了DEN-1病毒株FGH/NA did(5AP61FFU/细胞)的THP-1Δ35细胞克隆(THP-1/DC-SIGN突变35)中的病毒抗原。
图7所示为感染了DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4病毒的表达DC-SIGN的THP-1细胞克隆(THP/DC-SIGN细胞)与THP-1细胞的比较。
具体实施例方式
本发明涉及一种预防或治疗哺乳动物疾病的方法，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。该方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗该疾病。
在本发明中，“哺乳动物”指的是哺乳纲的任何动物。哺乳动物的非限制性实例包括人和猿；宠物，例如狗、猫、貂和豚鼠；家畜，例如猪、牛、马、绵羊、山羊和骆驼；以及动物园的动物，例如熊、斑马、大象以及水牛。哺乳动物优选是人。
在此，“疾病”是哺乳动物的任何病理情况，其原因是，例如感染、遗传缺陷、或暴露于环境中的物质。本发明的方法和组合物可用于预防或治疗具有如下特征的疾病，即所述疾病的至少一种症状至少部分由效应分子与哺乳动物的细胞如树突细胞或肺泡巨噬细胞上的DC-SIGN受体的结合所介导。此类疾病的具体实例包括病毒感染。可通过本发明的方法进行治疗的病毒感染的一个具体实例是人的登革热病毒感染。
人的“DC-SIGN受体”在遗传学上指的是DC-SIGN(Curtis等，1992所述)和/或DC-SIGNR(Pohimann等，2001所述)、和/或DC-SIGN或DC-SIGNR的类似物。本领域人员能够认识到，在一些情况下，使用这些形式的DC-SIGN受体中的一种或另一种是优选的或者甚至是必须的。本领域人员能够认识到可通过多种途径获得人DC-SIGN蛋白。例如，人DC-SIGN可纯化自得自体内来源的人树突细胞，例如得自人的血液，或者纯化自体外来源，例如在组织培养物中由人树突细胞前体细胞产生的人树突细胞。也可以采用重组体系表达人DC-SIGN，使用培养的树突细胞作为宿主或者使用一种合适的异种(heterologous)细胞系，例如COS-7或HeLa细胞，或细菌如大肠杆菌。
对于非人类哺乳动物，“DC-SIGN受体”指的是人DC-SIGN受体的同系物(homologues)。本领域人员能够认识到，可通过多种途径中的任何一种来鉴别此类蛋白。这些途径包括表达克隆、使用简并的(degenerate)寡核苷酸引物的聚合酶链反应、以及低严格性筛选细菌或噬菌体文库。
树突细胞是淋巴或非淋巴组织中的形态学上相似的细胞类型的一种性质不同的群体。树突细胞的作用是作为抗原呈递细胞，其有效地在外周组织中捕获抗原并将其加工形成MHC肽复合物。树突细胞还参与早期激活对各种分枝杆菌糖蛋白(包括CAM)具有特异性的非MHC限制性γδ和CDI限制性T细胞(Kaufmann，2001 and Moody，等，2000)。摄取抗原后，这些非成熟树突细胞获得自外周迁移至次级淋巴器官的T细胞区域的特殊能力。树突细胞将来自外来细胞和感染性微生物的抗原转变为结合于主要组织相容性复合物(MHC)的膜蛋白上的短肽。这些MHC肽复合物在细胞内形成但最终呈递于质膜上，在该处，这些MHC肽复合物作为抗原特异性T细胞受体(TCR)的配体。除了形成TCR配体，树突细胞还进行许多其他功能，这使得它们在若干环节上对免疫进行控制(Steinman，2000)。
肺泡巨噬细胞和树突细胞是表达DC-SIGN受体的细胞的实例。内皮细胞是表达DC-SIGNR的细胞的实例。
本领域人员能够理解，树突细胞可得自体内来源如哺乳动物的血液，或在适当的条件下通过培养树突细胞前体细胞而在体外生长。树突细胞前体细胞包括按照实施例2制备的单核细胞。
“效应分子”是任何特异性结合哺乳动物细胞例如哺乳动物的树突细胞或肺泡巨噬细胞上的DC-SIGN受体并由此介导与该哺乳动物的疾病有关的症状的分子。效应分子的实例是存在于病毒上的与哺乳动物细胞的受体结合并由此促进病毒进入该哺乳动物的细胞的配体。对于效应分子是病毒上的配体的情况，所述效应分子可称为“病毒效应分子”。此类配体的实例包括HIV的gp120和登革热病毒的糖蛋白E，其结合细胞如人的树突细胞或肺泡巨噬细胞上的DC-SIGN受体，对于登革热病毒，可由此促进病毒进入表达DC-SIGN的细胞。因此登革热病毒E糖蛋白是一种“登革热病毒效应分子”。其他类型的效应分子是哺乳动物的内源性配体。此类配体包括结合于其他细胞表面的配体以及可溶性配体，这些配体可定位于特定组织的细胞外间隙或在全身循环。
“症状”是指待治疗的疾病的任何病理表现。如果调变效应分子与DC-SIGN受体的结合(降低或升高)导致症状的发生或其严重程度或者两种出现可检测到的降低，则症状至少部分由效应分子与待治疗的哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合引起。在本发明的一个优选的实施方案中，在降低效应分子与DC-SIGN受体的结合后，该症状消失或者被预防而没有出现。
如果效应分子与DC-SIGN受体的结合没有因存在无关分子(如胎牛血清)而被竞争性抑制，但却被DC-SIGN抗体(如1B10.2.6)和/或另外的效应分子而抑制，则该效应分子被称为“特异性结合”细胞如待治疗的哺乳动物的树突细胞或肺泡巨噬细胞的DC-SIGN受体。
一种特异性结合细胞上的如待治疗的哺乳动物的树突细胞或肺泡巨噬细胞上的DC-SIGN受体的效应分子的实例是登革热病毒E糖蛋白。登革热病毒表面上的E糖蛋白与DC-SIGN的结合不能被0.2％牛血清白蛋白抑制，如图3和5所示。不过，这种结合被DC-SIGN特异性抗体所抑制，如图3和5所示，或者被添加到培养基中的可溶性甘露聚糖抑制，如图5所示，或者被添加到培养基中的EDTA抑制，如图5所示。
本领域人员能够理解，这些测试方法也可用于鉴别其他特异性结合细胞上例如待治疗的哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的效应分子。对于本领域人员来说同样显而易见的是，可以使用其他的等同测试方法来代替实施例中具体提及的方法。
一旦已知效应分子可特异性结合DC-SIGN受体，可简单地将该效应分子与DC-SIGN的结合称为“结合”。本领域人员还能够理解，这种结合是特异性的。就此而言，可以讨论对结合的“调变”。调变可包括“抑制”或“增强”。
“调变”指的是调节，包括诱导一种分子的特性发生变化。在本发明中，“调变”指的是调节并改变效应分子与其受体的结合。这种调变的作用是抑制结合或者增强结合或者是施加其他调节控制。
在本发明中，对结合的“抑制”指的是降低在一段固定时间内结合于DC-SIGN的效应分子的总量。可通过提供DC-SIGN阻断剂来实现对效应分子的结合的抑制。“DC-SIGN阻断剂”是任何明显抑制一种特定效应分子以该效应分子特异性结合DC-SIGN的浓度发生结合的分子。在优选的实施方案中，所用的DC-SIGN阻断剂是一种特异性结合DC-SIGN的单克隆抗体。在另一个优选的实施方案中，所用的DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。
在本发明中，对结合的“增强”指的是增加在一段固定时间内结合于DC-SIGN的效应分子的总量。可通过提供DC-SIGN增强因子(enhancer)来实现对效应分子的结合的增强。“DC-SIGN增强因子”是任何明显增加一种特定效应分子以该效应分子特异性结合DC-SIGN的浓度发生结合的分子。
“结合部分”指的是分子的一个部分，当该分子的其他部分被去除或修饰后，或者当该部分(结合部分)被置于一个异种分子中时，该部分基本上保留结合一种第二分子的能力。例如，对于在此所定义的效应分子，可以定义该效应分子的结合部分。效应分子的结合部分是该效应分子的一个部分，当该分子的其他部分被去除或修饰后，或者当该部分(结合部分)被置于一个异种分子中时，该部分基本上保留结合DC-SIGN的能力。就此而言，本领域人员可基于所寻求的该结合部分的特殊特性而对“基本上保留”作出定义。
“基本上抑制”指的是高于80％的抑制、高于90％的抑制、高于95％的抑制、或高于99％的抑制。在本发明的一个优选的实施方案中，对结合的抑制达到了大约90％。
“抑制”是通过将存在DC-SIGN阻断剂的情况下的效应分子与DC-SIGN的结合程度与不存在DC-SIGN阻断剂的情况下的效应分子与DC-SIGN的结合程度进行比较而测量的。然后确定存在DC-SIGN阻断剂的结合程度与不存在DC-SIGN阻断剂的结合程度的比例。从而抑制百分比与结合的量的降低成比例。例如，比例为0.1表示结合降低了90％。
术语“治疗”指的是给已经表现出一种疾病的至少一种症状的个体施用疗法。这种个体包括被诊断为患有一种已知疾病的个体。
术语“预防”指的是给最终可能会患上疾病但目前尚未患病的个体(即那些需要预防措施的个体)施用预防性的疗法。可根据已知与疾病的随后发生有关联的危险因素来鉴别此类个体。
术语“治疗效益(therapeutic benefit)”指的是疾病的至少一种症状的改善、疾病进展的减慢(如表现为疾病的至少一种症状的严重程度进展的减慢)、或者疾病的至少一种症状的进展的停止。通过对施用DC-SIGN阻断剂之前和之后的疾病症状进行比较而确定治疗效益。
所述“抗体”指的是可通过本领域已知的任何技术制备的任何抗体。可通过以包含全部或部分靶蛋白的肽免疫一种宿主动物而获得合适的抗体。合适的宿主动物包括小鼠、大鼠、绵羊、山羊、仓鼠、兔，等等。蛋白免疫原的来源可以是小鼠、人、大鼠、猴子、或微生物例如细菌或病毒，等等。宿主动物通常与免疫原属于不同的物种，例如，以人的蛋白免疫小鼠，等等。
免疫原可包含完整的蛋白或其片段或衍生物。优选的免疫原包含一种对象蛋白质的全部或部分，其中这些残基含有翻译后修饰，例如天然靶蛋白所具有的糖基化。可通过本领域已知的多种途径产生包含细胞外结构域的免疫原，例如采用常规重组方法的克隆基因的表达、自肿瘤细胞培养物上清液进行分离，等等。
为了制备多克隆抗体，第一步是以靶蛋白免疫宿主细胞，其中靶蛋白优选地是基本上纯化的形式，包含低于大约1％的污染。免疫原可包含完整的靶蛋白或其片段或衍生物。为了增强宿主动物的免疫应答，可将靶蛋白与一种佐剂相结合，其中合适的佐剂包括明矾、右旋糖苷、硫酸盐、大的聚合阴离子、油和水乳剂，如弗氏佐剂、弗氏完全佐剂，等等。靶蛋白也可以缀合合成的载体蛋白或合成的抗原。可免疫多种宿主以产生所述多克隆抗体。此类宿主包括兔、豚鼠、啮齿动物如小鼠、大鼠、绵羊、山羊，等等。通常通过皮内途径将靶蛋白施用于宿主，以一个初始剂量，随后继以一个或多个强化剂量，通常至少为2个。免疫接种后，收集宿主的血液，随后将血清与血细胞分离。可采用已知的方法进一步分离所得到的抗血清中的Ig成分，例如铵盐分级、DEAE层析，等等。
通过常规技术产生单克隆抗体。一般来说，被免疫的宿主动物的脾脏和/或淋巴结提供了浆细胞来源。通过将浆细胞与骨髓瘤细胞融合使之永生化而产生杂交瘤细胞。采用标准技术来筛选来自各个杂交瘤的培养物上清液以便鉴别那些产生具有所需特异性的抗体的杂交瘤。用于产生针对人的蛋白的单克隆抗体的合适的动物包括小鼠、大鼠、仓鼠，等等。为了产生针对小鼠蛋白的抗体，动物通常是仓鼠、豚鼠、兔，等等。可通过常规技术自杂交瘤细胞上清液或腹水中纯化抗体，例如通过亲和层析，使用结合于不溶性支持物蛋白A琼脂糖凝胶的本发明的蛋白质，等等。
产生的抗体可以是单链，而不是通常的多聚体结构。Jost等(1994)J.B.C.26926267-73和其他人描述了单链抗体。编码重链可变区和轻链可变区的DNA序列被连接于一个间隔区，该间隔区编码至少4个小中性氨基酸的氨基酸残基，包括甘氨酸和/或丝氨酸。由这种融合体编码的蛋白能够组装一种保留了原抗体的特异性和亲和力的功能性可变区。
还提供了“人工”抗体，例如在体外产生并筛选的抗体和抗体片段。在一些实施方案中，此类抗体被展示于一种噬菌体或其他病毒颗粒的表面。在很多实施方案中，此类人工抗体是与病毒或噬菌体结构蛋白形成的融合蛋白，所述结构蛋白包括M13基因III蛋白。产生此类人工抗体的方法是本领域人员熟知的。例如参见美国专利No5,516,637；5,223,409；5,658,727；5,667,988；5,498,538；5,403,484；5,571,698；和5,625,033。
对于体内使用，特别是用于注射入人体，需要降低抗体的抗原性。受者对阻断剂的免疫应答可能会潜在地缩短有效治疗的时间。对抗体进行人源化的方法是本领域已知的。人源化抗体可以是具有人免疫球蛋白恒定区基因转基因的动物的产品(参见例如国际专利申请WO 90/10077和WO 90/04036)。或者，所需的抗体可通过遗传工程化产生，即通过重组DNA技术将CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域替换为相应的人的序列(参见WO 92/02190)。
使用Ig cDNA用于构建嵌合免疫球蛋白基因是本领域人员已知的(Liu等(1987)P.N.A.S.843439和(1987)J.Immunol.1393521)。自杂交瘤或其他产生抗体的细胞分离mRNA，并用于产生cDNA。所需的cDNA可通过聚合酶链反应使用特异性引物进行扩增(美国专利No4,683,195和4,683,202)。或者，构建并筛选文库以分离所需的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列融合于人的恒定区序列。人恒定区基因的序列可见于Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，N.I.H.publication no.91-3242。人的C区基因可自已知的克隆容易地获得。可根据所需的效应剂的功能来选择同种型，所述功能例如为固定补体、或抗体依赖性细胞毒活性。优选的同种型为IgG1、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区κ或λ。然后，该嵌合的人源化抗体可通过常规方法表达。
在另一个实施方案中，抗体可以是完全的人抗体。例如，可采用与人抗体相同的异基因抗体。异基因人抗体指的是与人抗体相同的抗体，即它们完全是人抗体，不同之处在于它们是通过非人类宿主产生的，所述非人类宿主已经被遗传工程化改变以表达人抗体。参见例如WO98/50433；WO 98，24893和WO 99/53049，将这些公开的内容在此并入作为参考。
抗体片段如Fv、F(ab′)2和Fab可通过裂解完整的蛋白质而制备，例如通过蛋白酶或者化学裂解。或者，可以设计一种截短的基因。例如，编码F(ab′)2片段的一部分的嵌合基因可包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，其后是翻译终止密码子，以便产生截短的分子。
H和LJ区的共有序列可用于设计用作引物的寡核苷酸，以便在J区内引入有用的限制性位点，用于随后将V区片段连接于人C区片段。可通过定点诱变对C区cDNA进行修饰，以便在人的序列中的类似位置处放置一个限制性位点。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、来自EBV的附加体，等等。一种方便的载体是编码具有完整功能性的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有遗传工程化的合适的限制性位点，因此可容易地插入并表达任何VH或VL序列。在此类载体中，加工通常发生在插入的J区内的加工供体位点与在人C区之前的加工受体位点之间，以及还发生在位于人CH外显子内的加工区域。聚腺苷酸化以及转录终止出现于编码区下游的天然染色体位点处。得到的嵌合抗体可连接于任何强启动子，包括逆转录LTR，例如SV-40早期启动子(Okayama等(1983)Mol.Cell.Bio.3280)、Rous肉瘤病毒LTR(Gorman等(1982)P.N.A.S.796777)、以及Moloney鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等(1985)Cell 41885)；天然Ig启动子，等等。
可采用本发明进行预防或治疗的疾病的一个实例是登革热病毒感染。实施例中提供的结果首次证实了DC-SIGN在登革热病毒结合于人树突细胞过程中所起的作用。
在此所述的结果，包括实施例中所述的结果，显示高度纯化的携带蚊N连接寡糖的DEN-1病毒能够在人DC中复制并产生子代病毒。在感染了DEN-1病毒的DC中观察到凋亡性细胞死亡。C-凝集素分子DC-SIGN表达于DC表面。在此描述的实验试图确定DC特异性粘附受体DC-SIGN是否具有促进DEN病毒感染人DC的能力。结果说明，DC-SIGN特异性抗体对DEN-1病毒感染具有阻断作用。因此鉴别出DC-SIGN的一种新的功能，即可能通过与E糖蛋白相互作用而作为DEN病毒的结合蛋白。DC-SIGN介导的DEN病毒对DC的感染的过程为设计抗病毒化合物提供了一种新的机制。
根据这些结果，本发明提供了一种用于预防或治疗哺乳动物疾病的方法，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导，且其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗该疾病。
在一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是所述效应分子的阻断性衍生物。在另一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是抗体。
在DC-SIGN阻断剂是抗体的本发明的实施方案中包括其中所述抗体特异性结合DC-SIGN这样的实施方案，以及其中所述抗体特异性结合效应分子这样的实施方案。
在一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子。甘露糖基化分子可以是甘露聚糖。
本发明还提供了一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的方法，其中所述病毒感染至少部分由病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导，其中所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗该病毒感染。
在本发明的方法的一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂包含所述病毒效应分子的结合部分。在另一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂包含病毒包膜糖蛋白的结合部分。在另一些实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是抗体。抗体可特异性结合DC-SIGN或特异性结合病毒效应分子。在其他的实施方案中，所述DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子。甘露糖基化分子可以是甘露聚糖。
在DC-SIGN阻断剂是抗体的本发明的实施方案中包括以下一些实施方案，其中抗体是单克隆抗体；哺乳动物是人且抗体是人源化的单克隆抗体；抗体特异性结合DC-SIGN；单克隆抗体是Mab 1B10.2.6；抗体特异性结合病毒效应分子；以及抗体特异性结合所述病毒效应分子的结合部分。
在本发明的方法的进一步的实施方案中，病毒效应分子是病毒包膜的一种分子组分。在特定的实施方案中，病毒包膜的分子组分是包膜糖蛋白。
在本发明的方法的另外的实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含所述病毒效应分子的结合部分。在病毒效应分子是病毒包膜的一种分子组分的本发明的一些实施方案中，所用的DC-SIGN阻断剂包含所述包膜糖蛋白的结合部分。
在本发明的一个优选方面，病毒感染是黄病毒科病毒感染，且病毒效应分子是黄病毒科病毒效应分子。在一个更加优选的实施方案中，病毒感染是登革热病毒感染，且病毒效应分子是登革热病毒效应分子。在进一步优选的方面，哺乳动物是人。在一些实施方案中，登革热病毒效应分子是登革热病毒包膜的分子组分。在另一个实施方案中，登革热病毒包膜的分子组分是登革热病毒包膜糖蛋白。在另一个实施方案中，登革热病毒包膜糖蛋白是登革热病毒E糖蛋白。
在病毒感染是登革热病毒感染且病毒效应分子是登革热病毒效应分子的本发明的实施方案中，包括以下一些实施方案，其中DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒效应分子的结合部分；DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分；DC-SIGN阻断剂是重组产生的蛋白质；以及DC-SIGN阻断剂是抗体。在DC-SIGN阻断剂是抗体的实施方案中，包括以下一些实施方案，其中抗体是单克隆抗体；哺乳动物是人且单克隆抗体是人源化的；抗体特异性结合DC-SIGN；单克隆抗体是Mab1B10.2.6；以及抗体特异性结合登革热病毒效应分子。在抗体特异性结合登革热病毒效应分子的实施方案中包括其中登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白的实施方案。
在本发明的一个优选的实施方案中，效应分子与DC-SIGN阻断剂是相同的。在一个第二优选的实施方案中，效应分子与DC-SIGN阻断剂是不同的。
有趣的是登革热病毒和HIV(以及SIV)均可以结合DC-SIGN。HIV与树突细胞的结合由HIV的gp120糖蛋白与DC-SIGN的结合介导的。因此gp120是一种病毒效应分子。因此本发明提供了一种用于预防和治疗HIV感染的方法。具体而言，本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗人或猿的HIV或SIV感染的方法。所述方法包括给人或猿施用其量足以充分抑制HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的相互作用的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗HIV或SIV感染。
还认为DC-SIGN在介导已知的在缺乏外来抗原情况下树突细胞与T细胞之间发生的松散粘附中具有至关重要的作用。这种粘附被认为是为TCR提供了必要的机会，以便扫描树突细胞的表面并鉴别出现的极少量的TCR配体，且由此被这种配体激活。为此，树突细胞上的DC-SIGN与T细胞上的ICAM-3之间的相互作用很可能对于T细胞活化和刺激的过程是至关重要的。这一模型提示，DC-SIGN-ICAM-3相互作用可能在介导和/或强化树突细胞对T细胞的其他刺激作用中发挥作用。
为此，通过阻断ICAM-3效应分子与DC-SIGN的相互作用，DC-SIGN阻断剂可能是一种有效的抗炎剂。因此，本发明还提供了一种用于预防或治疗哺乳动物的炎症的方法，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的相互作用所引起。所述方法包含给哺乳动物施用其量足以充分抑制哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与所述哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的相互作用的DC-SIGN阻断剂，由此预防或治疗炎症。
本发明还提供了其量足以充分调变一种效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗一种哺乳动物疾病的药物中的用途，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由所述效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
本发明还提供了其量足以充分抑制一种效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗一种哺乳动物疾病的药物中的用途，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由所述效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。在一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是所述效应分子的阻断性衍生物。在另一个实施方案中，DC-SIGN阻断剂是抗体。在另一个实施方案中，抗体特异性结合DC-SIGN。在另一些实施方案中，抗体特异性结合效应分子。
在另一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子；甘露糖基化分子优选地是甘露聚糖。
本发明还提供了其量足以充分调变病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的药物中的用途，其中所述病毒感染至少部分由所述病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
本发明还提供了其量足以充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的药物中的用途，其中所述病毒感染至少部分由所述病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。在该用途的一些实施方案中，病毒效应分子是病毒包膜的一种分子组分。在另一些实施方案中，病毒包膜的分子组分是包膜糖蛋白。
在进一步的实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含所述病毒效应分子的结合部分。在另一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含所述包膜糖蛋白的结合部分。在另一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂是抗体。抗体是单克隆抗体。在另一些实施方案中，哺乳动物是人且单克隆抗体是人源化的。抗体可特异性结合DC-SIGN或特异性结合病毒效应分子。在另外的实施方案中，抗体特异性结合所述病毒效应分子的结合部分。此外，DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子。甘露糖基化分子可以是甘露聚糖。
在一个优选的实施方案中，病毒感染是黄病毒科病毒感染，且病毒效应分子是黄病毒科病毒的效应分子。在一个更加优选的实施方案中，黄病毒科病毒感染是登革热病毒感染，且所述黄病毒科效应分子是登革热效应分子。在一个更加优选的方面，哺乳动物是人。在一些实施方案中，登革热病毒效应分子是登革热病毒包膜的分子组分。在进一步的实施方案中，登革热病毒包膜的分子组分是登革热病毒包膜糖蛋白。在另一个实施方案中，登革热病毒包膜糖蛋白是登革热病毒E糖蛋白。
在病毒感染是登革热病毒感染且病毒效应分子是登革热病毒效应分子的所述用途的实施方案中，包括以下一些实施方案，其中DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒效应分子的结合部分；DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分；DC-SIGN阻断剂是重组产生的蛋白质；以及DC-SIGN阻断剂是抗体。在DC-SIGN阻断剂是抗体的实施方案中，包括以下一些实施方案，其中抗体是单克隆抗体；哺乳动物是人且单克隆抗体是人源化的；抗体特异性结合DC-SIGN；单克隆抗体是Mab1810.2.6；以及抗体特异性结合登革热病毒效应分子。在抗体特异性结合登革热病毒效应分子的实施方案中包括其中登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白的实施方案。
本发明还提供了其量足以充分调变HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗所述人或猿的HIV或SIV感染的药物中的用途。
本发明还提供了其量足以充分抑制HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合或相互作用的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗所述人或猿的HIV或SIV感染的药物中的用途。在一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。在进一步的实施方案中，预防或治疗的是人类HIV感染。
本发明还提供了其量足以充分调变哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗所述哺乳动物的炎症的药物中的用途，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合引起。
本发明还提供了其量足以充分抑制哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合或相互作用的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗所述哺乳动物的炎症的药物中的用途，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合引起。在一些实施方案中，DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。在另一些实施方案中，哺乳动物是人。
本发明还提供了药物组合物，其包含DC-SIGN阻断剂。此类组合物可适合于制药用途和施用于患者。组合物通常含有可达到的治疗浓度的纯化的DC-SIGN阻断剂和药物学可接受的赋形剂。在此，“药物学可接受的赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂，等等，这些均适合于进行药物施用。这些介质和制剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。组合物还可含有其他活性化合物，以提供补充的、额外的或增强的治疗功能。药物组合物还可与施用说明一同被置于容器中、包装中或分配器中。
本发明的药物组合物被配制为适合其施用途径。实现施用的方法是本领域普通技术人员熟知的。施用可以例如是静脉内、肌肉内、皮下或通过吸入施用。
用于皮下施用的溶液或混悬液通常包括以下成分中的一或多种无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的制剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节pH，例如用盐酸或氢氧化钠。此类制剂可被封于安瓿中、一次性注射器中或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适合于注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散剂以及可即时配制成可注射的溶液或分散剂的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、无菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐(PBS)。在所有情况中，组合物必须是无菌的且其流动性应该易于注射。其在制造和存贮条件下必须是稳定的，且必须在保存过程中可抵抗微生物例如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散剂，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。可通过一些方法保持其具有适当的流动性，例如通过使用涂层如卵磷脂，对于分散剂可通过维持其所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性物质。可通过使用各种抗细菌和抗真菌药剂来预防微生物的作用，例如使用对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、噻汞撒，等等。在很多情况下，可以在组合物中加入等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可通过在组合物中加入一种延缓吸收的制剂例如单硬脂酸铝和凝胶以延长注射用组合物的吸收。
也可通过经粘膜或经皮方式进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中可使用适合于所欲渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域所熟知的，且包括，例如对于经粘膜施用，可使用去垢剂、胆汁酸盐、梭链孢酸衍生物。可采用喷鼻剂或栓剂进行经粘膜施用。对于经皮施用，本领域熟知可将活性化合物配制成油膏、药膏、凝胶或乳剂。
对于吸入施用，可将含有DC-SIGN阻断剂的组合物以气溶胶的形式，使用压力容器或分配器进行输送，所述压力容器或分配器具有推进物例如二氧化碳或具有雾化器。
在一个实施方案中，使用一些载体来制备纯化的DC-SIGN阻断剂，所述载体可防止其自肌体快速清除，例如控释制剂，包括植入体和微包囊化的输送系统。可使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域人员来说是显而易见的。原料可购自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。含有LAM的脂质体混悬液也可用作药物学可接受的载体，可根据本领域人员已知的方法进行制备，如美国专利No.4,522,811所述。
可用于治疗的药剂，例如生长因子(如BMP、TGF-β、FGF、IGF)、细胞因子(如白细胞介素和CDF)、抗生素和任何对待治疗的疾病有益的其他治疗剂，均可任选地加入进来或者与DC-SIGN阻断剂同时或序贯施用。
特别优选的是以剂量单位形式配制组合物以易于施用和统一剂量。在此所用的剂量单位形式指的是物理学上分离的单位，适合用作治疗对象的一致的剂量；各单位剂量含有一个预先确定量的活性化合物，该预先确定的量经过计算可与所需的药物学载体一同产生所需的治疗作用。对本发明的剂量单位形式的说明直接取决于活性化合物的独特特性和要达到的具体治疗效果，以及配方领域例如用于治疗个体的活性化合物的固有限制。
可通过细胞培养或动物实验的标准药物学方法来确定包DC-SIGN阻断剂的组合物的毒性和治疗效力，例如测定LD50(导致50％的群体死亡的剂量)和ED50(在50％的群体中产生治疗效果的剂量)。毒性剂量与有效治疗剂量之间的比例是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50比。具有高治疗指数的DC-SIGN阻断剂是优选的。
得自细胞培养分析和动物实验的数据可用于制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量的范围优选地是包括具有极少毒性或没有毒性的ED50的循环浓度。剂量可在此范围内根据所采用的剂量形式和采用的施用途径而变化。对于任何用于本发明的DC-SIGN阻断剂，最初可根据细胞培养分析来估计治疗有效量。可在动物模型中制定一个剂量，以便达到包括如细胞培养中所确定的IC50(即对症状达到最大抑制程度的一半的DC-SIGN阻断剂的测试浓度)的循环血浆浓度范围。可通过例如高效液相色谱来测定血浆中的水平。可通过合适的生物检测方法来监测任何具体剂量的效果。
本发明的导向复合物包含至少一种共价结合于至少一种对象分子的DC-SIGN阻断剂分子。在一些实施方案中，一种DC-SIGN阻断剂分子共价结合于一种对象分子。在其他的实施方案中，一种以上的DC-SIGN阻断剂分子可共价结合于一种对象分子。多种DC-SIGN阻断剂分子可各自独立地共价结合于所述对象分子；或者，所述一种以上DC-SIGN阻断剂分子中的一种或多种可仅与一或多种其他DC-SIGN阻断剂分子共价结合，其中至少一种阻断剂分子本身共价结合于对象分子。
在其他实施方案中，多种对象分子共价结合于一种DC-SIGN阻断剂分子。所述多种对象分子可各自独立地共价结合于所述DC-SIGN阻断剂分子；或者，所述一种以上对象分子中的一或多种可仅与一或多种其他对象分子共价结合，其中至少一种对象分子本身共价结合于DC-SIGN阻断剂分子。
本发明的另外的实施方案使用一种以上的上述各种类型的DC-SIGN阻断剂的组合物。对可以采用的此类组合物的多样性没有限制。本领域人员能够理解，具体使用的组合物取决于多种因素，且因此对于本发明的各种用途可适当选择合适的组合物。
制备本发明的DC-SIGN阻断剂的技术是生物化学领域人员所熟知的和广泛采用的，因此不需要在此详述。不过，本领域人员能够认识到可采用任何合适的技术在对象分子和DC-SIGN阻断剂分子之间形成共价键。
对象分子可以是任何感兴趣的分子。非限制性的实例包括小的有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质。本领域普通技术人员能够理解还可使用一或多种此类分子的任何已知的衍生物和复合物。
对于对象分子是蛋白、核酸、碳水化合物或脂质的情况，所述对象分子可来自天然来源，即自包含该分子的生物体中纯化获得。或者，所述对象分子可通过重组获得，即来自已经被遗传工程化以便产生所选的对象分子的重组的生物体。在一些情况中，用于产生重组对象分子的重组生物体是这样一种生物体，即如天然存在的该生物体一样，其包含该对象分子的非重组形式。在其他一些情况中，所述对象分子是这样一种分子，即该分子并非天然存在于该重组生物体中。
本发明的对象分子还包括小的有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质的衍生物。在此，衍生物是小的有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质的一种形式，其通过对所述的小的有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质上的一或多个化学反应位点进行添加、删除或改变而自其天然状态修饰产生。制备小的有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质的衍生物的技术是生物化学领域的技术人员所熟知的和广泛采用的，因此无需在此详述。
在一个优选的实施方案中，所述对象分子是抗体。
对象分子还可以是具有抗原性的分子。如果一种分子能够与免疫系统的抗原识别分子例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗体受体发生特异性相互作用，那么该分子即具有抗原性。抗原性多肽含有至少约5个，且优选地含有至少约10个氨基酸。分子的抗原性部分可以是对抗体或T细胞受体的识别而言是免疫显性(immunodominant)的部分，或者其可以是用于产生针对所述分子的抗体的部分，其中将抗原性部分与用来进行免疫接种的载体分子相缀合。具有抗原性的分子其本身不需要具有免疫原性，具有免疫原性是指能够不需要载体即可引起免疫应答。
本发明的导向复合物可在体内或体外暴露于表达DC-SIGN的细胞，例如树突细胞。体内暴露通过施用药物组合物中的导向复合物而实现，所述药物组合物可以是在此所述的或者是本领域已知的任何合适的与之相当的配制品。在这种情况中，导向复合物可在体内结合于树突细胞表面上的DC-SIGN。体外暴露可通过将体外生长的树突细胞暴露于导向复合物而发生。
以下实施例用于描述本发明的特定方面。本领域普通技术人员能够认识到，在不脱离本发明的本质和范围的条件下，可进行多种修改和变化。此类修改和变化也被本发明的范围所涵盖。这些实施例不以任何方式对本发明构成限制。
实施例实施例1黄病毒按照以往所述(Despres等，Virology，196209，1993)自一种蚊子Aedespseudoscutellaris AP61单层细胞制备并纯化DEN 1型(DEN-1)病毒株FGA/NA d1d(GenBank登记号AF226686)(Duarte dos Santos等，Virology，274292，2000)和西尼罗河(WN)病毒株IS-98-ST1(GenBank登记号AF481864)(Mashimo等，PNAS，9911311，2002)，并通过灶免疫检测试验(focus immunodetection assay，FIA)在AP61上进行病毒滴定。黄热病(YF)病毒疫苗株17D-204(STAMARIL，Pasteur Vaccins，Lot E113)(GenBank登记号X07755)在单层的非洲绿猴肾脏VERO细胞中繁殖2次，进行蔗糖梯度纯化，并在VERO上进行滴定。感染性滴度表示为灶形成单位(focus forming units，FFU)。
值得注意的是，FGA/NA d1d E糖蛋白在Asn67位置和Asn153位置具有2个N-连接的糖基化位点。在N-糖基化过程中，DEN-1糖蛋白E的两个N-糖基化位点似乎均被利用(Courageot等，J.Virol.，74564-572)。IS-98-ST1 E糖蛋白具有单一的N-连接的糖基化位点，似乎被利用(Despres，个人交流)。而17D-204 E蛋白不发生N-糖基化。黄病毒M蛋白不发生糖基化。
在这些实验中，我们测试了DEN-1和WN病毒颗粒相关性E糖蛋白，其携带来自蚊子AP61细胞的成熟的N-连接的寡糖。
实施例2人单个核细胞来自纯化的单个核细胞的人DC、人单核细胞细胞系THP-1(ATCCTIB 202)和表达DC-SIGN的细胞克隆THP/DC-SIGN均来自Ali Amara(Immunologie Virale)(Kwon等，Immunity，16135，2002)。未成熟DC、THP-1和THP/DC-SIGN细胞培养于RPMI 1640培养基，添加了10％热灭活的胎牛血清(FCS)(Eurobio，lot 160402)，2mM L-谷氨酰胺和抗生素Peni/Strepto。
将DC粘附于聚-L-赖氨酸(Sigma)包被的玻璃Lab-tek隔室(NalgeNunc International)(5×104细胞/cm2)。将THP-1和THP/DC-SIGN细胞粘附于聚-L-赖氨酸处理的玻璃Lab-tek隔室或聚赖氨酸处理的12孔板(5×104细胞/cm2)。
实施例3病毒感染以RPMI 1640将细胞洗涤一次，与高度纯化的病毒在添加了0.2％牛血清白蛋白(BSA，pH7.5)(Sigma)的RPMI 1640中在37℃孵育2小时，并置于添加了2％FCS，2mM L-谷氨酰胺和抗生素Peni/Strepto的新鲜培养基中，在37℃放置40小时。
使用1∶50稀释的DEN-1病毒特异性超免疫小鼠腹水液体(HMAF)9801( 株)、WN病毒特异性HMAF 0801(IS-98-ST1株)或YF病毒特异性HMAF 9803(FNV株)，通过以往所述的间接免疫荧光(Despres等，J.Virol.，704090，1996)，测定表达病毒抗原的细胞的百分比。
实施例4抑制DC-SIGN介导的病毒结合将粘附的细胞与EDTA(5mM)、甘露聚糖(20μg/ml)、抗DC-SIGNMab 1B10.2.6(20μg/ml)、抗LMCV Mab 12.5(同型对照，20μg/ml)、或DEN E特异性Mab 9D12(1∶50稀释)在添加了0.2％BSA的RPMI 1640中在室温孵育20分钟，随后与病毒结合2小时。感染后2小时，以RPMI 1640洗涤细胞，并与RMPI 1640 2％FCS孵育40小时。抗DC-SIGN Mab1B10.2.6和抗LMCV Mab 12.5来自Ali Amara。
实施例5免疫荧光分析简言之，将细胞以3％多聚甲醛(PFA)(溶于PBS)在室温固定20分钟，与50mM NH4Cl(溶于PBS)孵育20分钟，并以0.1％Triton X-100(溶于PBS)处理5分钟增加通透性。以抗黄病毒HMAF对细胞内病毒抗原进行染色。第二抗体是FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(Sigma)。以荧光显微镜观察细胞。
实施例6原位检测凋亡细胞为了评估与凋亡性细胞死亡相关的细胞核改变，将玻片上的PFA固定的细胞以0.1μg/ml的溶于0.1％柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的Hoechst33258(Sigma)在室温处理10分钟。如果细胞核出现边缘和染色质浓聚，则认为细胞发生了凋亡。以荧光显微镜观察细胞。
通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)(Despres等，J.Virol.，704090，1996)检测凋亡诱导的DNA断裂。以链霉抗生物素-CYTM3缀合物(Jackson Immunoresearch)进行TUNEL分析。以荧光显微镜观察细胞。
实施例7DEN病毒离体感染人DC我们已经测定了DEN-1病毒株FGA/NA d1d是否在DC中复制。如以抗DEN-1 HMAF进行IF分析所测定的，需要接种5AP61FFU/细胞以便50％的人DC在40小时内感染DEN病毒(图1)。感染后48小时，在FGA/NA d1d感染的DC中聚集的感染性颗粒达到9(±3)×104APGlFFU/ml(50,000个DC)。不同于DEN-1病毒，感染后40小时，低于1％的DC感染了WN病毒株IS-98-ST1(m.o.i.为5 AP61FFU/细胞)或YF疫苗株(m.o.i.为50 VEROFFU/细胞)(数据未显示)。
以DEN-1病毒株FGA/NA d1d感染DC，在感染40小时后引起凋亡，如通过Hoescht 33258染色(图1)和TUNEL法(图2A&B)所测定的。
实施例8抗DC-SIGN Mab 1B10.2.6阻断DEN-1病毒感染DC我们分析了抗DC-SIGN特异性Mab 1B10.2.6对DEN-1病毒株FGA/NA d1d的感染性的影响。图3说明，如IF法所测定的，20μg/ml的Mab 1B10.2.6阻断了FGA/NA d1d对DC细胞的感染。作为阳性对照，抗E Mab 9D12使得DEN-1病毒的感染性降低了70％。以Mab 1B10.2.6处理的感染了FGA/NA d1d的DC产生的感染性颗粒极低(＜5AP61FFU/ml)。
实施例9DEN病毒感染人单核细胞THP-1和THP/DC-SIGN1.DC-SIGN和DEN病毒之间的特异性相互作用我们进一步研究了DC-SIGN和DEN病毒之间的相互作用的特异性。为此，首先以DEN-1病毒株FGA/NA d1d感染人单核THP-1细胞。在m.o.i.为5AP61FFU/细胞时，如IF分析所测定的，低于1％的THP-1呈现DEN抗原阳性(图4A&B)。类似地，YF病毒疫苗株17D-204(m.o.i.为50 VEROFFU/细胞)未能在THP-1细胞株复制(图4A&B)。而需要m.o.i为5 AP61 FFU/细胞以使得大约70％的THP-1细胞感染WN病毒株IS-98-ST1(图4A&B)。
2.DC-SIGN在DEN-1病毒对THP-1的感染性中的作用为了确定是否是DC-SIGN使得DEN-1病毒具有对THP-1的感染性，我们测试了表达DC-SIGN的人单核THP细胞系，THP/DC-SIGN(Kwon等，Immunity，16135，2002)。在m.o.i.为5AP61 FFU/细胞时，感染后48小时，超过50％的THP/DC-SIGN细胞呈现FGA/NA d1d抗原阳性(图4)。在感染96小时后，DEN-1病毒在其中进行复制的THP/DC-SIGN细胞发生死亡。不同于DEN-1病毒，在m.o.i.高达50VEROFFU/细胞时，YF病毒疫苗株17D-204在THP/DC-SIGN中不进行复制。同样有趣的是，DC-SIGN可介导增强WN病毒对单核细胞的感染(图4)。
3.甘露聚糖、ETDA和DC-SIGN特异性Mab 1B10.2.6对DC-SIGN介导的DEN病毒结合的影响我们测试了甘露聚糖、ETDA和DC-SIGN特异性Mab 1B10.2.6对DC-SIGN介导的DEN病毒结合的影响。在这些实验中，Mab BD12.5作为阴性对照，而抗E Mab 9D12用作阳性对照。以DEN-1病毒株FGA/NAd1d以m.o.i.为5AP61FFU/细胞感染THP/DC-SIGN。当以EDTA或DC-SIGN特异性Mab 1B10.2.6与THP/DC-SIGN细胞进行预孵育后，DEN-1病毒的感染性被基本上消除(图5)。剂量为201μg/ml的甘露聚糖可将FGA/NA d1d的感染性降低75％。因此，有理由认为DC-SIGN能够促进DEN病毒感染单个核细胞。
DC-SIGN的细胞浆尾部含有2个限定的推定的内化基序、1个基于双亮氨酸的基序(dileucine-based motif)以及1个基于酪氨酸的基序。接下来我们测试了表达突变形式的DC-SIGN的THP-1细胞克隆A35，该突变形式的DC-SIGN中该分子的细胞浆结构域时截短的(Kwon等，Immunity，16135，2002)。该截短去除了包括双亮氨酸基序和基于酪氨酸的基序在内的35个氨基酸。我们发现，DEN-1病毒对THP-1细胞克隆A35保留了大部分的感染性(图6)。因此，细胞浆尾部在DC-SIGN增强DEN-1病毒感染中不起作用。
4.DC与不同DEN病毒类型之间的相互作用的比较按照实施例3所述，以DEN病毒[DEN-1病毒株FGA/NA d1d(FrenchGuiana)；DEN-2病毒株Jam(Jamaica)；DEN-3病毒株PaH 881(Thailand)；DEN-4病毒株63632(Birmanie)]感染THP/DC-SIGN细胞，感染复数(MOI)为自0.1至10AP61FFU/细胞。感染后40小时，使用特异性抗DEN HMAF通过间接免疫荧光测定表达DC-SIGN的DEN抗原阳性THP细胞的百分数(％)(图7)。在感染各种DEN病毒株的THP细胞中没有检测到DEN抗原。
结果总结于下表。
DEN病毒感染表达DC-SIGN的THP/DC-SIGN细胞
保藏名称为“Hela DC-SIGN Flap”的Hela细胞系于2002年10月30日保藏于C.N.C.M.，28rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15，法国，保藏号为I-2949。
名称为“DC-SIGN human clone2”的DC-SIGN克隆于2002年10月30日保藏于C.N.C.M.，28 rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15，法国，保藏号为I-2950。
名称为“1B10.2.6”的杂交瘤于2002年11月7日保藏于C.N.C.M.，28rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15，法国，保藏号为I-2951。
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权利要求
1.其量足以充分调变一种效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗一种哺乳动物疾病的药物中的用途，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由所述效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
2.其量足以充分抑制一种效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗一种哺乳动物疾病的药物中的用途，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由所述效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
3.权利要求2的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是所述效应分子的阻断性衍生物。
4.权利要求2的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是抗体。
5.权利要求4的用途，其中所述抗体特异性结合DC-SIGN。
6.权利要求4的用途，其中所述抗体特异性结合所述效应分子。
7.权利要求2的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是一种结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子。
8.权利要求7的用途，其中所述甘露糖基化分子是甘露聚糖。
9.其量足以充分调变病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的药物中的用途，其中所述病毒感染至少部分由所述病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
10.其量足以充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗哺乳动物的病毒感染的药物中的用途，其中所述病毒感染至少部分由所述病毒效应分子与待治疗的哺乳动物的DC-SIGN受体的结合所介导。
11.权利要求10的用途，其中所述病毒效应分子是病毒包膜的一种分子组分。
12.权利要求11的用途，其中所述病毒包膜的分子组分是包膜糖蛋白。
13.权利要求10的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂包含所述病毒效应分子的结合部分。
14.权利要求12的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂包含所述包膜糖蛋白的结合部分。
15.权利要求10的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是抗体。
16.权利要求15的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
17.权利要求16的用途，其中所述哺乳动物是人，且所述单克隆抗体是人源化的。
18.权利要求15的用途，其中所述抗体特异性结合DC-SIGN。
19.权利要求15的用途，其中所述抗体特异性结合所述病毒效应分子。
20.权利要求19的用途，其中所述抗体特异性结合所述病毒效应分子的结合部分。
21.权利要求10的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是结合DC-SIGN受体的甘露糖基化分子。
22.权利要求21的用途，其中所述甘露糖基化分子是甘露聚糖。
23.权利要求10的用途，其中所述病毒感染是一种黄病毒科(Flaviviridae)病毒感染，且所述病毒效应分子是一种黄病毒科效应分子。
24.权利要求23的用途，其中所述哺乳动物是人。
25.权利要求23的用途，其中所述黄病毒科病毒感染是登革热病毒感染，且所述黄病毒科效应分子是登革热效应分子。
26.权利要求25的用途，其中所述登革热病毒效应分子是登革热病毒包膜的分子组分。
27.权利要求26的用途，其中所述登革热病毒包膜的分子组分是登革热病毒包膜糖蛋白。
28.权利要求27的用途，其中所述登革热病毒包膜糖蛋白是登革热病毒E糖蛋白。
29.权利要求25的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒效应分子的结合部分。
30.权利要求28的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。
31.权利要求30的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是重组产生的蛋白质。
32.权利要求25的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂是抗体。
33.权利要求32的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
34.权利要求33的用途，其中所述单克隆抗体是人源化的。
35.权利要求32的用途，其中所述抗体特异性结合DC-SIGN。
36.权利要求32的用途，其中所述抗体特异性结合所述登革热病毒效应分子。
37.权利要求36的用途，其中所述登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白。
38.其量足以充分调变HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗所述人或猿的HIV或SIV感染的药物中的用途。
39.其量足以充分抑制HIV或SIV与人或猿的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗所述人或猿的HIV或SIV感染的药物中的用途。
40.权利要求39的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。
41.权利要求39的用途，其中预防或治疗人的HIV感染。
42.其量足以充分调变哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与所述哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN调变剂在制备一种用于预防或治疗所述哺乳动物的炎症的药物中的用途，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合引起。
43.其量足以充分抑制哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的结合的DC-SIGN阻断剂在制备一种用于预防或治疗所述哺乳动物的炎症的药物中的用途，所述炎症由哺乳动物的T细胞上的ICAM-3与哺乳动物的树突细胞上的DC-SIGN受体的特异性结合引起。
44.权利要求43的用途，其中所述DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒E糖蛋白的结合部分。
45.权利要求43的用途，其中所述哺乳动物是人。
46.一种药物组合物，其包含a)一种DC-SIGN阻断剂，和b)至少一种药物学可接受的赋形剂；其中所述DC-SIGN阻断剂以可达到的治疗浓度存在于组合物中。
47.权利要求46的药物组合物，其中所述DC-SIGN阻断剂是病毒效应分子的衍生物。
48.权利要求46的药物组合物，其中所述DC-SIGN阻断剂包含登革热病毒效应分子的结合部分。
49.权利要求48的药物组合物，其中所述登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白。
50.权利要求46的药物组合物，其中所述DC-SIGN阻断剂是抗体。
51.权利要求50的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
52.权利要求51的药物组合物，其中所述单克隆抗体是人源化的。
53.权利要求50的药物组合物，其中所述抗体特异性结合DC-SIGN。
54.权利要求50的药物组合物，其中所述抗体特异性结合病毒效应分子。
55.权利要求54的药物组合物，其中所述抗体特异性结合所述病毒效应分子的结合部分。
56.一种用于鉴别DC-SIGN调变剂的方法，其中所述方法包含a)通过以下步骤确定基线结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定基线结合值；b)通过以下步骤确定测试物质结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.在存在测试物质的情况下将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定测试物质结合值；以及c)通过将所述测试物质结合值除以所述基线结合值确定所述测试物质的测试物质结合调变值，其中代表所述测试物质对所述病毒效应分子与树突细胞的结合产生大约95％的调变的测试物质结合调变值，表示所述测试物质是充分调变病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的物质。
57.一种用于鉴别DC-SIGN阻断剂的方法，其中所述方法包含a)通过以下步骤确定基线结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定基线结合值；b)通过以下步骤确定测试物质结合值i.提供包含DC-SIGN受体的培养细胞；ii.在存在测试物质的情况下将所述培养细胞暴露于一种标记的病毒效应分子结合部分一段足够的时间以使结合达到平衡；以及iii.确定所述标记的病毒效应分子结合部分与所述培养细胞的结合程度，由此确定测试物质结合值；以及c)通过将所述测试物质结合值除以所述基线结合值确定所述测试物质的测试物质结合抑制值，其中代表所述测试物质对所述病毒效应分子与树突细胞的结合产生大约95％的抑制的测试物质结合抑制值，表示所述测试物质是充分抑制病毒效应分子与DC-SIGN受体的结合的物质。
58.权利要求57的方法，其中所述培养细胞是DC。
59.权利要求57的方法，其中所述培养细胞是THP-1细胞。
60.权利要求57的方法，其中所述病毒效应分子是登革热病毒效应分子。
61.权利要求60的方法，其中所述登革热病毒效应分子是登革热病毒E糖蛋白。
62.由权利要求57的方法鉴别得到的分离的DC-SIGN阻断剂。
63.一种通过将表达DC-SIGN受体的细胞暴露于导向复合物而将对象分子导向所述细胞的方法，其中所述导向复合物包含对象分子和DC-SIGN阻断剂，其中所述暴露在使得所述DC-SIGN阻断剂结合表达所述DC-SIGN受体的细胞上的DC-SIGN的条件下进行，由此将所述对象分子导向表达DC-SIGN受体的细胞。
64.权利要求63的方法，其中所述DC-SIGN阻断剂是抗体。
65.权利要求64的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
66.权利要求63的方法，其中所述对象分子是蛋白质。
67.权利要求63的方法，其中所述对象分子是抗体。
68.权利要求63的方法，其中所述对象分子是标记的。
69.权利要求63的方法，其中所述暴露发生于体内。
70.权利要求63的方法，其中所述暴露发生于体外。
71.一种药物组合物，其包含a)一种DC-SIGN调变剂，和b)至少一种药物学可接受的赋形剂；其中所述DC-SIGN调变剂以可达到的治疗浓度存在于组合物中。
全文摘要
本发明涉及用于预防或治疗包括病毒感染在内的哺乳动物的疾病的方法和组合物，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由一种效应分子与待治疗的哺乳动物的细胞上的DC－SIGN受体的结合所介导。本发明还提供鉴别组合物的方法，其中所述组合物可用于治疗包括病毒感染在内的哺乳动物的疾病，其中所述疾病的至少一种症状至少部分由一种效应分子与待治疗的哺乳动物中表达DC－SIGN受体的细胞上的DC－SIGN受体的特异性结合所介导。本发明还涉及将对象分子导向表达DC－SIGN受体的细胞的组合物和方法。
文档编号A61P31/14GK1738637SQ200380102859
公开日2006年2月22日 申请日期2003年11月5日 优先权日2002年11月5日
发明者阿里·阿玛拉, 费尔南多·阿伦萨纳－塞斯德多斯, 菲利普·德普雷斯, 让－路易·维雷利齐尔 申请人:巴斯德研究院, 国家健康与医学研究院