利用超声波处理液体介质以防止过度增殖或感染细胞生长的设备与方法

专利名称：利用超声波处理液体介质以防止过度增殖或感染细胞生长的设备与方法
技术领域：
本发明涉及利用高频、低能超声波来处理液体介质。在具体实施方案中，本发明的设备和方法能够显著诱导悬浮在生理液体中的细胞凋亡。
背景技术：
细胞在暴露于超声波中可引起损伤。例如，超声波能够引起不可逆的细胞损伤和诱导破坏性的细胞膜的改变。某些报道提出，由产生自声压场(acoustic pressure fields)的气泡崩解引起的空穴作用可能是超声波辐射作用后引起细胞损伤的原因。同时还提出，通过残留的过氧化氢作用造成的空穴作用可诱导DNA单链的断裂。
超声波在癌症治疗中的应用已经成为一个重要的方面。超声波通常与高温、以及光、放射和化疗联合使用。已知恶性细胞比其对应的正常细胞对这些联合治疗更加敏感。对某些分子(例如，经典的光敏剂和声敏剂)的直接辐射作用(例如，超声波、激光、光照)产生诸如单线态氧、超氧自由基、过氧化氢和脂肪酸自由基的高活性氧类，其能够选择地作用于恶性细胞从而在癌症治疗中发挥重要作用。
根据放射的来源，上述治疗称为PDT(光能治疗)，或者如果通过超声波或声致发光则称为SDT(声能治疗)。这两种治疗都预先需要光敏剂的加入。尽管在细胞生存能力方面通过SDT和PDT产生的总的作用不同，但SDT(特别是涉及超声波空穴作用活性)和PDT均产生活性氧化类物质并导致细胞内硫醇水平的降低。在使用紫外线-A(UVA)的PDT时，单线态氧的产生能够诱导T辅助细胞的凋亡，但是该作用必须依赖光敏剂(PS)的起始浓度和局部氧的含量。对于SDT，因有高能量参与，细胞裂解为主要的现象，这可能会掩盖对活存细胞的其它作用。
Umemura等的美国专利第4,971,991号公开了利用超声波治疗肿瘤细胞，但其依赖较高的超声波功率电平，并没有描述微泡的应用。诸如D’Arrigo的美国专利第5,215,680号的其它专利描述了超声波和微泡，其依赖于超声波的空穴作用和热作用来治疗肿瘤，与治疗单独的癌症细胞相对比，由治疗持续时间和数量来确定其治疗的范围。这种类型的治疗使用高能量和长时间的辐射，主要产生细胞的裂解和坏死。参见Kondo，Cancer Letters 178(1)，63-70，(2002)。
附图的简要说明

图1所示为本发明所述的超声波处理设备的一个实施方案。
图2所示为利用超声波和微泡处理悬浮液中过度增殖细胞的设备的三种视图。最左侧图为所述设备的俯视图，中间图为主视图，及最右侧图为所述设备的侧视图。
图3所示为超声波处理对细胞谷胱甘肽水平作用的柱状图。数据以相对于未处理细胞表现出谷胱甘肽水平的细胞的百分比来表示。数值是3个独立实验的平均值±标准误。
图4所示为表示高频超声波对细胞caspase-3活性作用的柱状图。
图5所示为辐射对K562细胞克隆效率作用的柱状图。结果以3个独立试验的平均值±标准误表示。
图6所示为经1次或3次超声波处理后5小时K562凋亡细胞的百分率柱状图。用Annexin-V标记后由流式细胞计量仪测定凋亡比值，并且结果以7个独立实验的平均值±标准误表示。
图7所示为磷脂酰丝氨酸分布依据时间和连续的超声波处理而变化的点图。来自一个代表性实验的结果以被Annexin-V-FITC标记的细胞的百分率表示。
图8所示为超声波处理对正常单核细胞(MNC)和白血病细胞(Nalm-6、KGla、HL-60细胞和来自5例患者的原代白血病细胞)凋亡作用的柱状图。结果为5个独立实验的平均值±标准误。
发明的详细描述凋亡或程序性细胞死亡是多细胞器官发育和健康的正常组成部分。凋亡保证了组织在发育、宿主防御、衰老和对包括γ辐射和紫外暴露的多种信号产生反应过程中的自我平衡。细胞响应各种刺激而发生的死亡，特别是在凋亡过程中，这种死亡是以受控方式进行的。这使得凋亡不同于另一种称为坏死的细胞死亡形式，在坏死中不能控制的细胞死亡导致细胞的裂解、炎症反应以及可能发生各种健康问题。相反，凋亡是细胞在其自我死亡的中能够发挥活性作用的过程，这是为什么凋亡常称为细胞自杀的原因。
当接收到特异信号指示细胞发生凋亡时，通常在细胞中发生了一系列特殊的生化和形态学变化。例如，在凋亡早期通常有称为caspases的蛋白家族被活化。这些蛋白分解或裂解正常细胞功能所必需的关键细胞底物，包括细胞支架中的结构蛋白和诸如DNA修复酶的核蛋白。Caspases也能活化其它的诸如裂解核中DNA的DNase酶的降解酶。通常，凋亡细胞的死亡以核膜的早期变化、染色质凝集以及DNA片断化为特征。这些生化改变导致细胞的形态学变化。
本发明的教导涉及压制、防止液体介质中存在的过度增殖细胞(例如，肿瘤细胞)生长或清除这些细胞的设备和方法。在更具体的实施方案中，本发明提供的方法和设备诱导诸如生理液体的悬浮液中过度增殖细胞的凋亡。可处理的生理液体包括血液、血浆、血清及脑脊液，其能够从包括哺乳动物、人等等的动物中提取和/或给予该动物。
根据本发明教导的低能量、高频率超声波处理能够诱导过度增殖细胞的凋亡作用。这些作用包括例如，对线粒体膜的作用(线粒体电位的降低)、磷脂酰丝氨酸不对称性的丧失、激发膜脂质的氧化作用(细胞GSH水平的降低)、形态学改变、DNA片段化、浆膜缺失等等。此外，低能量超声波诱导的凋亡可参与细胞中caspase-3活化、caspase底物PARP的蛋白降解，以及bcl-2/bax比值的调节。
特定的实验(参见实施例)已经证实在快速诱导凋亡的同时产生有限的坏死数量。
设备与方法能够用于实现本发明方法的所述设备的实施方案能够在Cordemans等的美国临时申请第60/423,368号、美国申请第10/358445号以及美国专利第6,540,922号中发现，其中的每一篇均全部引用作为本文的参考。处理过度增殖细胞方法可利用本发明公开的设备来进行。一个能够用于处理诸如水性介质(例如，生理性液体)的液体介质设备的特定实施方案如图1所示。在某些的实施方案中，所述被处理的液体含有过度增殖细胞。在其它的实施方案中，所述被处理的液体可以是例如诊断后怀疑含有过度增殖细胞的生理性液体。也可以处理诸如干细胞的不完全分化细胞以及含有病毒和/或病毒感染的细胞的溶液。可处理的病毒的例子包括例如HIV、HCV、HBV、疱疹病毒、汉他病毒(hantavirus)、流感病毒及埃博拉病毒。
参照图1，本发明所述的设备包括隔室2，优选呈圆柱形或矩形横截面。在特定的实施方案中，所述隔室2与装载待处理的液体介质储存器(未显示)连接。在其它的实施方案中(例如，当人或动物生理性液体被处理时)，本发明所提供的设备不含有直接与人或动物体连接的储存器。这些实施方案包括那些其中包括在人和其它动物体的离体处理过程中所述生理性液体被提取和/或被给予(例如，再注射)的方案。据此，诸如人的动物能够被本发明所指的任何“储存器”所取代。
在其它实施方案中，如所示图2的设备能够处理过度增殖细胞悬浮液。在此实施方案中，空气进入管3用作微泡发射器3来发射微泡5进入包含在隔室(或poach)20中的所述过度增殖细胞悬浮液22。可将含有所述细胞悬浮液22的所述隔室(或poach)20浸入诸如恒温箱的水浴24中。
在进一步的实施方案中，所述隔室2含有(例如，沿其壁或在其底部附近)一种或多种高频超声波发射器1，其发射超声波4进入所述的隔室2(有利地应朝向此隔室2的中央)。在其它的实施方案中，所述容器还具有一种或多种微泡发射器3来发射气体微泡5，其被设计成发射所述气体微泡5进入超声波4发射到隔室2中的区域。
本发明所用术语“微泡”特指平均直径小于1mm的气泡。在一些实施方案中，所述直径小于或等于50μm。而在其它的实施方案中，所述微泡直径小于30μm。在某些的实施方案中，所述微泡选自空气、氧和臭氧或其混合微泡。为了降低操作成本，能够使用诸如空气微泡的非臭氧微泡是有利的。本发明有利的实施方案不依赖于产生热效应来处理细胞。尽管在特定的实施方案中使用稳定的微泡能够有效地处理细胞，但在优选的实施方案中，使用的稳定的微泡不是必需的。稳定微泡的一个例子是脂质边界(lipid boundary)微泡。
术语“过度增殖细胞”意指以相对较高水平分化、再生或增殖的细胞，并可包括癌症细胞(例如，白血病细胞)、前癌细胞、肿瘤细胞、骨髓细胞及全能细胞。
在某些实施方案中，术语“液体介质”涉及生理性液体，其可给予人或动物和/或从人或动物中提取。在具体的实施方案中，将生理性液体处理后进行再注射(例如，体外处理再回输)。在某些实施方案中，所述术语“生理性液体”包括但不限于血液、血清、脑脊髓液、脑脊液、血浆等等。Tachibana等发表的美国专利第5,401,237号描述了提取和再给予生理性液体的步骤，其全部在此引用作为本文的参考。
在具体的实施方案中，本发明所述方法和设备包括用低能高频超声波处理过度增殖细胞。术语“高频”意指高于100kHz并高达数MHz的频率。在某些的实施方案中，所使用的高频在200kHz与20MHz之间。在不同的实施方案中，所述的超声波频率选自200kHz与10MHz之间。在优选的实施方案中，所用频率在200kHz与1.8MHz之间。
在本发明所述设备的多种实施方案中，将用来发射气体微泡5的微泡发射器3置于隔室2的底部11(即在隔室2的基底部)，使得所述微泡通过自然上升或通过在所述液体流对气体的夹带来移动。
在进一步的实施方案中，本发明所述设备和方法诱导过度增殖细胞的凋亡。已发现，健康细胞比白血病细胞对高频超声波更加不敏感。这种健康与白血病细胞间的行为差异与内源性光敏剂的分布差异无关，但其可能是由例如p53状态、信号途径以及氧化应激的耐受性的基础细胞机制改变所引起。特别地，能够诱导癌症细胞(例如，白血病细胞)、前癌细胞、肿瘤细胞、骨髓细胞及全能细胞等等的凋亡。
虽然本发明的教导不能在任何方式上受其准确的作用机制的限制，但在更具体的实施方案中，本发明所述的设备和方法能够产生诸如ROS(活性氧类)、H·、·OH及HOO·的自由基，其还可形成H2O2，该分子和/或这些自由基对过度增殖细胞具有毒性并因此使其失活和/或破坏。产生自超声波状态下的氧化应激作用的脂质过氧化产物也可能是此生物机制的潜在参与者。
尽管证据不支持在声能治疗中有单线态氧的形成，但这些数据仅符合长时间和“高能量”超声波暴露状况，其可直接由于高温分解或者由于与水溶剂的高温分解所形成的H·或·OH自由基反应导致敏化剂衍生的自由基的累积。
使用所公开的方法和设备产生的物质应理解为衍生自高频超声波对水分子作用引起的反应，最有可能的是如下的反应(特别是在氧的存在下)
，
有利地，如本发明所述，如果此过程有微泡存在，产生这些毒性物质所需的能量会降低。在确定的实施方案中，发生器被设计成能够向所述超声波发射器提供低于1W/cm2的能量。在优选的实施方案中，所提供的能量约为0.5W/cm2或更低，或者在许多更有利的实施方案中，所述能量约为0.25W/cm2或更低。在有利的实施方案中，此应用于发射器的功率电平在所述生理性液体体积中消耗的能量低于30mW/cm3。在一些实施方案中，所述能量消耗约为7mW/cm3。
尽管在某些实施方案中可连续给予所述超声波，但在其它的实施方案中，所述超声波以开/关循环间断给予。根据细胞体积、细胞类型和其它相关变量，本领域所述技术人员可确定有效的开/关循环时间。
本发明教导的进一步实施方案涉及处理悬浮液中的过度增殖细胞，而不是肿瘤或瘤体。在这些实施方案中，本发明的教导不依赖微泡在特定的肿瘤位点来浓缩或汇集。这使得能够处理没有丛生在一起的不需要的过度增殖细胞。
本发明所提供方法和设备的另一个优点是在较短的时间内可有效处理所述的过度增殖细胞。在特定的实施方案中，在1分钟内能够处理过度增殖细胞。在更特定的实施方案中，所述细胞在30秒内被处理，例如包括5-20秒之间。
如本领域所公知，超声波作用的生物物理方式分为具有热、空穴作用或者具有非热和非空穴作用。需要指出的是使用上述能量范围和缩短处理时间可避免显著的液体和/或细胞受热，这使得不发生热致细胞死亡。作为例子，非热作用处理包括在低于40℃、35℃及30℃下进行的处理。所述功率电平同样是不发生明显程度的空穴作用的水平，从而基本避免由超声波引起的细胞膜损失。
最近发现，在较高超声波能量下微泡注入到超声波区域通过微泡在超声波诱导空穴泡上的叠加作用引起声致发光现象的增加，可使激发和有毒的物质的数量增多。当超声波处理协同结合适合大小的微泡存在下，能够在宏观水平观察到此现象。
在另外的实施方案中，因为观察到该处理系统通过将原位形成的产物(例如形成的自由基和H2O2)向待处理的水性介质的储存器6的扩散来发挥功能，所以本发明提供的所述设备和方法具有不需将超声波射入特定区域的优点。
在进一步的实施方案中，在本发明所述设备中的所述的一种或多种超声波4发射器1定向成不产生任何驻波现象。例如，在某些实施方案中，一种或多种超声波发射器相对于所述隔室2的轴9并相对于液体流和微泡流5斜向定向(不垂直于此轴9的锐角)(参见图1)。这种特征使在隔室2中的所有微泡5以统计学上一致的方式被处理，而不在隔室2中产生静止带。
本发明所述的设备和方法可包括发射具有平均直径小于1mm的气体微泡进入被处理液体介质的高频超声波区域。在一些实施方案中，所述微泡的直径小于或等于50μm。在另外的实施方案中，所述微泡的直径小于30μm。在某些的实施方案中，所述微泡选自空气、氧和臭氧微泡。在其它的实施方案中，所述微泡是非臭氧微泡。
根据其它的实施方案，本发明所述设备和方法包括光发射器12(即电磁辐射发射器)，其发射主要为可见范围频率的辐射进入隔室2中的所述超声波4区域。然而，对于特定的应用，为了去除某些特定的过度增殖细胞，发射主要为非可见频率的电磁辐射是有利的，如紫外线(例如，UVA、UVB或UVC型)、红外、激光、微波等等。
最近意外地发现，包括微泡发射进入所述区域，结合有超声波和可选择的光辐射对失活和去除诸如生理性液体的液体介质中的过度增殖细胞特别有效。发光现象能够促进超活化氧化物质诸如过氧化自由基或单线态氧的产生，其能够导致对某些过度增殖细胞具有超毒性的一系列生化反应。在有利的实施方案中，所述的辐射以开/关循环间断发射。在更具体的实施方案中，所述开/关循环周期约为5.5ms/3ms。
已知在所谓敏化分子(例如，光敏剂和声敏剂)的存在下能够产生发光，使得在某些癌症细胞中产生抗肿瘤作用。这种分子包括卟啉、氯、四环素类、亚甲基兰、荧光素、吖啶、若丹明(rhodamine)等等。可将这些活性试剂注射入有机体或口服给药并随后由声致发光来活化。活化后，这些试剂产生单线态氧，其进而发挥基础作用，特别是在由氧化应激产生的生化过程中发挥基础作用。特别地，单线态氧能够氧化各种细胞成分，例如蛋白质、脂质、氨基酸和核酸。
在其它的实施方案中，固体微粒和固体表面能够用来协同增强辐射的发光和/或发射。这些固体包括例如TiO2、陶土和陶瓷。
许多实施方案涉及不需要附加化学产物的设备和方法，该化学产物诸如用来压制、防止生理性介质中过度增殖细胞生长和/或去除该细胞的光敏剂和/或声敏剂。由于意外地发现已经含有这些光敏分子的生理性液体(例如，血液)中的某些过度增殖细胞(例如白血病细胞)能够原位产生发光，因此将光敏剂或声敏剂加入到所述的液体介质中并不总是必要的。
尽管本发明所述的设备和方法能与其它诸如光敏剂、声敏剂、化疗剂、抗生素、抗病毒药物的药物联合使用，但需指出的是，本发明所提供的处理过度增殖细胞的方法和设备的有效性并不依赖于其它化学药品、反应试剂或药物的使用。因此，本发明所述方法和设备能够在没有其它物质条件下使用，该物质包括化学药品、反应试剂、激素、肽、蛋白质、核酸、碳氢化合物、DNA疫苗、血管生成刺激剂或药物。在更多具体地实施方案中，本发明的教导不依赖于细胞对这些物质的吸收。
特别地，在不需要典型的光敏剂和声敏剂的条件下可实现本发明教导所得到的效果。利用诸如PDT的技术获得的生理作用同时依赖于所使用的辐射剂量、使用光敏剂的特性、它们的含量以及它们的分布。尽管进行传统的处理需要敏化剂，但本发明提供的教导不需要敏化剂，因此相对简化所述的方法和设备。
在某些实施方案中，超声波作用的净效果与结构中局部含有较高含量的内源性光敏剂相关联。例如，内源性光敏剂主要分布在诸如溶酶体、线粒体、核膜、高尔基体及内质网的微粒体的膜结构中，其相对的表面占细胞膜表面的接近50％。
在一些实施方案中，本发明所述设备和方法包括循环所述液体介质的泵，以及一种或多种优选通过过滤、离心或沉淀(例如旋转等等)用于恢复所述液体介质中存在的过度增殖细胞的装置。在某些实施方案中，将所述用于恢复的泵和/或恢复装置被置于所述含有所述待处理液体介质的储存器(或动物)与所述隔室2之间。
在某些实施方案中，本发明所述设备和方法能够用来从怀疑患有(例如，诊断的)癌症(例如，白血病)的个体中提取生理性液体(例如，血液)。在提取后，能够用高频低能超声波和直径小于1mm的气体微泡处理该生理性液体。在某些实施方案中，所述方法诱导所述癌性细胞(例如，白血病)的凋亡。在处理所述生理性液体使得所述过度增殖细胞被充分压制、防止生长或被去除后，所述液体随后能够给予所述的个体。这些方法以与其它的体外处理再回输的方法相似的方式进行，例如血液透析。
可将进行血液处理个体与本发明所述的设备中的一种相连接。根据某些实施方案，可通过所述个体手臂内部的瘘管将其血流连接到本发明所述的超声波设备上。这包含了动脉与静脉间的手术性连接。当它们连接后，从动脉而来的较强的血流会引起静脉变粗。可将针插入增粗的静脉中来将所述个体与所述超声波设备连接起来。
提供进入血流的另一种方式是插入内在的移植物。在此步骤中，用放置在皮下的一段特殊的短管将动脉与静脉手术连接，针能够插入该短管。
在其它的实施方案中，当有必要快速到达所述的血流时，或者例如当所述手臂中的所述静脉太小不能提供足够的用于超声波处理的血液时，可使用某些静脉导管。在此步骤中，软管被手术插入颈部或近锁骨处的大静脉中。在一些实施方案中，在持久的进入位点就绪之前该方法是临时的。
能够根据本发明所述的方法处理的个体包括任何动物，例如包括人小鼠、猴子、狗、猪等等的哺乳动物。
在进一步的实施方案中，本发明所述设备和方法利用低能、高频超声波通过诱导细胞(例如白血病细胞)的凋亡来预防、治疗或压制过度增殖细胞。诱导过度增殖细胞的凋亡能够引起一系列特征后果，包括线粒体电位的降低、磷脂酰丝氨酸不对称性的丧失、形态学改变、DNA片段化、浆膜缺失等等。此外，低能超声波诱导的凋亡能够包含细胞中的caspase-3活化、caspase底物PARP的蛋白降解以及bcl-2/bax比值的调整。
附加的方法包括利用超声波诱导的声化学发光，通过直接的光辐射激发光敏性单线态氧产物来启动凋亡。在典型的超声波辐射条件下，所述直接的破坏性空穴作用在该声致发光中起主导作用，其在所述介质中没有介入空气/液体界面时相当弱。据此，为增强空穴作用中的发光，联合使用微泡与超声波是有利的。
以下的实施例描述了利用高频低能超声波处理，以及显示所述细胞凋亡存在的各种分析。
实施例1细胞的制备与高频超声波处理将从美国典型培养物贮藏中心(ATCC，Rockville，MD，美国)获得的人白血病细胞株(K562、Nalm-6、KGla及HL-60)培育在含有10％胎牛血清(Gibco，Grand Island，NY，美国)和1％L-谷酰胺(Gibco)的RPMI-1640(BioWhittaker，Walkersville，MD，美国)中。收集白血病细胞，以磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2，Gibco)重悬，并立即用于实验。从健康志愿者和白血病患者中获得肝素化的静脉血液。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心(International Medical Products，Brussels，Belgium)来分离单核细胞。
以下描述了对所述细胞的超声处理。通过频率为1.8MHz的超声波、7mW/mL的声能、以5.5ms/3ms的辐射周期(开/关)在不同暴露时间下处理人白血病细胞株(K562、HL-60、KGla及Nalm-6)、原代白血病细胞以及正常单核细胞。
在培养箱(37℃和5％CO2)中培养18小时后，通过台盼蓝排除分析可成功地检测所述细胞的存活。在以下的实施例中将详细描述对所述处理的细胞进行的其它实验。通过细胞形态学、磷脂酰丝氨酸暴露及DNA片段化来评价细胞凋亡。通过流式细胞计量仪来检测线粒体电位、谷酰胺含量、caspase-3活化作用、PARP降解以及bcl-2/bax比值。在甲基纤维素中评价克隆效率。
实施例2高频超声波对DNA片段化的作用DNA片段化与凋亡相关。根据Nicoletti，I.et al.J Immunol Methods139(2)271(1991)所述的方法及Apotarget Quick DNA Ladder检测试剂盒(Biosource)对含有降解DNA的细胞进行定量。将细胞团(106细胞)重悬浮在20L的裂解缓冲液中并根据厂商说明书来抽提DNA。通过凝胶电泳(1％琼脂糖)分离DNA后进行分析。作为阳性对照，将平板直接放置在UV发光器下10分钟(强度为5mW/cm2)利用UV光照射细胞。随后，在评价凋亡之前，将细胞培养在37℃、5和18小时。
在通透化后，将细胞在含有PI和RNAse(Coulter DNA-prep反应剂)溶液中孵育。在进行流式细胞计量仪鉴定与凋亡对应的亚G0峰之前，将该小管在4℃放置在黑暗中过夜。
在经紫外光(阳性对照)和超声波处理细胞的DNA样品中观察到典型的核小体DNA梯状带形式。超声波处理5小时后几乎没有可见的内部核小体DNA降解但在18小时以后变得清晰可见(结果未显示)。此外，处理5小时后用PI染色可观察到具有片段化DNA的核的数量的增加。具体地，15％的所述处理细胞具有片段化DNA，而2％未处理的细胞具有片段化DNA(数据未显示)。
实施例3高频超声波对线粒体跨膜电位的作用在细胞凋亡的一些类型中，观察到了早于发展的DNA片段化的线粒体跨膜电位(ΔYm)的早期中断。通过以下的分析来测定高频超声波处理对ΔYm的作用。
根据A.Macho，et al.，Blood.86(7)2481(1995)发表的步骤在细胞处理后即刻利用与阳离子荧光染料DiOC6的结合来估计线粒体电位。
简而言之，将K562细胞(106/mL)与2.5nmol/L的3，3′-二己基氧羰花青(DiOC6；分子探针，Eugene，OR)在37℃孵育15分钟，随后用流式细胞计量仪来分析。
超声波处理伴随着显示较低的ΔYm的细胞群的增加(结果未提供)。在处理后30分钟发现显示与DiOC6结合减少的细胞群，并且在超声波处理后5小时线粒体电位的降低非常清楚，超过50％的细胞具有较低的ΔYm。这些结果提供了细胞凋亡的证据。
实施例4高频超声波对细胞谷胱甘肽水平的作用已表明在凋亡过程中有谷胱甘肽的丢失。在超声波处理后进行了测定细胞谷胱甘肽含量的分析。如D.W.Hedley et al.Cytometry 15349(1994)所述，使用细胞示踪绿CMFDA(5-氯甲基荧光素二乙酸酯；分子探针)来测定细胞内谷胱甘肽水平。
如图3所示，与未处理细胞相比，在超声波处理后直接出现显示出较低GSH水平的亚群(＞50％的细胞显示低水平GSH)。连续处理的结果显示，5小时后较多的GSH丢失。这些结果与未处理细胞比较，以显示GSH水平的细胞百分比来表示，清楚地表明高频超声波处理与GSH丢失相关。
实施例5高频超声波对细胞caspase-3活性的作用已表明Caspase-3在化疗诱导的凋亡中发挥重要作用。具体地，caspases的活化作用通过诸如肌动蛋白、凝溶胶蛋白或PARP的细胞底物的降解可导致细胞死亡。为直接证实caspase-3在超声波诱导凋亡中的参与作用，利用流式细胞计量仪和比色分析测定了caspase的活性。
具体地，利用具有抗caspase-3单克隆抗体活性的与藻红蛋白(PE)结合的多克隆兔抗体(BD-Pharmingen，San Diego，CA，美国)，通过流式细胞计量仪来测定caspase-3。室温下利用固定与通透试剂盒(Caltag，Burlingame，CA)固定和通透化细胞15分钟。随后用抗caspase-3抗体标记细胞并孵育15分钟。洗涤细胞并通过流式细胞计量仪来分析。根据厂商建议，利用Apotarget的caspase-3/cpp32/比色蛋白酶分析试剂盒(Biosource)测定caspase-3酶活性。也可以通过PARP降解，利用兔抗PARP降解位点AB与FITC结合(Biosource)来间接评价Caspase-3活性。
如图4所示，高频超声波处理导致caspase-3的活化。此外，在处理后1小时此蛋白酶的活性达最高。而且，在处理后2小时PARP的降解明显，有40％的细胞被兔抗-PARP FITC标记，与之相比只有5％的未处理细胞被标记(结果未显示)。
实施例6高频超声波对细胞BCL-2/BAX比值的作用已表明bcl-2家族的不同蛋白在启动和防止凋亡中有作用。进行以下的分析来测定bcl-2家族的两个主要成员bcl-2与bax是否参与了超声波对凋亡的诱导作用。通透化后，细胞与同型匹配阴性对照、FITC标记小鼠抗人bcl-2(Dako，Glostrup，Denmark)、以及抗bax的多克隆兔抗体一同孵育。随后将FITC标记的第二抗体(Dako)加入到bax。为确定bcl-2与bax的表达量，通过用已知含量的荧光染料标记的颗粒混合物(Dako)来标准化所述的细胞计量仪。随后利用标准曲线将荧光强度平均值(MFI)转化为等价的可溶性荧光染料的摩尔数(MESF)。
结果(数据未提供)显示，未处理的细胞表达高水平的抗凋亡蛋白bcl-2蛋白((47±4)×103MESF)，并且此表达以荧光单峰的形式出现。超声波处理1小时后，bcl-2蛋白的表达已被下调(用超声波进行1或3次处理的K562细胞中分别为(40±0.9)×103MESF和(32±0.9)×103MESF)。处理后两小时，bcl-2表达出现明显的双峰，所述细胞表现出或者高bcl-2(与未处理细胞比较)表型或者低bcl-2((11±2)×103MESF)表型。
与bcl-2相反，与未处理细胞比较，在超声波处理的细胞中促凋亡蛋白bax的水平明显增加(处理和未处理的K562分别为(85±0.5)×103MESF和(48±5×103MESF)。因此，高频超声波处理过程中bcl-2/bax比值显著降低，以此提供了细胞凋亡的证据(对照细胞为0.98而超声波处理细胞为0.38)。
实施例7高频超声波对细胞磷脂酰丝氨酸水平的作用在凋亡中，磷脂酰丝氨酸残基从质膜的内面翻转到外面，且此变化能够利用结合PS残基的Annexin-FITC来测定。以下描述了所进行的Annexin V结合分析。依照厂商建议，使用购买自Biosource International(Camarillo，CA，美国)的试剂盒，对用Annexin-V-荧光素异硫氰酸酯(FITC)-和碘代吡啶(PI)-标记的细胞进行流式细胞计量仪分析。数据以显示Annexin-V-FITC/碘代吡啶的平均荧光强度变化的点图表示(未显示)。
结果表明，依据时间，磷脂酰丝氨酸分布随时间的变化而不同。具体地，结果显示细胞中经超声波处理引发的质膜损伤呈现低百分比，这表明测试的超声波处理的坏死作用是非常弱的。有意思的是，在处理两小时后，观察到了凋亡细胞的增加。处理五小时后，35％的细胞为Annexin-V-阳性，表明了超声波诱导K562细胞凋亡的作用。
实施例8高频超声波对克隆形成的作用对细胞存活力起作用的重要证据是细胞增殖和形成克隆的不能。以下描述了克隆形成分析，其针对K562细胞株进行来测定高频超声波辐射对克隆形成效率的作用。简而言之，培养基由含有20％FCS和终浓度为4％的甲基纤维素的IMDM构成。在37C、含5％CO2的空气中进行培养，且5天后计数克隆(＞20个细胞)。K562细胞株的克隆形成效率为16％。如图5所示，在1和3次处理后，观察到K562细胞的克隆形成效率显著降低(分别抑制25％和42％)，证明了白血病细胞对高频超声波的敏感性。
实施例9去氧剂对凋亡的作用进行以下步骤来测定由高频超声波产生的活性去氧剂对凋亡的诱导作用。用L-组氨酸(10mM)和/或甘露醇(100mM)孵育K562细胞。一些细胞用高频超声波处理而另一些不用。通过Annexin-V/PI分析测定细胞凋亡。结果见表1，表明在组氨酸和甘露醇存在下超声波诱导的细胞凋亡明显减少(通过3次连续处理诱导的凋亡分别抑制43％和47％)。
表1活性去氧剂对超声波诱导的细胞凋亡的作用

结果以处理5小时后显示磷脂酰丝氨酸表面化的细胞百分比来表示(来自4个独立实验的平均值±标准误)。
甘露醇与组氨酸联合可导致超过60％的凋亡抑制。这些试剂在降低由超声波处理诱导的凋亡方面的有效性为超声波诱导的单线态氧自由基和氢氧自由基是诱导凋亡的重要介导剂提供了证据。
实施例10连续高频超声波处理对细胞的作用对超声波处理后培养0.5、2和5小时的K562细胞重复进行了流式细胞计量仪的分析。一次处理后，观察到凋亡细胞的水平是对照的三倍(处理和未处理细胞培养5小时后分别为26％和8％)。还观察到有5-10％的坏死作用，其显著低于利用药物处理和光能处理(PDT)时所观察到的。通过连续的辐射，在相同的条件(7mW/mL，20秒)以及在不同的间隔下，在1和3次连续的处理后，K562细胞的凋亡分别增加至37±3％(p＜0.02)和49±5％(p＜0.02)(图6)。连续处理后还观察了形态学的变化(例如，细胞皱缩、膜出泡、染色质凝集)(结果未显示)。图7显示，在连续高频超声波处理后通过Annexin-V分析检测的细胞磷脂酰丝氨酸含量增加。
实施例11高频超声波对不同细胞株的作用除K562之外，检测了超声波处理对其它正常和恶性细胞株的作用，包括KGla(最小分化幼稚急性髓性白血病母细胞)、HL-60(前髓白血病细胞)和Nalm-6(ALL细胞株)。结果如图8所示，表明对超声波的敏感性依赖于细胞类型，但连续的处理导致所评价的所有细胞株的凋亡细胞数量的显著增加。
还用超声波处理了来自5例患者的单核细胞(1例有过量母细胞的难治贫血[RAEB]、1例继发性急性髓性白血病[AML]、以及3例分类为M3、M4和M4Eo的AML法国-美国-英国[FAB])，并参照以往F.Lacombe，F.etal.Leukemia 111878(1997)的描述，根据其CD45的表达可从污染了正常的细胞中区分母细胞。也可以通过FITC-Annexin对这些细胞中暴露的磷脂酰丝氨酸的识别对其进行标记。此方法使得经超声波处理的白血病母细胞和正常细胞的各自凋亡行为的比较成为可能。如图8所示的结果表明，原代白血病细胞对超声波处理敏感，3次处理后5小时观察到的凋亡细胞超过37±18％。
以上描述详细阐述了本发明教导的某些实施方案。然而应理解，虽然无论上文出现的描述有多详细，本发明所述的设备和方法能够以多种方式来实施。同样如上所述，应指出的是，在描述本发明教导的某些特征或方面所使用的特定名词术语不应视为本发明中的再定义，用来限制与该术语相关的包含本发明教导的特征和方面的任何特定的特性。因此本发明教导的范围应根据附具的权利要求及其任何等价物来解释。
权利要求
1.处理细胞悬浮液的设备，包括含有液体的隔室，所述液体含有过度增殖、未分化或病毒感染的细胞；设计成以不引起显著空穴作用或显著加热所述液体的功率电平和持续时间，发射具有高于100kHz的频率的超声波的发射器；及设计成向所述隔室中的所述超声区域发射平均直径小于1mm的微泡的微泡发射器。
2.如权利要求1所述的设备，其中所述气体微泡选自空气微泡和氧气微泡。
3.如权利要求1所述的设备，其中所述隔室含有从哺乳动物中提取的生理性液体。
4.如权利要求1所述的设备，其中所述生理性液体选自一种或多种血液、血浆、血清或脑脊液。
5.如权利要求1所述的设备，其中所述气体微泡的平均直径小于50μm。
6.如权利要求1所述的设备，其中所述气体微泡的平均直径小于30μm。
7.如权利要求1所述的设备，其中所述微泡发射器位于所述隔室的底部。
8.如权利要求1所述的设备，其中所述隔室包括被设计成连续或间断发射超声波的多个超声波发射器。
9.如权利要求1所述的设备进一步包括电磁辐射发射器。
10.如权利要求9所述的设备，其中所述电磁辐射发射器以一种或多种选自紫外线(UVA、UVB或UVC)、红外线及微波的频率发射连续或间断的辐射。
11.如权利要求1所述的设备进一步包括恢复存在于处理的生理性液体中的过度增殖、未分化或病毒感染的细胞的装置。
12.如权利要求11所述的设备，其中所述的用来收集过度增殖、未分化或病毒感染的细胞的装置选自过滤器和旋力分离器。
13.如权利要求1所述的设备进一步包括被设计成向所述超声波发射器提供低于1W/cm2能量的发生器。
14.如权利要求13所述的设备，其中所述能量以低于30mW/cm3的水平向所述生理性液体传送。
15.压制、清除和/或防止悬浮在生理性液体中的过度增殖、未分化或病毒感染细胞的生长的方法，包括向含有所述待处理生理性液体的隔室内发射频率高于100kHz的超声波；及向含有所述生理性液体的所述隔室中的所述超声波区域发射平均直径小于1mm的气体微泡。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述气体微泡不是臭氧微泡。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述气体微泡选自空气微泡和氧气微泡。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述生理性液体被给予哺乳动物和/或提取自哺乳动物。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述生理性液体选自血液、血浆、血清和脑脊液。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述气体微泡的平均直径小于50μm。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述气体微泡的平均直径小于30μm。
22.如权利要求15所述的方法，其中向所述隔室内发射的所述超声波不产生驻波场现象。
23.如权利要求15所述的方法进一步包括发射具有主要在可见光谱区的电磁辐射的光进入所述超声波区域。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述过度增殖细胞选自肿瘤细胞、骨髓细胞、肿瘤干细胞及前癌细胞。
25.如权利要求15所述的方法，其中所述过度增殖细胞为白血病细胞。
26.如权利要求25所述方法，其中所述方法通过体外处理再回输实施。
27.如权利要求15所述方法进一步包括向所述超声波发射器提供低于1W/cm2的能量。
28.如权利要求27所述方法，其中所述能量以低于30mW/cm3的水平向所述生理性液体传送。
29.处理存在于生理性液体中的过度增殖、未分化或病毒感染细胞的生长的方法，包括向含有所述待处理生理性液体的隔室内发射频率高于100kHz的超声波；及向含有所述生理性液体的隔室中的所述超声波区域发射平均直径小于1mm的气体微泡，使得所述超声波和微泡的发射诱导所述过度增殖、未分化或病毒细胞的显著凋亡。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述气体微泡不是臭氧微泡。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述气体微泡选自空气微泡和氧气微泡。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述生理性液体被给予哺乳动物和/或提取自哺乳动物。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述生理性液体选自血液、血浆、血清和脑脊液。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述气体微泡的平均直径小于50μm。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述气体微泡的平均直径小于30μm。
36.如权利要求29所述的方法，其中向所述隔室内发射的所述超声波不产生驻波场现象。
37.如权利要求29所述的方法进一步包括发射具有主要在可见光谱区的电磁辐射的光进入所述超声波区域。
38.如权利要求29所述的方法，其中所述过度增殖细胞选自肿瘤细胞、骨髓细胞、癌细胞及前癌细胞。
39.如权利要求29所述的方法，其中所述过度增殖细胞为白血病细胞。
40.如权利要求39所述方法，其中所述方法通过体外处理再回输实施。
41.如权利要求29所述方法进一步包括向所述超声波发射器提供低于1W/cm2的能量。
42.如权利要求41所述方法，其中所述能量以低于30mW/cm3的水平向到所述生理性液体传送。
全文摘要
本发明公开了利用高频、低能超声波处理、防止生长及压制液体介质中过度增殖、未分化或病毒感染的细胞的设备和方法。
文档编号A61K41/00GK1741822SQ200380102757
公开日2006年3月1日 申请日期2003年11月4日 优先权日2002年11月4日
发明者埃里克·D·科尔迪曼斯·德莫伊勒内尔, 鲍德温·阿内卡尔, 伊夫·卡尼韦 申请人:阿什兰公司