治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法

专利名称：治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法
技术领域：
本发明涉及多肽、肺炎球菌多糖-多肽轭合物、编码肺炎球菌多肽的表达载体、引起抗肺炎球菌免疫反应的方法、及肺炎球菌感染的治疗与预防方法。
背景技术：
肺炎链球菌(S.pneumoniae)是通常可引起儿童、老人及免疫缺乏个体细菌性肺炎、脑膜炎、中耳炎及菌血症。肺炎链球菌可根据该菌体的荚膜多糖进一步分为约90种血清型。然而，通常由约30种的肺炎链球菌致病。世界卫生组织估计每年一百万的儿童因肺炎球菌脑膜炎及败血症而死亡，其中98％的死亡发生在发展中国家。具有抗药性的肺炎球菌株的出现使除抗微生物以外的治疗及预防肺炎球菌感染的方法更为需要。
发明概述本发明的一个方面以组合物为特征，其含有与肺炎链球菌荚膜多糖轭合的多肽，其中所述多肽含有肺炎链球菌溶血素(pneumolysin)蛋白质的至少400连续氨基酸的片段，其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO22)(例如在羧基末端)，其中所述多肽缺乏溶血活性，及所述组合物在给予哺乳动物时会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应为预防性和/或治疗性免疫反应。
肺炎链球菌溶血素蛋白质可含有SEQ ID NO1的氨基酸序列。某些实施方案中，所述多肽含有SEQ ID NO1的1-460氨基酸。在其它实施方案中，所述多肽含有SEQ ID NO1的1-464氨基酸、SEQ IDNO1的1-465氨基酸、SEQ ID NO1的1-466氨基酸、SEQ ID NO1的1-469氨基酸、或SEQ ID NO1的1-470氨基酸。
所述多肽可选择性缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ ID NO23)或氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO24)。
某些实施方案中，所述多肽由以下所构成SEQ ID NO1的1-460氨基酸残基，SEQ ID NO1的1-464氨基酸残基，SEQ ID NO1的1-465氨基酸残基，SEQ ID NO1的1-466氨基酸残基，SEQ ID NO1的1-469氨基酸残基，或SEQ ID NO1的1-470氨基酸残基。
某些实施方案中，所述荚膜多糖选自血清型4型、6B型、9V型、14型、18C型、19F型、及23F型。在一实施方案中，所述荚膜多糖为血清型14型。在另一实施方案中，所述荚膜多糖为血清型18C型。所述组合物可选择性含有多种不同的选自血清型4型、6B型、9V型、14型、18C型、19F型、及23F型的荚膜多糖。
由所述组合物可引起直接抗肺炎链球菌荚膜多糖、抗肺炎链球菌溶血素蛋白质、或抗肺炎链球菌荚膜多糖与抗肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫反应。
另一方面，本发明的特征为一种哺乳动物表达载体，其包含可操作地连接于核酸序列的启动子，所述核酸序列含有编码含肺炎链球菌溶血素蛋白质至少400连续氨基酸片段多肽的核酸，其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO22)(例如在羧基端)，所述多肽缺乏溶血活性，及在给予哺乳动物表达载体时，所述多肽会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
所述肺炎链球菌溶血素蛋白质可含有SEQ ID NO1的氨基酸序列。某些实施方案中，所述编码的多肽含有SEQ ID NO1的1-460氨基酸。其它实施方案中，所述编码的多肽含有SEQ ID NO1的1-464氨基酸、SEQ ID NO1的1-465氨基酸、SEQ ID NO1的1-466氨基酸、SEQ ID NO1的1-469氨基酸、或SEQ ID NO1的1-470氨基酸。
所述编码的多肽可选择性缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ IDNO23)或氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO24)。
某些实施方案中，所述多肽由以下构成，SEQ ID NO1的1-460氨基酸残基，SEQ ID NO1的1-464氨基酸残基、SEQ ID NO1的1-465氨基酸残基、SEQ ID NO1的1-466氨基酸残基、SEQ ID NO1的1-469氨基酸残基、或SEQ ID NO1的1-470氨基酸残基。
由所述编码的多肽引起的免疫反应能够直接对抗肺炎链球菌溶血素蛋白质。
另一方面，本发明特征为哺乳动物表达载体，其含有可操作地连接于核酸序列的启动子，所述核酸序列含有编码肺炎链球菌自溶素多肽的核酸，其中在给予哺乳动物所述表达载体时，所述多肽会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
某些实施方案中，所述编码的多肽含有SEQ ID NO14的氨基酸序列。其它实施方案中，所述编码的多肽由SEQ ID NO14的氨基酸序列所构成。
另一方面，本发明特征为一哺乳动物表达载体，其含有可操作性连接于核酸的启动子，所述核酸含有编码肺炎球菌表面蛋白A多肽的核酸，其中在给予哺乳动物所述表达载体时，所述多肽会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
某些实施方案中，所述编码的多肽含有SEQ ID NO18的氨基酸序列。其它实施方案中，所述编码的多肽由SEQ ID NO18的氨基酸序列所构成。
另一方面，本发明特征为含有选自SEQ ID NO1的1-460氨基酸，SEQ ID NO1的1-464氨基酸、SEQ ID NO1的1-465氨基酸、SEQ ID NO1的1-466氨基酸、及SEQ ID NO1的1-469氨基酸的氨基酸序列的多肽。
另一方面，本发明特征为引起哺乳动物免疫反应的方法，其通过给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应本发明所述组合物而进行。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
某些实施方案中，所述免疫反应为抗至少一型肺炎链球菌血清型的交叉反应性反应，其不同于所述组合物中存在的所述荚膜多糖血清型(如血清型7型、6B型、18C型、或23F型)。某些实施方案中，所述免疫反应为对抗至少一种链球菌属中的非肺炎链球菌种的交叉反应性反应。
另一方面，本发明特征为引起哺乳动物免疫反应的方法，其通过给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应的本发明所述表达载体(例如，溶血素、假溶血素、自溶素、或肺炎球菌表面蛋白A表达载体)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。某些实施方案中，所述免疫反应为对抗至少一种链球菌属中的非肺炎链球菌种交叉反应性反应。
另一方面，本发明特征为引起哺乳动物免疫反应的方法给予哺乳动物一种哺乳动物表达载体，所述表达载体含有可操作地连接于含编码肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段的核酸的启动子，并给予所述哺乳动物所述纯化的肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段，其中结合给药引起哺乳动物抗肺炎链球菌溶血素的免疫反应。
某些实施方案中，所述哺乳动物给予至少2、3或更多独立剂量的所述表达载体。所述剂量能以至少1、2、3、4、5、6、7或更多天数分别进行。
某些实施方案中，肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段的给药为所述表达载体给药后的至少1、2、3、4、5、6、7或更多天数。
另一方面，本发明特征为组合物，其含与非肺炎链球菌细菌多糖轭合的多肽，其中所述多肽含有肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸片段，其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ IDNO22)，所述多肽缺乏溶血活性，及所述组合物在给予哺乳动物时，会引起抗非肺炎链球菌的免疫反应。某些实施方案中，非肺炎链球菌选自肺炎球菌；流感嗜血杆菌b型；脑膜炎球菌A、B、或C群；及B群链球菌Ia、Ib、II、III、V、或VIII型。此组合物能引起哺乳动物体内免疫反应，通过给予所述哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物体内抗非肺炎链球菌的免疫反应所述组合物而实现。
另一方面，本发明特征为纯化抗体，其轭合于(例如选择性轭合于)本发明的组合物或多肽。例如，抗体可特异性轭合于组合物，所述组合物含有与肺炎链球菌荚膜多糖轭合的多肽，其中所述多肽含有肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸片段，其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO22)(例如在羧基端)，所述多肽缺乏溶血活性，及在给予哺乳动物表达载体时，所述组合物会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此抗体可为如单克隆或多克隆抗体。如杂合瘤的细胞株能用来制备分泌本发明的抗体。此抗体可用于治疗或预防肺炎链球菌感染，其通过给予所述哺乳动物治疗或预防性有效量的所述纯化抗体来实现。
本发明的一优点为某些实施方案中，第一血清型肺炎链球菌多糖-多肽轭合物可意外地提供交叉保护，对抗肺炎链球菌第二血清型的感染。所述交叉保护可增加所给轭合物在治疗或预防由多于一种肺炎链球菌血清型感染的有效性。由上所述，在无须提供每一种特定血清型的轭合物下，本发明可提供对抗肺炎链球菌多种血清型的保护。
本发明的另一优点为某些实施方案中，所述假溶血素多肽缺乏溶血活性。因此，所述假溶血素轭合物及表达载体与含有具溶血活性的天然溶血素或具部份溶血活性的类毒素溶血素的组合物相比，减少或缺乏毒性。
本发明的另一优点为某些实施方案中，编码溶血素截短物的表达载体，相反于编码溶血素点突变物的核酸，不可能回复而因此编码具溶血活性的毒性蛋白质。由于所述溶血素截短物缺乏导致溶血活性的部分溶血素在所述表达载体核酸序列的任何突变应不能再产生所述毒性。
除非另有定义，本发明所述的所有技术性及科学性术语具有本发明所属的技术领域的技术人员通常理解的相同意义。虽然与本发明所述的相似或相同的方法及材料可用于本发明的实践或实验，但以下对失活的方法与材料进行描述。所有本发明所述的公开文章、专利申请文献、专利、及其它参考书目均在此全部引用作为参考。假使术语上有争议，本说明书将加以限制。而且所述材料及方法仅为说明的目的，并不是对本发明的限制。
本发明其它特征及优点将从下列详细说明及所附权利要求书中显而易见。
附图的简要说明

图1为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图2为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图3为小鼠在血清型18C型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图4为小鼠在血清型18C型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图5为小鼠在血清型19F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图6为小鼠在血清型19F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图7为小鼠在血清型23F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图8为小鼠在血清型23F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图9为小鼠在血清型4型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图10为小鼠在血清型4型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图11为小鼠在血清型6B型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图12为小鼠在血清型6B型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图13为小鼠在血清型9V型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图14为小鼠在血清型9V型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图15为肺炎链球菌血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物第3次注射后，对肺炎链球菌血清型14型多糖的抗体反应。
图16以假肺炎链球菌溶血素DNA疫苗的初级强化(prime-boost)策略，产生的兔抗溶血素的抗体反应。
图17为注射编码肺炎球菌表面蛋白A的DNA疫苗的表达载体后的抗体反应。
图18为注射编码自溶素DNA疫苗的表达载体后的抗体反应。
图19为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型14型后的细菌清除率。
图20为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型7型后的细菌清除率。
图21为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型6B型后的细菌清除率。
图22为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型18C型后的细菌清除率。
图23为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型23F型后1小时的细菌清除率。
图24为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型23F型后3小时的细菌清除率。
图25为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后，感染肺炎链球菌血清型23F型后5小时的细菌清除率。
发明的详细描述本发明提供治疗或预防肺炎球菌的感染的组合物及方法。本发明所述的多肽、多糖-多肽轭合物、及表达载体在给予哺乳动物时，会引起所述哺乳动物的抗肺炎球菌免疫反应。这些组合物能用于对个体的预防性疫苗接种和/或治疗性引起感染个体的治疗免疫反应。
多糖-蛋白质轭合物多肽可与肺炎链球菌荚膜多糖以共价或非共价方式轭合。一般而言，所述轭合物的多肽成分包含肺炎链球菌溶血素蛋白质部分或突变的肺炎链球菌溶血素蛋白质；缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ IDNO22)；及缺乏溶血活性。所述多糖-多肽在给予哺乳动物时引起抗肺炎链球菌的免疫反应。所述免疫反应能直接抗所述多肽、所述多糖、或所述多肽与所述多糖的组合物。
所述轭合物的多肽成分能够利用重组DNA技术、天然物中纯化、或化学合成而制备。一般而言，所述多肽成分的氨基酸序列与天然生成的肺炎链球菌溶血素蛋白质不同。肺炎链球菌19A型溶血素多肽的序列如SEQ ID NO1(如实施例1)所述。示例性的轭合物的多肽成分包含但不限于SEQ ID NO1的氨基酸1-460、1-461、1-462、1-463、1-464、1-465、1-466、1-469、及1-470。
编码肺炎链球菌溶血素蛋白质的截短型和/或突变型的核酸可经如聚合链反应(PCR)制备。编码此等蛋白质的核酸可选择含有对特定表达系统偏好或不偏好的密码子。例如，所述核酸可为至少1个密码子改变，优选为至少10％或20％的密码子改变，因而使所述序列适合在于大肠杆菌、酵母菌、人、昆虫或CHO细胞中表达。
编码肺炎链球菌溶血素蛋白质的截短型和/或突变型的核酸可融合于编码下列物质的核酸序列(1)其它肺炎球菌蛋白质，如自溶素、表面蛋白A、神经氨酸酶、透明质酸溶解产物、胆碱结合蛋白A，或(2)来自有机体的非肺炎球菌蛋白质，如流感嗜血杆菌b型、脑膜炎球菌A、B、或C群，或链球菌B群。编码此融合蛋白质的核酸在表达系统中表达。
因宿主可能缺乏抗载体多糖的事先存在抗体，因此溶血素的截短物可用于多糖载体。溶血素在肺炎球菌感染中为剧毒因子，在不同亚型的肺炎球菌中所述溶血素几乎无抗原差异。
所述多糖-蛋白质轭合物在给予如人的哺乳动物时，所引起的免疫反应的强度、形式和/或时间超过仅给予多糖成分所引起的免疫反应。因此，所述多肽成分必须有足以引起所述增强免疫反应的一段长度。自然产生的肺炎链球菌溶血素蛋白质片段，其所述片段至少为8、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、425、450、460、465、460、465或更多的氨基酸长度。关于多肽，序列不同于天然产生的肺炎链球菌蛋白质，所述多肽至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多相同于天然产生的肺炎链球菌蛋白质，如SEQ ID NO1。
所述多肽成分优选缺乏天然肺炎链球菌溶血素蛋白质的溶血活性。一般而言，所述多肽成分显现出低于天然肺炎链球菌溶血素蛋白质的溶血活性的30％、20％、10％、5％、1％或更低。溶血活性分析可参见实施例3。通常，多肽的溶血活性可通过将所述多肽与如羊红血细胞的红细胞一起孵育，分析由所述多肽引起的溶血反应，予以确定(参见如Owen et al.(1 994)FEMS Microbiology Letters121217-222，为示例性溶血分析的说明)。
所述轭合物的多糖成分可为任何肺炎链球菌的荚膜多糖，包含但不限于亚型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，19A，20，22F，23A，23F，24F，27，33F，或34中的任何亚型。某些实施方案中，所述荚膜多糖选自亚型4，6B，9V，14，18C，19F，或23F。某些实施方案中，所述多糖为血清型14。其它实施方案中，所述多糖为血清型18C。一种或多种不同荚膜多糖可与单一多肽或多种多肽轭合。例如，多价轭合物可包含至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10种不同荚膜多糖。多糖可通过如单键连接(仅所述多糖的一端与所述多肽连接)、或通过环状键(单一多肽连接在环状多糖)或通过交联(多种多糖连接至多种多肽)与多肽轭合。
纯化多肽的方法，如实施例中所述假溶血素多肽，及实施例4所述多糖与多肽的轭合。关于多肽或多糖纯化及轭合过程的其它详细说明如美国专利第4,242,501；4,686,102；5,623,057；及5,565,204号所述。
本发明所述轭合物或多肽可给予哺乳动物，引起所述哺乳动物对肺炎链球菌的免疫反应(预防和/或治疗免疫反应)。含有轭合物或多肽的药物组合物可以在适合作为疫苗的药物可接受的载体、缓冲液、或防腐剂中给药，其包括但不限于生理食盐水或其它可注射液体。疫苗内也可惯例存在添加物，例如如乳糖或山梨糖醇的稳定剂；及促进免疫原性反应的辅剂，如磷酸铝、氢氧化铝、或硫酸铝及硬脂酪氨酸。所制备的疫苗亦可作为多价疫苗的组分，所述多价疫苗为对多种感染源引起的免疫反应。
所述组合物可以任何本领域已知的方法给予，如口服、肌肉内、静脉内、动脉内、椎管内、皮内、腹膜内、鼻内、肺内、眼内、阴道内、直肠内、或皮下给予。其可介入肠胃道或呼吸道中，例如经吸入含所述轭合物的溶液或粉末。某些实施方案中，所述组合物可经皮肤贴片给药。
药物组合物(如疫苗)以足以引起抗体产生的一定量给予，其成为免疫原性反应的一部分。由许多因素决定任何给定患者的给药剂量，包含患者体积、一般健康状况、性别、体表面积、年龄、给予的特定化合物、给药时间及路径、及同时给予的其它药物。具有常规技术的药剂师容易确定理想的剂量。
组合物引起宿主哺乳动物免疫反应的能力可通过本领域所属技术人员公知的免疫反应测量方法分析。例如，细胞毒性T细胞的产生可由51Cr释放分析方法确认，或通过测量细胞内细胞因子表达或分泌，或使用主要组织相容性复合体(MHC)四合体得知。标准分析，如酶连免疫吸收分析(ELISA)或酶连免疫斑(ELISPOT)，可用于测量因T细胞活化的细胞因子谱。T细胞增殖可以3H-胸苷摄取分析及其它公知分析测量。B细胞反应可使用本领域公知的如ELISA测量的分析。亦可使用其它的方法学评估所述轭合物对致病原相关损害或其它致病原水平的作用(如经所述轭合物处理的感染小鼠中肺炎球菌的清除率)。
本发明所述组合物可使用于药物的制造，以预防或治疗肺炎链球菌的感染或此感染相关的状态。
抗体抗多糖、溶血素或其组合物的抗体可用于预防或治疗的应用，以使第一个体到第二个体产生免疫能力(如放大第二个体对肺炎链球菌的免疫反应或当第二个体为免疫兼容患者时提供反应)。可在免疫兼容宿主体中产生抗多糖、溶血素或其组合物的抗体(如经由给予所述免疫兼容患者本发明所述轭合物)，从所述宿主中收获该抗体，并灌输至需要治疗或预防的受者，因此给予所述受者抗所述溶血素毒素及肺炎链球菌以及其它轭合由所述轭合物(如所述轭合物的所述多糖成分)引起的抗体的任何可能的细菌抵抗力。
由本发明所述组合物引起的抗体可制备成药物组合物，并用于赋予个体预防或治疗性的免疫反应。药物组合物的适和组分及给药方法如本发明所述。关于引起的被动免疫，所述药物组合物可含有多克隆抗体或单克隆抗体或其片段的衍生物。如标准临床技术所确定的，药物组合物含有预防性或治疗性有效剂量的抗体、片段或衍生物。编码肺炎球菌多肽的核酸编码肺炎球菌多肽或其片段或变异体的核酸可给药至哺乳动物(如人)，以在所述的哺乳动物中产生预防和/或治疗的免疫反应。所述免疫反应可为抗肺炎球菌体液和/或细胞免疫反应。
由所述核酸编码的多肽包含本发明所述轭合物的多肽、实施例所述假溶血素多肽、以及自溶素及肺炎球菌表面蛋白A及其片段和变异体。而且，核酸可编码二或以上的多肽、片段或变异体的组合物。此外，核酸可编码这些多肽、片段或变体的两种或更多种的组合。
核酸表达构建体可经由标准重组DNA方法制备。在构建体中可包含调控元件以促进编码所述多肽的核酸的表达。这些元件包含在人或其它哺乳动物中增进表达的序列，如启动子、在编码序列的5’和/或3’的RNA稳定序列，内含子(可位于所述编码序列内或附近的任何位置上)、聚(A)添加位点、以及复制起点和一个或多个编码选择性比标记的基因，所述标记使所述构建体在原核和/或真核宿主中复制并被选择出。T7聚合酶启动子或其它形式启动子(如组织特异性启动子或细胞特异性启动子如肌肉特异性启动子)选择性存在于所述编码序列的5’端，编码FLAG或其它mAb决定子的序列选择性存在于所述编码序列的3’端。所述构建体亦可包含其它转录及翻译信号，如Kozak序列。
所述构建体可另外包含编码目标信号的序列，所述目标信号将该编码多肽导向所欲的细胞内腔室，所述目标信号连接于所述多肽。目标信号可使所述编码多肽导向内质网(ER)、高尔基氏体、核、溶酶体、II级肽负载腔室、或内涵体，并包含信号肽、ER保留肽、及溶酶体目标肽。
所述核酸可用于任何可在哺乳动物细胞内表的的载体(vector)中。所述载体可为非病毒载体如质粒或细菌载体、整合病毒载体、或非整合病毒载体。适合载体例如其PCR产物可直接快速克隆的pcDNA哺乳动物表达载体家族(Invitrogen)。
各种传递系统可用于传递编码多肽的核酸至适当细胞中。编码所述多肽的核酸可在药物可接受载体中传递，如生理盐水，或有稀释剂或无稀释剂的胶状悬浮液或粉末。核酸可裸露或与传递载体连接，并利用本领域公知的传递系统传递，如脂质、脂质体、微球体、微颗粒、或微胶囊、金颗粒、ISCOMS、纳米颗粒、聚合物、浓缩剂、多糖、聚氨基酸、树突体、植物皂素、QS21、吸收增强材料、佐剂、或脂肪酸。核酸亦可传递至细胞中，如使用电穿孔法在体或体外传递至骨骼肌肉细胞中。
所述核酸可使用标准方法给药，如Donnelly等人，J.Immunol.Methods 176145，1994，及Vitiello等人，J.Clin.Invest.95341，1995中所述，可以任何本领域公知的方式传递至个体中，如口服、肌肉内、静脉内、动脉内、椎管内、皮内、腹膜内、鼻内、肺内、眼内、阴道内、直肠内、或皮下给予。其可介入肠胃道或呼吸道中，例如经吸入含所述轭合物的溶液或粉末。给药可为局部或全身性。
预期约100-2000μg核酸的剂量给予一个体。当患者为成人时，疫苗治疗方法如以微颗粒传递时，可肌肉内、皮内、吸入或皮下给药10-1000μg质粒DNA；或肌肉内或皮内给予裸露质粒DNA约10-2500μg，如100-2000μg，或500-1000μg，重复3-6次。如医学领域所公知的，任何患者的剂量给予依据许多因素，包含患者体积、一般健康状况、性别、体表面积、年龄、给予的特定化合物、给药时间及路径、及同时给予的其它药物。理想剂量是具有常规技术的药剂师容易确定的。
也可使用其它标准传递方法，如生物弹射击转移(biolistictransfer)或体外活体治疗(ex vivo)。体外活体治疗(ex vivo)中，抗原提呈细胞(APCs)如树突细胞、外围血液单核细胞或骨髓细胞可从患者或适当捐赠者中获得，且用所述核酸体外活体(ex vivo)活化，然后植入或再灌入患者中。
所述核酸可单独给药或与本领域公知的其它治疗组合给药，如抗微生物剂。而且，所述核酸可与其它设计增进免疫反应的治疗组合给药，如与本领域公知的佐剂、细胞因子(或编码细胞因子的核酸)、或CpG寡核苷酸共同给药。
核酸引起宿主哺乳动物免疫反应的能力可通过本领域公知的检测免疫反应的方法分析。例如，细胞毒T细胞的产生可在标准51Cr释放分析测定，或通过检测细胞内细胞因子表达或分泌得知，或使用MHC四合体测定。标准分析，如ELISA或ELISPOT，可用于检测因T细胞活化的细胞因子谱。T细胞增殖可以3H-胸苷摄取分析及其它公知分析来检测。B细胞反应可使用公知的如ELISA分析来检测。亦可使用其它方法来评估所述轭合物对致病原相关损害或其它致病原水平上的作用(如经所述轭合物处理的感染小鼠中肺炎球菌的清除率)。
本发明所述核酸可用于药物的制造以预防或治疗肺炎链球菌的感染或所述感染的相关状态。
本发明将在下列实施例进一步说明，以下实施例并非用以限定权利要求定义的本发明的范围。
实施例实施例1假溶血素表达载体的构建表达溶血素多肽截短型的载体描述于实施例1A-1E。所述编码的截短多肽称为“假溶血素”多肽，可与溶血素多糖轭合，制备所述轭合物疫苗。而且，编码溶血素多肽的核酸可给予个体，以产生抗所述编码的多肽的免疫反应。
以肺炎链球菌19A型染色体DNA为模板进行PCR，扩增所述溶血素基因的不同片段。用于PCR反应的有义引物退火于翻译起始密码子的上游的溶血素基因的编码序列，并连接有特定的限制性内切酶位点。所述有义引物为LYSN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；SEQ ID NO2)，与溶血素基因5’端的1-24核苷酸互补。其反义引物为LYSN-3(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’；SEQ ID NO3)，与溶血素基因3’端的1396-1413溶血素核苷酸互补。所述引物扩增编码溶血素蛋白质全长471个氨基酸的1413bp的DNA。以下是肺炎链球菌19A型溶血素蛋白质的氨基酸序列MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVEND(SEQ ID NO1)。
PCR一般进行如下94℃、4分钟，1个循环；随后为94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1.5分钟，30个循环；及最后72℃、10分钟1个循环。以NdeI及BamHI限制性内切酶消化所述PCR合成的DNA片段，并将其连接至pET11b表达载体(形成pSA-14)。将此重组DNA转化至大肠杆菌DE3细胞中。筛选抗氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶消化来确认所述DNA片段是否插入。
与野生型基因组序列比较，所述扩增的DNA片段3’端缺乏核苷酸。由此种修饰核酸所编码的假溶血素多肽为非溶血性及非细胞毒性，但仍保留免疫原性能力。
A.pSA-1表达载体的构建所述的pSA-1表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO1的1-460氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR，使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；SEQ ID NO2)及LSYN-4(5’-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3’；SEQ ID NO5)引物扩增1380bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制内切酶消化，连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点，形成pSA-1。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选抗氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入，并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的460氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的11个氨基酸，其具有下列序列MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPA RMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYIS SVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPS S GARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTL(SEQ ID NO1的氨基酸1-460)。
B.pSA-49表达载体的构建所述的pSA-49表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO1的1-464氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR，使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；SEQ ID NO2)及LSYN-54(5’-CTGAGGATCCTTACTATACCTGAGGATAGAGAGTTGTTC-3’；SEQ ID NO25)引物扩增1392bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化，连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点，形成pSA-49。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入，并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的464氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的7个氨基酸，其具有下列序列MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQV(SEQ ID NO1的氨基酸1-464)。
C.pSA-11表达载体的构建所述pSA-11表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO1的1-466氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR，使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；SEQ ID NO2)及LSYN-17(5’-GACTGGATCCTTACTAATCTTCTACCTGAGGATAG-3’；SEQ ID NO6)引物扩增1398bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化，连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点，形成pSA-11。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入，并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的466氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的5个氨基酸，其具有下列序列MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVED(SEQ ID NO1的氨基酸1-466)。
D.pSA-32表达载体的构建所述pSA-32表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO1的1-469氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR，使用(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；SEQ ID NO2)及LSYN-37(5’-GACTGGATCCTTACTATTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’；SEQ ID NO7)引物扩增1407bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化，连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点，形成pSA-32。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入，并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的469氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的2个氨基酸，其具有下列下列序列MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYIS SVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVE(SEQ ID NO1的氨基酸1-469)。
E.pSA-31表达载体的构建所述pSA-31表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO1的1-470氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR，使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；SEQ ID NO2)及LSYN-38(5’-GACTGGATCCTTACTAATTTTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’；SEQ ID NO8)引物扩增1410bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化，连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点，形成pSA-31。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入，并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的470氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的1个氨基酸，其具有下列序列MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVEN(SEQ ID NO1的氨基酸1-470)。
实施例2重组假肺炎链球菌溶血素多肽的表达、纯化及特性将PCR产物克隆入pET表达载体如实施例1所述。重组DNA转形至大肠杆菌，该转化子在含有抗生素的培养盘中筛选。插入的DNA序列以DNA序列分析确认。重组的大肠杆菌于37℃过夜生长，加入异丙基硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为引起剂，该细胞继续生长3小时。该表达的重组多肽以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估，经考马斯蓝(Coomassie blue)染色。使用亲和色谱法纯化重组多肽，其溶血活性经羊或人红细胞的溶血分析测试(详见实施例3)。
实施例3假肺炎链球菌溶血素多肽的溶血活性测定该编码多肽的溶血活性如下步骤测定。
1)准备人或羊的红细胞2％悬浮液。将0.2mL新鲜红细胞加入10mL PBS(pH7.2)。旋转该悬浮液3000rpm、30秒，于10mL PBSz中重悬浮其沉淀颗粒物三次。
2)加入1μg多肽于0.5mL PBS(pH7.2)中，与0.5mL清洗过的2％RBC悬浮液混合。
3)37℃培养该混合物1小时，然后在小管(Eppendrof)微离心机中离心10,000rpm、2分钟。
4)在541nm下测量光密度(OD)。溶血活性测量为与全长的肺炎链球菌溶血素多肽相比，OD光密度吸收百分比。
如表1所示，肺炎链球菌溶血素截短物缺乏碳端的7、6、2、或1个氨基酸，而缺乏溶血活性。缺乏碳端5个氨基酸的截短物被证实其溶血活性部份丧失。
表1全长肺炎链球菌溶血素及假肺炎链球菌溶血素的溶血活性

(a)数字表示原始肺炎链球菌溶血素多肽所有的氨基酸(aa)，但不存在于碳端截短物中。
(b)碳端截短物的溶血活性以全长构建体pSA-14的百分比表示。实施例4多醣-蛋白质轭合物的制备A.多醣的氧化肺炎球菌外包膜多醣，如4，6B，9V，14，18，19F，及23F型，系购自美国型式培养公司(American Type Culture Collection；Manassas，VA)。将10mg多醣溶于1mL蒸馏水中，4℃过夜。第二天加入1mL的0.2M PBS(pH 7.2)。多醣通过与2mM的过碘酸钠(MW213.9，Sigma)室温下黑暗中反应10分钟而被氧化。多余的过碘酸钠与终浓度为25mM的乙二醇(MW62.07)反应，予以清除。该含有多醣的反应混合物以1000mL的0.1M PBS(pH 7.2)大量透析3倍。
B.免疫-亲和性柱的制备(i)全长His-标记的肺炎链球菌溶血素的纯化使大肠杆菌(pET24b含C-His-标记的肺炎链球菌溶血素)生长于含40μL的20％蔗糖及4μL的50mg/mL卡那霉素的4mL LB培养基，并于37℃持续160rpm晃动下培养过夜。将3mL的过夜培养物转移至含1mL的20％蔗糖及100μL的50mg/mL卡那霉素的100mLLB培养基，并于持续160rpm晃动下培养于37℃，直到OD600值到达0.4-0.5。在100mL培养物中加入400μL的1M IPTG，使终浓度为4mM IPTG。引起基因表达后的3小时，以4000rpm离心5分钟收集细胞。根据实验手册(ProBond Purification System；Invitrogen；Carlsbad，CA)纯化全长的His-标记肺炎链球菌溶血素。
(ii)抗His-标记肺炎链球菌溶血素的多克隆抗体的制备对新西兰白兔在4处不同部位注射4剂每剂25μg的乳化His-标记肺炎链球菌溶血素及TiterMax辅药(400μL的1mg/mL His-标记的肺炎链球菌溶血素及400μL TiterMax辅药)，一处在每一大腿肌肉(i.m.)上，一处在背部纵肌上脊椎两侧的皮下(s.c.)。14天后，收集该兔耳静脉血液5mL。
如果血清中抗体效价达到1∶3000稀释程度，该动物会完全放血。如果抗体效价低于1∶3000，注射第二剂抗体，一星期后测试该动物(第二剂后7天)。重复此步骤，直到达到适当效价为止。
(iii)使用亲和性胶蛋白A琼脂糖纯化兔IgG将受His-标记肺炎链球菌溶血素免疫的兔血清加入亲和性胶蛋白A柱，以10mM磷酸钠及150mM NaCl(pH 8.2)平衡。以10倍体积清洗后，免疫球蛋白以2-5倍体积的100mM柠檬酸钠(pH 3.0)洗提。收集该IgG，并于280处测量其OD值。再向10DG柱中加入3ml纯化的IgG，丢弃第一个流出的3ml洗提液。在该柱中加入3.5ml的组合的缓冲液(150mM NaCl及100mM醋酸钠pH 5.5)或0.1M 3-(N-吗啉)丙烷磺酸)(MOPS)缓冲液。收集3.5ml IgG洗提液，进一步与亲和性胶Hz或亲和性胶10偶合。
(iv)使用IgG与亲和性胶10自由偶合制备免疫亲和性柱亲和性胶10为衍生的交叉偶合琼脂糖胶颗粒支持体的N-羟基琥珀酰亚胺酯，其通过一级胺与所有配位体偶合。为了与IgG偶合，将亲和性胶10移至15ml管中，并以冷DDH2O清洗3次及冷0.1MMOPS缓冲液(pH 7.0)清洗两次。将纯化的IgG加入含事先清洗的亲和性胶10的15ml管中，4℃下端对端旋转4小时。剩余的亲和性胶10的活性酯通过加入100mM Tris HCl pH 8.0在4℃下经0.5小时终止反应。将该胶移至1.5×9.0cm柱中。收集该柱的洗提液并测量其OD280值。以2倍体积的0.5M NaCl及25mM Tris HCl(pH 8.0)清洗亲和性胶10免疫亲和性柱。再收集该柱洗提液并测量其OD280值。根据所有IgG的浓度与未偶合的IgG的浓度，计算偶合率。
(v)免疫亲和性柱的检验为了测试免疫亲和性柱，将DEAE-琼脂糖(Sepharose)层析法中假肺炎链球菌溶血素部分加入25mM Tris HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl及0.5％Triton X-100中。将样本加入6.5ml亲和性胶10柱(1.5×12cm)，以0.5M NaCl及25mM Tris HCl(pH 8.0)在流速1mL/2分钟下平衡。收集经分层的流液。以15mL的0.5M NaCl及25mM Tris HCl(pH8.0)清洗该柱2-3次。再以5mL的4M尿素清洗该柱。该粘着的假肺炎链球菌溶血素蛋白质以7mL的4M尿素洗提2次。第一次7mL的4M尿素分层的蛋白质样本以9％SDS-PAGE分析，并以考马斯蓝(Coomassie)R-20染色，使可目视。
C.重组假肺炎链球菌溶血素蛋白质的制备经表达载体pSA-49(编码碳端缺乏7个氨基酸肺炎链球菌溶血素的多肽)转形的细菌生长于含30mL LB培养基及100μg/ml安比西林的50mL管中，37℃过夜。次日早上，将13ml的该过夜培养物与含100μg/mL安比西林及0.2％蔗糖的400mL LB培养基于37℃摇晃下培养于1L烧瓶中。细胞密度相对A600为0.5，通过加入2mM或4mMIPTG 3小时来引起假肺炎链球菌溶血素蛋白质的表达。
在500mL离心管中以6,500rpm离心细菌10分钟。将该细菌沉淀颗粒重悬浮于含100μg/mL溶菌酶的40mL Tris HCl缓冲液(pH8.0)中，在冰上培养15分钟，及在冰上10秒激发超声3次。将该溶菌产物冷冻于-80℃10分钟，在37℃解冻5分钟。此细胞溶菌产物经超音波-冷冻-解冻处理2次以上。不能溶解的细胞碎片经6,000rpm离心20分钟而移除。将上层溶菌产物经过0.8μM过滤器。流经蛋白质的液体由9％SDS PAGE分析，并以考马斯蓝(Coomassie)R-250染色，使可目视。溶菌粗产物再进一步由DEAE-琼脂糖(Sepharose)层析法纯化。
将20ml细菌溶菌粗产物加入含有以25mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的DEAE-琼脂糖(Sepharose)的柱(5×12cm)中。收集第一次流出的液体后，将10ml的25mM Tri-HCl加入该柱中。收集10ml的流出液，与第一次流出液加在一起分层(分层1)。然后，加入35mL的25mMTris-HCl(pH 8.0)，收集流出液(分层2)。加入另一35mL的25mMTris-HCl(pH 8.0)，收集流出液(分层3)。以4M NaCl及25mM Tris HCl洗提该粘着的细菌蛋白质(分层4)。以280nm的OD测量每一分层的蛋白质浓度。蛋白质样本由9％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，并以考马斯蓝(Coomassie)R-20染色，使可目视。含有假肺炎链球菌溶血素的流出液(分层1及2)再进一步由免疫亲和色谱法纯化。
DEAE-琼脂糖(Sepharose)层析法后，将含有假肺炎链球菌溶血素的分层加入25mM Tris HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl及0.5％Triton X-100中。该样本以流速1mL/2分钟加入与兔抗肺炎链球菌溶血素IgG偶合的6.5mL亲和性胶10柱(1.5×12cm)，其以0.5M NaCl及25mM TrisHCl(pH8.0)平衡。收集流出液。以15mL的0.5M NaCl及25mM TrisHCl(pH 8.0)清洗该柱3次。再以5mL的4M尿素清洗该柱。以7mL的4M尿素洗提该粘着的假肺炎链球菌溶血素蛋白质2次。以SDS-PAGE分析未粘着于及粘着于分层的蛋白质样本，并以考马斯蓝(Coomassie)R-20染色，使可目视。
免疫亲和色谱法后，由4M尿素洗提的含假肺炎链球菌溶血素分层再以10DG层析法纯化，去除尿素。在10DG柱(1.5×12cm)中加入3.0ml样本，该10DG柱经1×PBS缓冲液平衡。丢弃第一次流出的3ml流出液。该柱中加入3.9mL的1×PBS缓冲液。测量从柱中收集的该3.9ml分层的OD280值，并收集该蛋白质分层。蛋白质的纯度以9％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
D.多醣-蛋白质轭合物的制备使用还原胺化作用分析，将2mg的肺炎链球菌多醣18C与假肺炎链球菌溶血素蛋白质(详述见上述C部分)直接轭合。在所述氧化的多醣反应混合物中加入溶于0.1M PBS的10mg假肺炎链球菌溶血素，室温下轻微搅拌培养30分钟。加入氰基硼氢化钠使终浓度为20mM(如750μL的100mM氰基硼氢化物加入3ml的氧化多醣及假肺炎链球菌溶血素混合物中)。将该混合物于室温下轻微搅拌培养5天。将该轭合物于9,000rpm沉淀10分钟，然后溶于1-2mL 0.1M PBS，pH7.2。将该混合物于经1×PBS，pH7.2平衡的琼脂糖(Sepharose)CL-4B柱(1.5×100cm)中层析。将含有蛋白质及多醣的分层倒在一起，以Amicon Centricon-30浓缩(分离点为分子量30,000)，然后分析蛋白质及多醣含量。
实施例5小鼠体中对多醣-蛋白质轭合物的抗体反应如实施例4所制备的肺炎链球菌14，18C，19F，23F，4，6B及9V型多醣-假肺炎链球菌溶血素蛋白质轭合物，测试其提高小鼠体内抗多醣及肺炎链球菌溶血素的抗体的能力。将所述轭合物，每剂0.3、1、3μg的多醣与氢氧化铝辅药(每剂0.1mg)混合物结合，腹膜内注射于雌NIH瑞士小鼠群。在某些实验中，第二群小鼠接受1μg多醣，及/或第三群小鼠接受1μg假肺炎链球菌溶血素。小鼠两次注射间以2星期为间隔。最后一次注射后的7天，测量抗多醣的抗体血清浓度及抗肺炎链球菌溶血素的抗体血清浓度。表2总结了给药的特定轭合物及第1-14图中所示实验所测量的免疫反应。
表2小鼠免疫实验中给药的轭合物与检测的抗体的总表

以下缩写为使用于第1-14图中磷酸缓冲液生理盐水(PBS)、轭合物(C)、氢氧化铝辅药(A)、及假肺炎链球菌溶血素(PPN)。
受该多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的小鼠显示出抗体的引起，该抗体经ELISA与His-标记野生型肺炎链球菌溶血素反应。对于所有接受该轭合物及辅药的小鼠群，其抗肺炎链球菌溶血素与抗多醣的抗体水平显著高于仅加入PBS及辅药的对照组(p＜0.001，t-test)。与仅给予PBS的小鼠群相比，给予该轭合物的小鼠血清中显示无法预期的高滴定度的抗肺炎链球菌溶血素抗体及抗多醣抗体，其血清稀释因子各为76800及9600。小鼠中观察到最高的抗肺炎链球菌溶血素抗体及抗多醣抗体浓度是接受3.0μg的多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物(图1-14)。相较于接受假肺炎链球菌溶血素与辅药(图3)、或仅接受假肺炎链球菌溶血素而无辅药者(图6)，接受多醣-假肺炎链球菌溶血素的轭合物与辅药的小鼠群有较高的抗肺炎链球菌溶血素抗体浓度。
表3及表4显示接受3.0μg轭合物的小鼠为具有最高百分比的反应者。此结果指出肺炎球菌疫苗的有效性可通过多醣与假肺炎链球菌溶血素蛋白质的轭合物予以改善。除该抗体反应外，还对给予该轭合物疫苗的小鼠(实施例8)进行交叉保护性免疫及细菌清除率检测。
表3具有抗18C型多醣阳性反应的小鼠比例小鼠群 阳性反应者比例氢氧化铝辅药 0％1μg假肺炎链球菌溶血素(PPN)0％1μg 18C型多醣(PS)+辅药0％0.3μg 18C(PS)-PPN轭合物+辅药 60％1.0μg 18C(PS)-PPN轭合物+辅药 75％3.0μg 18C(PS)-PPN轭合物+辅药 100％1.0μg 18C (PS)-PPN轭合物，但无辅药20％注阳性反应者是自所有小鼠的1∶100稀释血清样本所确认。当其A405nm光学读数高于0.05则显示为阳性反应。
表4具有抗14型多醣阳性反应的小鼠比例小鼠群 阳性反应者比例氢氧化铝辅药0％1μg假肺炎链球菌溶血素(PPN) 0％1μg 14型多醣(PS)+辅药 0％0.3μg 14(PS)-PPN轭合物+辅药100％1.0μg 14(PS)-PPN轭合物+辅药100％3.0μg 14(PS)-PPN轭合物+辅药100％1.0μg 14(PS)-PPN轭合物，但无辅药 20％注阳性反应者是自所有小鼠的1∶300稀释血清样本所确认。当其A405nm光学读数高于0.12则显示为阳性反应。
图15显示小鼠在第3次注射14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物后7天，对14型多醣的抗体反应。图15中，G1、G2、及G3各为每只注射0.3μg、1.0μg、及3.0μg所述轭合物疫苗的小鼠群。G4为仅注射1.0μg的14型多醣的小鼠群。G5及G6各为仅注射1.0及3.0μg假肺炎链球菌溶血素的小鼠群。G7为注射1.0μg的14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物疫苗而无辅药的小鼠群。G4、G5、G6小鼠群中观察到很少或几乎没有对抗多醣的抗体反应。
实施例6假肺炎链球菌溶血素、肺炎球菌自溶素及肺炎球菌表面蛋白质DNA疫苗的表达载体的构建A.DNA疫苗构建的pVAX1载体pVAX1载体(Invitrogen)为特定设计为DNA疫苗发展的载体。其构成符合美国食品药物局文件“评价质粒DNA疫苗的重点，作为预防传染疾病的指示”，出版于1996年12月22日。
B.假肺炎链球菌溶血素的克隆及表达以含有肺炎球菌19A型染色体DNA的引物及模板的即可使用PCR珠(Amersham Pharmacia Biotech Inc.Piscataway，NJ)进行PCR反应。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；55℃、1分钟；72℃、1.5分钟；最后一周期为72℃、10分钟进行。
该放大的PCR产物以限制性内切酶消化，连接至pVAX1载体的该位点，形成pSA-8，pSA-45，pSA-12，pSA-42，及pSA-41。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5 α细胞，再以限制性内切酶消化检查。该插入的基因以DNA序列分析予以分析。体外的转录及翻译使用TnT试剂盒依照操作手册(Promega，Madison，WI)进行以确认该插入基因的表达。
所述pSA-8表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号1的1-460氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成如上文所述，是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’ ；序列识别号4)及LSYN-4引物(5 ’-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3’；序列识别号5)，放大1380碱基对DNA。此1380碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割，连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位，形成pSA-8。
所述pSA-45表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号1的1-464氨基酸组成的多肽。该插入部分的形成是使用LSYN-15(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)及LSYN-105(GACTGGATCCCTATACCTGAGGATAGAGAGTTG；序列识别号27)，放大1392碱基对DNA，随后经NheI及BamHI限制性切割，连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位，形成pSA-45。
pSA-12表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号1的1-466氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)及LSYN-17引物(5’-GACTGGATCCTTACTAATCTTCTACCTGAGGATAG-3’；序列识别号6)，放大1398碱基对DNA。此1398碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割，连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位，形成pSA-12。
所述pSA-42表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号1的1-469氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成如上所述是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)及LSYN-37引物(5’-GACTGGATCCTTACTATTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’；序列识别号7)，放大1407碱基对DNA。此1407碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割，连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位，形成pSA-42。
所述pSA-41表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号1的1-470氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成如上所述，是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)及LSYN-38引物(5’-GACTGGATCCTTACTAATTTTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’；序列识别号8)，放大1410碱基对DNA。此1410碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割，连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位，形成pSA-41。
含有特定序列或基序的未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(“CpG”)双核苷酸的核酸可能为体外多种免疫细胞的刺激物。含CpG基序的合成寡核苷酸可直接活化先天免疫系统，其通过刺激B细胞以增殖及分泌免疫球蛋白、IL-6及IL-10、NK细胞而产生IFN-γ、及单核球及树突细胞而产生IL-6，IL-12，IL-18 TNT-α及IFN-α。由未甲基化CpG双核苷酸构成的DNA基序，其由两个5’嘌呤及两个3’嘧啶侧面绕过，所述DNA基序刺激B细胞产生IL-6及IL-12，以及刺激CD4+T细胞产生IL-6及IFN-γ。
肺炎链球菌溶血素的结构-功能分析证实，该多肽碳端的一个区域(位于氨基酸427-437)含有半胱胺酸残基，为细胞毒性的关键区。此半胱胺酸基序在其它硫活化的溶细胞素族中高度保留。在此区中的多种单一氨基酸取代物显著降低肺炎链球菌溶血素的细胞毒性。以下核酸构建体通过引起GAGCGTT进入肺炎链球菌溶血素核苷酸1272-1274位(通过导向突变位置)，使CpG基序取代半胱胺酸基序。含有GAGCGTT免疫刺激序列的突变核酸如下ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGAATTACGATAAAAAGAAACTCTTGACCCATCAGGGAGAAAGTATTGAAAATCGTTTCATCAAAGAGGGTAATCAGCTACCCGATGAGTTTGTTGTTATCGAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTCTTGATATTGATTTTAACTCTGTCCATTCAGGCGAAAAGCAGATTCAGATTGTTAATTTTAAGCAGATTTATTATACAGTCAGCGTAGATGCTGTTAAAAATCCAGGAGATGTGTTTCAAGATACTGTAACGGTAGAGGATTTAAAACAGAGAGGAATTTCTGCAGAGCGTCCTTTGGTCTATATTTCGAGTGTTGCTTATGGGCGCCAAGTCTATCTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAAGTAGAGGCTGCTTTTGAAGCTTTGATAAAAGGAGTCAAGGTAGCTCCTCAGACAGAGTGGAAACAGATTTTGGACAATACAGAAGTGAAGGCGGTTATTTTAGGGGGCGACCCAAGTTCGGGTGCCCGAGTTGTAACAGGCAAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGATTCAAGAAGGCAGTCGCTTTACAGCAGATCATCCAGGCTTGCCGATTTCCTATACAACTTCTTTTTTACGTGACAATGTAGTTGCGACCTTTCAAAATAGTACAGACTATGTTGAGACTAAGGTTACAGCTTACAGAAACGGAGATTTACTGCTGGATCATAGTGGTGCCTATGTTGCCCAATATTATATTACTTGGAATGAATTATCCTATGATCATCAAGGTAAGGAAGTCTTGACTCCTAAGGCTTGGGACAGAAATGGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAATGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGCGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACGATTTCTATTTGGGGAACAACTCTCTATCCTCAGGTAGAAGATAAGGTAGAAAATGAC(序列识别号9)。
另一实施例中，该免疫刺激DNA序列GAGCGTT插入(通过导向突变位置)碳端有33个核苷酸缺失的假肺炎链球菌溶血素的核苷酸位置1272-1274。含有所述免疫刺激序列的该假肺炎链球菌溶血素DNA如下ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGAATTACGATAAAAAGAAACTCTTGACCCATCAGGGAGAAAGTATTGAAAATCGTTTCATCAAAGAGGGTAATCAGCTACCCGATGAGTTTGTTGTTATCGAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTCTTGATATTGATTTTAACTCTGTCCATTCAGGCGAAAAGCAGATTCAGATTGTTAATTTTAAGCAGATTTATTATACAGTCAGCGTAGATGCTGTTAAAAATCCAGGAGATGTGTTTCAAGATACTGTAACGGTAGAGGATTTAAAACAGAGAGGAATTTCTGCAGAGCGTCCTTTGGTCTATATTTCGAGTGTTGCTTATGGGCGCCAAGTCTATCTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAAGTAGAGGCTGCTTTTGAAGCTTTGATAAAAGGAGTCAAGGTAGCTCCTCAGACAGAGTGGAAACAGATTTTGGACAATACAGAAGTGAAGGCGGTTATTTTAGGGGGCGACCCAAGTTCGGGTGCCCGAGTTGTAACAGGCAAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGATTCAAGAAGGCAGTCGCTTTACAGCAGATCATCCAGGCTTGCCGATTTCCTATACAACTTCTTTTTTACGTGACAATGTAGTTGCGACCTTTCAAAATAGTACAGACTATGTTGAGACTAAGGTTACAGCTTACAGAAACGGAGATTTACTGCTGGATCATAGTGGTGCCTATGTTGCCCAATATTATATTACTTGGAATGAATTATCCTATGATCATCAAGGTAAGGAAGTCTTGACTCCTAAGGCTTGGGACAGAAATGGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAATGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGCGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACGATTTCTATTTGGGGAACAACTCTC(序列识别号10)。
D.肺炎球菌自溶素基因的克隆及表达所述pSA-59表达载体编码316个氨基酸自溶素(Aly)多肽。使用含有肺炎球菌1 9A染色体DNA的引物核模板的即可使用PCR珠，将19A型Aly基因系由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；50℃、1分钟；72℃、1分钟15秒；最后一周期为72℃、10分钟进行。该插入部分的形成是使用LSYN-74引物(5’-GACTAAGCTTGCCACCATGGAAATTAATGTGAGTAAATTAAG-3’；序列识别号11)及LSYN-89引物(5’-CTGACTCGAGTTATTTTACTGTAATCAAGCCATC-3’；序列识别号12)，放大948碱基对DNA。
此PCR合成的DNA随后经HindIII及XhoI消化，并连接至pVAX1载体的HindIII及XhoI位，形成pSA-59(Aly)。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞，再以限制性内切酶、HindIII及XhoI消化检查。该Aly插入基因以DNA序列分析确认。体外的转录及翻译使用TnT试剂盒(Promega，Madison，WI)依照操作手册进行以确认pSA-59的表达。
所述pSA-59Aly插入部分的核酸序列如下ATGGAAATTAATGTGAGTAAATTAAGAACAGATTTGCCTCAAGTTGGCGTGCAACCATATAGGCAAGTACACGCACACTCAACTGGGAATCCGCATTCAACCGTACAGAATGAAGCGGATTATCATTGGCGGAAAGACCCAGAATTAGGTTTTTTCTCGCACATTGTTGGGAACGGATGCATCATGCAGGTAGGACCTGTTAATAATGGTGCCTGGGACGTTGGGGGCGGTTGGAATGCTGAGACCTATGCAGCGGTTGAACTGATTGAAAGCCATTCAACTAAAGAAGAGTTCATGACGGACTACCGCCTTTATATCGAACTCTTACGCAATCTAGCAGATGAAGCAGGTTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGTTTAGCTGGAATTAAAACGCACGAGTATTGCACGAATAACCAACCAAACAACCACTCAGACCATGTGGATCCATACCCTTACTTGGCAAAATGGGGCATTAGCCGTGAGCAGTTTAAGCATGATATTGAGAACGGCTTGACGATTGAAACAGGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACGGCTCTTATCCAAAAGACAAGTTTGAGAAAATCAATGGCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCTGGAGGAAGCACACAGACGGCAATTGGTACTACTTTGACCAATCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGAGAAGTGGTACTATTTCAACGAAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCAATGGTATCAAATGCCTTTATCCAGTCAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACTGGCAGACAAGCCAGAATTCACAGTAGAGCCAGATGGCTTGATTACAGTAAAA(序列识别号13)。
pSA-59Aly插入部分编码的氨基酸序列如下MEINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHSTGNPHSTVQNEADYHWRKDPELGFFSHIVGNGCIMQVGPVNNGAWDVGGGWNAETYAAVELIESHSTKEEFMTDYRLYIELLRNLADEAGLPKTLDTGSLAGIKTHEYCTNNQPNNHSDHVDPYPYLAKWGISREQFKHDIENGLTIETGWQKNDTGYWYVHSDGSYPKDKFEKINGTWYYFDSSGYMLADRWRKHTDGNWYYFDQSGEMATGWKKIAEKWYYFNEEGAMKTGWVKYKDTWYYLDAKEGAMVSNAFIQSADGTGWYYLKPDGTLADKPEFTVEPDGLITVK(序列识别号14)。
E.氮端肺炎球菌表面蛋白A(PspA)基因的克隆及表达所述pSA-60表达载体编码459个氨基酸PspA多肽。使用含有肺炎球菌19A染色体DNA引物核模板的即可使用PCR珠，19A型PspA基因由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；50℃、1分钟；72℃、1分钟15秒；最后一周期为72℃、10分钟进行。该插入部分的形成使用LSYN-90(5’-GACTAAGCTTGCCACCATGGAAGAAGCTCCCGTAGCTAGTCAG-3’；序列识别号15)与LSYN-78引物(5’-GACTCTCGAGCTATCCATCAGGGCCTAACTCATTAAG-3’；序列识别号16)，放大1377碱基对DNA。此PCR合成产物随后经HindIII及XhoI消化，并连接至pVAX1载体的HindIII及XhoI位，形成pSA-60(PspA)。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞，再以限制性内切酶、HindIII及XhoI消化检查。该PspA插入基因以DNA序列分析确定。体外的转录及翻译使用TnT试剂盒(Promega，Madison，WI)依据操作手册进行以确认pSA-60的表达。
所述pSA-60PspA插入部分的核酸序列如下ATGGAAGAAGCTCCCGTAGCTAGTCAGTCTAAAGCTGAGAAAGACTATGATGCAGCAGTGAAAAAATCTGAAGCTGCTAAGAAGGCTTACGAAGAAGCTAAAAAGAAAGCAGAAGACGCTCAGAAAAAATATGATGAGGATCAGAAGAAAACTGAGGCAAAAGCGGATAAGGAAGCAAAAGCATCTGCGGAAATAGATAAAGCCACGTTTGCTGTACAAAGTGCGTATGTAAAATTTTTAAATGTCCAATCTAATCGTCAAATTTCGGAGAATGAACGAAAAAAACAATTAGCAGAAATAGATAAAGAGATAGAGAATGCTAAACAAAATTTACAGAATAAACAGGAAGAATTTAATAAGGTTAGAGCAGAAGTAATTCCTGAAGCAAAGGGGTTAGCTGTTACTAAACAAAAAGCGGAAGAAGCTAAAAAAGAAGCAGAAGTAGCTAAGAGAAAATATGATTATGCAACTCTAAAGGTAGCACTAGCGAAGAAAGAAGTAGAGGCTAAGGAACTTGAAATTGAAAAACTTCAATATGAAATTTCTACTTTGGAACAAGAAGTTGCTATTGCTCAACATCAAGTAGATAATTTGAAAAAACTTCTTGCTGGTGCGGATCCTGATGATGGCACAAAAGTTATAGAAGCTAAATTAAACAAAGGAGAAGCTGAGCTAAACGCTAAACAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCTGCTGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGGAATTGCTCCTTATCAAATCAAAGTCGCTGAATTAAATAAAGAAATTGCTAGACTTCAAAGCGATTTAAAAGATGCTGAAGAAAATAATGTAGAAGACTATATTAAAGAAGGTTTAGAGCAAGCTATCGCTGATAAAAAAGCTGAATTAGCTACAACTCAACAAAACATAGATAAAACTCAAAAAGATTTAGAGGATGCTGAATTAGAACTTGAAAAAGTATTAGCTACATTAGACCCTGAAGGTAAAACTCAAGATGAATTAGATAAAGAAGCTGCAGAAGATGCTAATATTGAAGCTCTTCAAAACAAAGTTGCTGATCTAGAAAACAAGGTTGCTGAATTAGATAAAGAAGTTACTAGACTTCAAAGCGATTTAAAAGATGCTGAAGAAAACAATGTAGAAGACTACGTTAAAGAAGGCTTAGATAAAGCTCTTACTGATAAAAAAGTTGAATTAAATAATACTCAAAAAGCATTAGATACTGCTCAAAAAGCATTAGATACTGCTCTTAATGAGTTAGGCCCTGATGGA(序列识别号17)。
pSA-60PspA插入部分编码的氨基酸序列如下MEEAPVASQSKAEKDYDAAVKKSEAAKKAYEEAKKKAEDAQKKYDEDQKKTEAKADKEAKASAEIDKATFAVQSAYVKFLNVQSNRQISENERKKQLAEIDKEIENAKQNLQNKQEEFNKVRAEVIPEAKGLAVTKQKAEEAKKEAEVAKRKYDYATLKVALAKKEVEAKELEIEKLQYEISTLEQEVAIAQHQVDNLKKLLAGADPDDGTKVIEAKLNKGEAELNAKQAELAKKQTELEKLLDSLDPEGKTQDELDKEAAEAELDKKADELQNKVADLEKGIAPYQIKVAELNKEIARLQSDLKDAEENNVEDYIKEGLEQAIADKKAELATTQQNIDKTQKDLEDAELELEKVLATLDPEGKTQDELDKEAAEDANIEALQNKVADLENKVAELDKEVTRLQSDLKDAEENNVEDYVKEGLDKALTDKKVELNNTQKALDTAQKALDTALNELGPDG(序列识别号18)。
实施例7DNA疫苗的免疫原性质粒载体pSA-7编码全长的肺炎链球菌溶血素蛋白质。使用含有肺炎球菌19A染色体DNA的引物和模板的即可使用PCR珠，19A型Ply基因由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；55℃、1分钟；72℃、1.5分钟；最后一周期为72℃、10分钟。使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)互补于Ply的5’端核苷酸1-24，以及LSYN-3引物(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’；序列识别号3)互补于Ply的3’端核苷酸1396-1413，放大1413碱基对DNA，编码全长471氨基酸的野生型Ply蛋白质。此PCR合成的DNA片段随后经NheI及BamHI限制性切割，并连接至pVAX1表达载体的NheI及BamHI位，形成pSA-7。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞，再以限制性内切酶、NheI及BamHI消化检查。该插入19A型野生型Ply基因以DNA序列分析确定。
质粒载体pSA-10编码碳端截断的肺炎链球菌溶血素蛋白质(Ply碳端上缺乏114个氨基酸)。使用含有肺炎球菌19A染色体DNA的引物和模板的即可使用PCR珠，19A型Ply基因由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；55℃、1分钟；72℃、1.5分钟；最后一周期为72℃、10分钟进行。使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)互补于Ply的5’端核苷酸1-24，以及LSYN-6引物(5’-CTGAGGATCCTTACTAAGCTGTAACCTTAGTCTC-3’；序列识别号19)互补于Ply的3’端核苷酸1054-1071，来放大1071碱基对DNA，编码全长357氨基酸多肽。此PCR合成的DNA片段随后经NheI及BamHI限制性切割，并连接至pVAX1表达载体的NheI及BamHI位，形成pSA-10。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞，再以NheI及BamHI限制性内切酶消化检查。该插入19A型假肺炎链球菌溶血素基因以DNA序列分析确定。
质粒载体pSA-26编码具有CpG基序的全长肺炎链球菌溶血素。含有两个在3’端具有CpG基序的互补寡核苷酸的PCR引物LSYN-34及LSYN-33用于PCR1及PCR2的引物。第二引物LSYN-15及LSYN-3分别互补于肺炎链球菌溶血素氮端及碳端序列。在分别放大反应中，第一PCR产物为PCR1(1.2kb)及PCR2(150bp)，其由引物LSYN-15和-34(PCR1)以及LSYN-33和-3(PCR2)，及含全长肺炎链球菌溶血素基因的模板pSA7所构成的即可使用PCR珠所生成。将第一PCR产物混合、变性，作为第二PCR产物的模板，并由第二组的引物LSYN-15及-3引导。该第二PCR产物用NheI及BamHI切割，并克隆至pVAX1载体的NheI及BamHI位，形成pSA-26。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；55℃、1分钟；72℃、1.5分钟；最后一周期为72℃、8分钟进行。
引物LSYN-3、LSYN-1 5、LSYN-33及LSYN-34序列如下LSYN-3引物(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’；序列识别号3)；LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)；LSYN-33引物(5 ’-CAAAATTAGAGAACGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGG-3’；序列识别号20)；LSYN-34引物(5’-GCCCGGAACGTTCTCTAATTTTGACAGAGAGATTACG-3’；序列识别号21)。
将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞，再以限制性内切酶、NheI及BamHI消化检查。该含有CpG基序的插入19A型野生型Ply基因以DNA序列分析确定。
质粒载体pSA-27具有CpG基序并编码肺炎链球菌溶血素碳端截短物(11个氨基酸缺失)。含有两个在3’端具有CpG基序的互补寡核苷酸的引物LSYN-34及LSYN-33用作PCR1及PCR2的引物。第二引物LSYN-15及LSYN-3分别互补于肺炎链球菌溶血素氮端及碳端序列。在分别放大反应中，第一PCR产物为PCR1(1.2kb)及PCR2(150bp)，其由引物LSYN-15与-34(PCR1)以及LSYN-33与-3(PCR2)、含全长肺炎链球菌溶血素基因的模板pSA7所构成的即可使用PCR珠所生成。
将第一PCR产物混合、变性，作为第二PCR产物的模板，该第二PCR产物的引物由第二组的引物LSYN-15及-4引发。该第二PCR产物经NheI及BamHI切割，并克隆于pVAX1载体的NheI及BamHI位，以形成pSA-27。PCR以第一周期为94℃、4分钟；随后30周期为94℃、1分钟；55℃、1分钟；72℃、1分钟；最后一周期为72℃、8分钟进行。该引物LSYN-3、LSYN-4、LSYN-15、LSYN-33及LSYN-34的寡核苷酸序列如下LSYN-3引物(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’；序列识别号3)；LSYN-4引物(5’-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3’；序列识别号5)；LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’；序列识别号4)；LSYN-33引物(5’-CAAAATTAGAGAACGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGG-3’；序列识别号20)；LSYN-34引物(5’-GCCCGGAACGTTCTCTAATTTTGACAGAGAGATTACG-3’；序列识别号21)。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞，再以限制性内切酶、NheI及BamHI消化检查。该含有CpG基序的插入19A型假肺炎链球菌溶血素基因以DNA序列分析确定。
疫苗过程必须有DNA载体引发及大量产生蛋白质，导致高浓度专一性免疫的产生，以及在某些情况下，对于目前疫苗发展有极大问题的感染源提供保护作用。在这些实验中，兔通过3次肺炎链球菌溶血素DNA载体引发，并在无辅药下大量生成肺炎链球菌溶血素蛋白质。
图16显示使用上述假肺炎链球菌溶血素DNA疫苗的引起-大量产生策略的兔体内抗肺炎链球菌溶血素的抗体反应。第1、2、3柱条为第一(1)、第二(2)、第三(3)肌肉内注射假肺炎链球菌溶血素DNA疫苗后7天的免疫反应。第4柱条为蛋白质大量生成(200μg肺炎链球菌溶血素)后10天的免疫反应。第5柱条为注射200μg肺炎链球菌溶血素蛋白质与TiterMax辅药后10天的抗体反应。此结果证明DNA的3次注射与蛋白质的大量生成，相较于使用辅药的传统蛋白质免疫方法，导致较高的抗体反应。
将均为100μg的DNA疫苗pSA-59、及pSA-60、及一个载体控制的质粒DNA溶于总体积为0.1ml的1×PBS中，肌肉内注射于Balb/C小鼠的四头肌或后肢。对小鼠注射4剂100μg DNA疫苗，每次注射间隔2星期。最后一次注射后的第7天，以ELISA测量IgG抗体的血清浓度。接受4剂DNA疫苗注射的小鼠较对照组产生多于9600倍的IgG抗体。此结果显示质粒DNA可于体内表达自溶素或肺炎球菌表面蛋白A抗原，并刺激小鼠免疫系统以产生高浓度的专一性IgG抗体。
图17为注射第4剂PspA DNA疫苗后7天的对肺炎球菌表面蛋白A的抗体反应。图18为注射第4剂自溶素DNA疫苗后7天的对肺炎球菌自溶素的抗体反应。
实施例8对致命肺炎球菌的异质型的保护性免疫及交叉保护作用对小鼠腹膜内注射3剂2.5μg的14型多醣-假肺炎链球菌溶血素(-7氨基酸)轭合物，注射间隔为2星期。对照组以PBS代替该轭合物。第三次注射后8天，该免疫小鼠腹膜内注射每0.1毫升1×105至1×106CFU(菌丛形成单位)肺炎球菌。注射的每毫升确实CFU数由羊血琼脂糖盘上的菌斑计算得知。在感染后1、3、5小时，取每只小鼠的5μl及20μl血液样本涂布于羊血琼脂糖盘，37℃培养过夜。接受轭合物免疫鼠的血液样本的细菌清除率与对照组的比较，有显著差异。
图19显示在14型肺炎球菌感染时，用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P＜0.01)。
图20显示在7型肺炎球菌感染时，用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P＜0.01)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
图21显示在6B型肺炎球菌感染时，用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P＜0.05)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
图22显示在18C型肺炎球菌感染时，用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P＜0.01)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
图23-25显示在23F型肺炎球菌感染时，用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1小时(图23)、3小时(图24)、5小时(图25)用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P＜0.01)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
实施例9调理吞噬分析A.调理吞噬分析抗血清型14型肺炎球菌多醣的抗体功能活性是使用人多形核白细胞(PMNL)的调理吞噬分析予以测量。系列性稀释(两倍)抗血清，使每一20μl血清样本与20μl细菌悬浮液混合，于37℃培养15分钟，该细菌悬浮液含有约200CFU于脑心泡制的培养基。培养完后，加入10μl婴儿兔补体及40μl的PMNL(4×105细胞)。将此混合物培养于37℃、5％CO2气氛60分钟。为获得可目视的细胞计数，将每样本中的20μl等分试样接种于三倍血琼脂培养基中，维持37℃过夜。补体控制包含所有测试试剂，除对抗肺炎球菌的抗体。调理吞噬效价计数为相较于补体中所生长者，＞50％杀菌的最高血清稀释量的倒数。
B.吞噬细胞通过使用葡聚糖沉降及菲柯尔(ficoll；ICN Biomedical Company，#16-922-54 Lymphocyte Separation Medium)分离单核细胞与PMNL，来将新鲜PMNL从健康成人志愿者的周边血液中分离。以ACK溶胞缓冲液(BioFluids，Catalog number p304-100)溶解红细胞。调整在BME(Life Technologies GIBCO BRL，Basal Medium Eagle)中细胞的终浓度为1×107细胞/mL。每样本中使用40μL的PMNL 2-4×105细胞。
C.小鼠血清与细菌将抗14型多醣的小鼠抗血清系列地稀释于脑心泡制的培养基(两倍，1∶2至1∶256)中，将每20μL血清样本与20ul细菌悬浮液(200CFU的肺炎链球菌14型)37℃混合15分钟。
肺炎链球菌14型培养于37℃脑心泡制培养基10小时。系列稀释10倍以确认本实验使用的细菌数。将100ul样本加入盘中。10CFU为使用1∶107稀释样本，91CFU为使用1∶106稀释样本。因此本试验使用的细菌浓度确认为约1×109CFU/mL。将14型肺炎链球菌1×109CFU/M1稀释至1×104CFU/mL。200CFU/20μL用于每样本。
D.补体与PMNL培养后，加入10μL婴儿兔补体(新鲜收集的年轻兔血清的等分试样，使用前储存于-80℃)及40μL的PMNL 2.8×105细胞。将该混合物培养于37℃、5％CO2气氛60分钟。
E.CFU计数为获得可目视的细胞计数，将两稀释液的20μl等分试样(每样本1∶10及1∶100)接种于三倍血琼脂培养基中，维持37℃过夜。补体对照组包含除对抗肺炎球菌的抗体外的所有试剂。
F.调理吞噬活性调理吞噬效价计数为相较于补体中所生长者，＞50％杀菌的最高血清稀释量的倒数。
表5对抗14型多醣的小鼠抗体调理素作用活性血清稀释小鼠编号# 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256对照组疫苗1，CFU 12 20 22 25 28 32 4581杀菌％ 85％ 76％ 73％ 69％ 65％ 60％44％2，CFU 17 18 17 17 32 50 5181杀菌％ 79％ 78％ 79％ 79％ 60％ 38％37％3，CFU 19 27 31 31 32 44 5681杀菌％ 77％ 67％ 62％ 62％ 60％ 46％31％4，CFU 15 22 23 19 33 36 4081杀菌％ 81％ 73％ 72％ 77％ 59％ 56％51％5，CFU 22 26 34 27 33 43 5181杀菌％ 73％ 68％ 58％ 67％ 59％ 47％37％6，CFU 22 17 19 28 43 51 5781杀菌％ 73％ 79％ 77％ 65％ 47％ 37％30％7，CFU 22 29 29 26 28 29 5781杀菌％ 73％ 64％ 64％ 68％ 65％ 64％30％8，CFU 31 23 31 35 48 63 6381杀菌％ 62％ 72％ 62％ 57％ 41％ 22％22％小鼠血清滴定以测量调理素作用活性
#1，128 #2，64 #3，64 #4，256 #5，128 #6，32 #7，128 #8，32。
表6对抗血清型14型多醣(PS)及假肺炎链球菌溶血素(PPN)的抗体(Ab)反应小鼠#抗PS抗体 抗PPN抗体效价OD405(1∶300) 效价OD405(1∶300)1 76800 0.735 9600 0.4542 76800 0.520 9600 0.3603 76800 0.738 9600 0.2854 19200 0.677 9600 0.2665 19200 0.684 9600 0.3816 4800 0.518 4800 0.2617 76800 0.815 9600 0.3488 4800 0.585 1200 0.125如表5及表6所示，具较高抗14型多醣与假肺炎链球菌溶血素的抗体反应的小鼠(小鼠编号1，2，3，4，5，及7)显现较高的调理素作用活性，其中具较低抗14型多醣与假肺炎链球菌溶血素的抗体反应的小鼠(小鼠编号6与8)显现较低的调理素作用活性。发现PBS处理的小鼠无调理素作用活性。
其它实施例可以理解，尽管本发明已以上述实施方法详细说明，但以上描述仅用于说明本发明，并非用于限制本发明的范围。本发明的其它方面、优点及修饰皆包含于权利要求的范围内。
序列表<110>Synergy America，Inc<120>治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法<130>12844-002W01<140>PCT/US2003/035529<141>2003-11-06<150>US 60/424,497<151>2002/11/07<160>26<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>471<212>PRT<213>Streptococcus pneumoniae<400>1Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp1 5 10 15Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe20 25 30Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg35 40 45Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala50 55 60Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu65 70 75 80Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro85 90 95Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe100 105 110Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn115 120 125Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val130 135 140Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln145 150 155 160Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu165 170 175Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln Ile Gln Ile180 185 190Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys195 200 205Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys210 215 220Gln Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val225 230 235 240Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser245 250255Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val260 265 270
Ala Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gln Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys275 280 285Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Arg Val Val Thr290 295 300Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Ser Arg Phe305 310 315 320Thr Ala Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu325 330 335Arg Asp Asn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu340 345350Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser355360 365Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr Tyr Ile Thr Trp Asn Glu Leu Ser Tyr370 375 380Asp His Gln Gly Lys Glu Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn385 390 395 400Gly Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly405 410 415Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala420 425 430Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val435 440 445Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val450 455460Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp465 470<210>2<211>38<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Primer<400>3cagtggatcc ttactagtca ttttctacct tatc 34<210>4<211>38<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Primer<400>6gactggatcc ttactaatct tctacctgag gatag 35<210>7<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Synthetically generated construct<400>9atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc gtgctccgat gacttatagt 300attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360
tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt ggcatcaaga ttatggtcag420gtcaataatg tcccagctag aatgcagtat gaaaaaatca cggctcacag catggaacaa480ctcaaggtca agtttggttc tgactttgaa aagacaggga attctcttga tattgatttt540aactctgtcc attcaggcga aaagcagatt cagattgtta attttaagca gatttattat600acagtcagcg tagatgctgt taaaaatcca ggagatgtgt ttcaagatac tgtaacggta660gaggatttaa aacagagagg aatttctgca gagcgtcctt tggtctatat ttcgagtgtt720gcttatgggc gccaagtcta tctcaagttg gaaaccacga gtaagagtga tgaagtagag780gctgcttttg aagctttgat aaaaggagtc aaggtagctc ctcagacaga gtggaaacag840attttggaca atacagaagt gaaggcggtt attttagggg gcgacccaag ttcgggtgcc900cgagttgtaa caggcaaggt ggatatggta gaggacttga ttcaagaagg cagtcgcttt960acagcagatc atccaggctt gccgatttcc tatacaactt cttttttacg tgacaatgta1020gttgcgacct ttcaaaatag tacagactat gttgagacta aggttacagc ttacagaaac1080ggagatttac tgctggatca tagtggtgcc tatgttgccc aatattatat tacttggaat1140gaattatcct atgatcatca aggtaaggaa gtcttgactc ctaaggcttg ggacagaaat1200gggcaggatt taacggctca ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat1260ctctctgtca aaattagaga gcgttccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat1320gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc1380tatcctcagg tagaagataa ggtagaaaat gac 1413<210>10<211>1380<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetically generated construct<400>10atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc gtgctccgat gacttatagt 300attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt ggcatcaaga ttatggtcag 420gtcaataatg tcccagctag aatgcagtat gaaaaaatca cggctcacag catggaacaa 480ctcaaggtca agtttggttc tgactttgaa aagacaggga attctcttga tattgatttt 540aactctgtcc attcaggcga aaagcagatt cagattgtta attttaagca gatttattat 600acagtcagcg tagatgctgt taaaaatcca ggagatgtgt ttcaagatac tgtaacggta 660gaggatttaa aacagagagg aatttctgca gagcgtcctt tggtctatat ttcgagtgtt 720gcttatgggc gccaagtcta tctcaagttg gaaaccacga gtaagagtga tgaagtagag 780gctgcttttg aagctttgat aaaaggagtc aaggtagctc ctcagacaga gtggaaacag 840attttggaca atacagaagt gaaggcggtt attttagggg gcgacccaag ttcgggtgcc 900cgagttgtaa caggcaaggt ggatatggta gaggacttga ttcaagaagg cagtcgcttt 960acagcagatc atccaggctt gccgatttcc tatacaactt cttttttacg tgacaatgta1020gttgcgacct ttcaaaatag tacagactat gttgagacta aggttacagc ttacagaaac1080ggagatttac tgctggatca tagtggtgcc tatgttgccc aatattatat tacttggaat1140gaattatcct atgatcatca aggtaaggaa gtcttgactc ctaaggcttg ggacagaaat1200gggcaggatt taacggctca ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat1260ctctctgtca aaattagaga gcgttccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat1320gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc1380<210>11<211>42<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer
<400>11gactaagctt gccaccatgg aaattaatgt gagtaaatta ag 42<210>12<211>34<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>12ctgactcgag ttattttact gtaatcaagc catc 34<210>13<211>954<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>pSA-59 Aly insert<400>13atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagttggcgt gcaaccatat 60aggcaagtac acgcacactc aactgggaat ccgcattcaa ccgtacagaa tgaagcggat 120tatcattggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggatgc 180atcatgcagg taggacctgt taataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct 240gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ctaaagaaga gttcatgacg 300gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa 360acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa 420ccaaacaacc actcagacca tgtggatcca tacccttact tggcaaaatg gggcattagc 480cgtgagcagt ttaagcatga tattgagaac ggcttgacga ttgaaacagg ctggcagaag 540aatgacactg gctactggta cgtacattca gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 600aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 660aggaagcaca cagacggcaa ttggtactac tttgaccaat caggcgaaat ggctacaggc 720tggaagaaaa tcgctgagaa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 780tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc aatggtatca 840aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca ggctggtact acctcaaacc agacggaaca 900ctggcagaca agccagaatt cacagtagag ccagatggct tgattacagt aaaa 954<210>14<211>318<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>polypeptide of pSA-59 Aly insert sequence<400>14Met Glu Ile Asn Val Ser Lys Leu Arg Thr Asp Leu Pro Gln Val Gly1 5 10 15Val Gln Pro Tyr Arg Gln Val His Ala His Ser Thr Gly Asn Pro His20 25 30Ser Thr Val Gln Asn Glu Ala Asp Tyr His Trp Arg Lys Asp Pro Glu35 40 45Leu Gly Phe Phe Ser His Ile Val Gly Asn Gly Cys Ile Met Gln Val50 55 60Gly Pro Val Asn Asn Gly Ala Trp Asp Val Gly Gly Gly Trp Asn Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Ala Ala Val Glu Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Lys Glu
85 90 95Glu Phe Met Thr Asp Tyr Arg Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Arg Asn Leu100 105 110Ala Asp Glu Ala Gly Leu Pro Lys Thr Leu Asp Thr Gly Ser Leu Ala115 120 125Gly Ile Lys Thr His Glu Tyr Cys Thr Asn Asn Gln Pro Asn Asn His130 135 140Ser Asp His Val Asp Pro Tyr Pro Tyr Leu Ala Lys Trp Gly Ile Ser145 150 155 160Arg Glu Gln Phe Lys His Asp Ile Glu Asn Gly Leu Thr Ile Glu Thr165 170 175Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly180 185 190Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr195 200 205Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr210 215 220Asp Gly Asn Trp Tyr Tyr Phe Asp Gln Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly225 230 235 240Trp Lys Lys Ile Ala Glu Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala245 250 255Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp260 265 270Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp275 280 285Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Lys290 295 300Pro Glu Phe Thr Val Glu Pro Asp Gly Leu Ile Thr Val Lys305 310315<210>15<211>43<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer<400>15gactaagctt gccaccatgg aagaagctcc cgtagctagt cag43<210>16<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>16gactctcgag ctatccatca gggcctaact cattaag 37<210>17<211>1377<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>pSA-59 Aly insert
<400>17atggaagaag ctcccgtagc tagtcagtct aaagctgaga aagactatga tgcagcagtg 60aaaaaatctg aagctgctaa gaaggcttac gaagaagcta aaaagaaagc agaagacgct 120cagaaaaaat atgatgagga tcagaagaaa actgaggcaa aagcggataa ggaagcaaaa 180gcatctgcgg aaatagataa agccacgttt gctgtacaaa gtgcgtatgt aaaattttta 240aatgtccaat ctaatcgtca aatttcggag aatgaacgaa aaaaacaatt agcagaaata 300gataaagaga tagagaatgc taaacaaaat ttacagaata aacaggaaga atttaataag 360gttagagcag aagtaattcc tgaagcaaag gggttagctg ttactaaaca aaaagcggaa 420gaagctaaaa aagaagcaga agtagctaag agaaaatatg attatgcaac tctaaaggta 480gcactagcga agaaagaagt agaggctaag gaacttgaaa ttgaaaaact tcaatatgaa 540atttctactt tggaacaaga agttgctatt gctcaacatc aagtagataa tttgaaaaaa 600cttcttgctg gtgcggatcc tgatgatggc acaaaagtta tagaagctaa attaaacaaa 660ggagaagctg agctaaacgc taaacaagct gagttagcaa aaaaacaaac agaacttgaa 720aaacttcttg acagccttga tcctgaaggt aagactcagg atgaattaga taaagaagct 780gctgaagctg agttggataa aaaagctgat gaacttcaaa ataaagttgc tgatttagaa 840aaaggaattg ctccttatca aatcaaagtc gctgaattaa ataaagaaat tgctagactt 900caaagcgatt taaaagatgc tgaagaaaat aatgtagaag actatattaa agaaggttta 960gagcaagcta tcgctgataa aaaagctgaa ttagctacaa ctcaacaaaa catagataaa 1020actcaaaaag atttagagga tgctgaatta gaacttgaaa aagtattagc tacattagac 1080cctgaaggta aaactcaaga tgaattagat aaagaagctg cagaagatgc taatattgaa 1140gctcttcaaa acaaagttgc tgatctagaa aacaaggttg ctgaattaga taaagaagtt 1200actagacttc aaagcgattt aaaagatgct gaagaaaaca atgtagaaga ctacgttaaa 1260gaaggcttag ataaagctct tactgataaa aaagttgaat taaataatac tcaaaaagca 1320ttagatactg ctcaaaaagc attagatact gctcttaatg agttaggccc tgatgga1377<210>18<211>459<212>PRT<220>
<223>polypeptide of pSA-60 pspA insert sequence<400>18Met Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr1 5 10 15Asp Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Ala Tyr Glu Glu20 25 30Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln35 40 45Lys Lys Thr Glu Ala Lys Ala Asp Lys Glu Ala Lys Ala Ser Ala Glu50 55 60Ile Asp Lys Ala Thr Phe Ala Val Gln Ser Ala Tyr Val Lys Phe Leu65 70 75 80Asn Val Gln Ser Asn Arg Gln Ile Ser Glu Asn Glu Arg Lys Lys Gln85 90 95Leu Ala Glu Ile Asp Lys Glu Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asn Leu Gln100 105 110Asn Lys Gln Glu Glu Phe Asn Lys Val Arg Ala Glu Val Ile Pro Glu115 120 125Ala Lys Gly Leu Ala Val Thr Lys Gln Lys Ala Glu Glu Ala Lys Lys130 135 140Glu Ala Glu Val Ala Lys Arg Lys Tyr Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Val145 150 155 160Ala Leu Ala Lys Lys Glu Val Glu Ala Lys Glu Leu Glu Ile Glu Lys165 170 175Leu Gln Tyr Glu Ile Ser Thr Leu Glu Gln Glu Val Ala Ile Ala Gln180 185 190His Gln Val Asp Asn Leu Lys Lys Leu Leu Ala Gly Ala Asp Pro Asp195 200205Asp Gly Thr Lys Val Ile Glu Ala Lys Leu Asn Lys Gly Glu Ala Glu
210 215 220Leu Asn Ala Lys Gln Ala Glu Leu Ala Lys Lys Gln Thr Glu Leu Glu225 230 235 240Lys Leu Leu Asp Ser Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu245 250 255Asp Lys Glu Ala Ala Glu Ala Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp Glu Leu260 265 270Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Gln Ile275 280 285Lys Val Ala Glu Leu Asn Lys Glu Ile Ala Arg Leu Gln Ser Asp Leu290 295 300Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu305 310 315 320Glu Gln Ala Ile Ala Asp Lys Lys Ala Glu Leu Ala Thr Thr Gln Gln325 330 335Asn Ile Asp Lys Thr Gln Lys Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Glu Leu340 345350Glu Lys Val Leu Ala Thr Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu355360365Leu Asp Lys Glu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Ile Glu Ala Leu Gln Asn370 375 380Lys Val Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Ala Glu Leu Asp Lys Glu Val385 390 395 400Thr Arg Leu Gln Ser Asp Leu Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu405 410 415Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Asp Lys Ala Leu Thr Asp Lys Lys Val420 425430Glu Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ala Leu Asp Thr Ala Gln Lys Ala Leu435 440 445Asp Thr Ala Leu Asn Glu Leu Gly Pro Asp Gly450 455<210>19<211>34<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>19ctgaggatcc ttactaagct gtaaccttag tctc 34<210>20<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>20caaaattaga gaacgttccg ggcttgcctg ggaatgg 37<210>21<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>21gcccggaacg ttctctaatt ttgacagaga gattacg 37<210>22<211>5<212>PRT<213>Streptococcus pneumoniae<400>22Lys Val Glu Asn Asp1 5<210>23<211>7<212>PRT<213>Streptococcus pneumoniae<400>23Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp1 5<210>24<211>11<212>PRT<213>Streptococcus pneumoniae<400>24Tyr Pro Gln Val Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp1 5 10<210>25<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer<400>25ctgaggatcc ttactatacc tgaggataga gagttgttc 39<210>26<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Promer<400>26gactggatcc ctatacctga ggatagagag ttg 3权利要求
1.含有与肺炎链球菌荚膜多糖轭合的多肽的组合物，其中所述多肽包括肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸的片段，其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO22)，所述多肽缺乏溶血活性，以及所述组合物在给予哺乳动物时引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白质包含SEQ ID NO1的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-460。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-464。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-465。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-466。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-469。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-470。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ ID NO23)。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽缺乏氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO24)。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO1的氨基酸残基1-460所组成。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO1的氨基酸残基1-464所组成。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO1的氨基酸残基1-465所组成。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO1的氨基酸残基1-466所组成。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO1的氨基酸残基1-469所组成。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由SEQ ID NO1的氨基酸残基1-470所组成。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述荚膜多糖选自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、及23F型。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述荚膜多糖为血清型14型。
19.如权利要求1所述的组合物，其中所述荚膜多糖为血清型18C型。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含选自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、及23F型的多种不同的荚膜多糖。
21.如权利要求1所述的组合物，其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述免疫反应包含细胞免疫反应。
23.如权利要求1所述的组合物，其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌荚膜多糖。
24.如权利要求1所述的组合物，其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌溶血素蛋白质。
25.如权利要求1所述的组合物，其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌荚膜多糖及肺炎链球菌溶血素蛋白质。
26.哺乳动物表达载体，其包含可操作性连接于核酸序列的启动子，所述核酸序列含有编码肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸片段多肽的核酸，其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO22)，所述多肽缺乏溶血活性，以及当所述表达载体在给予哺乳动物时，所述多肽引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
27.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白质包含SEQ ID NO1。
28.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-460。
29.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-464。
30.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-465。
31.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-466。
32.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-469。
33.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸1-470。
34.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ ID NO23)。
35.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽缺乏氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO24)。
36.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO1的氨基酸残基1-460所组成。
37.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO1的氨基酸残基1-464所组成。
38.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO1的氨基酸残基1-465所组成。
39.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO1的氨基酸残基1-466所组成。
40.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO1的氨基酸残基1-469所组成。
41.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO1的氨基酸残基1-470所组成。
42.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
43.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应包含细胞免疫反应。
44.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌溶血素蛋白质。
45.哺乳动物表达载体，其包含可操作性连接于核酸序列的启动子，所述核酸序列含有编码肺炎链球菌自溶素多肽的核酸，其中当所述表达载体在给予哺乳动物时，所述多肽引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
46.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO14。
47.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO14的氨基酸序列所构成。
48.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
49.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应包含细胞免疫反应。
50.哺乳动物表达载体，其包含可操作性连接于核酸序列的启动子，所述核酸序列含有编码肺炎链球菌肺炎球菌表面蛋白A多肽的核酸，其中当所述表达载体在给予哺乳动物时，所述多肽引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
51.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO18。
52.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体，其中所述多肽由SEQID NO18的氨基酸序列所构成。
53.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
54.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体，其中所述免疫反应包含细包免疫反应。
55.多肽，其由选自SEQ ID NO1的氨基酸1-460、SEQ ID NO1的氨基酸1-464、SEQ ID NO1的氨基酸1-466以及SEQ ID NO1的氨基酸1-469的氨基酸序列所构成。
56.引起哺乳动物体内免疫反应的方法，其包含给予哺乳动物有效引起所述哺乳动物对抗肺炎链球菌的免疫反应的含量的如权利要求1所述的组合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫反应为预防性免疫反应。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫反应为治疗性免疫反应。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫反应为抗至少一种肺炎链球菌血清型的交叉反应性反应，所述肺炎链球菌血清型与所述组合物中的荚膜多糖不同。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述荚膜多糖为血清型7型。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述荚膜多糖为血清型6B型。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述荚膜多糖为血清型18C型。
63.如权利要求59所述的方法，其中所述荚膜多糖为血清型23F型。
64.如权利要求56所述的方法，其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
65.引起哺乳动物体内免疫反应的方法，所述方法包含给予哺乳动物一定量的可有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌免疫反应的如权利要求26所述的表达载体。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
67.引起哺乳动物体内免疫反应的方法，所述方法包含给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应的如权利要求45所述的表达载体。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
69.引起哺乳动物体内免疫反应的方法，所述方法包含给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应的如权利要求50所述的表达载体。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
71.引起哺乳动物体内免疫反应的方法，所述方法包含给予哺乳动物一种哺乳动物表达载体，所述表达载体包含可操作性连接核酸序列的启动子，所述核酸序列含有编码肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段的核酸；及给予所述哺乳动物纯化的溶血素多肽或其抗原片段，其中所述组合的给予方式引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌溶血素的免疫反应。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述哺乳动物被给予至少两次分别剂量的所述表达载体。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述溶血素多肽或其抗原片段的给予在所述表达载体给予后的至少1星期给予。
74.含有与非肺炎链球菌细菌多糖轭合的多肽的组合物，其中所述多肽包含肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸的片段，所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO22)，所述多肽缺乏溶血活性，以及所述组合物在给予哺乳动物时引起抗非肺炎链球菌的免疫反应。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述非肺炎链球菌选自肺炎球菌；流感嗜血杆菌b型；脑膜炎球菌A、B、或C群；以及B群链球菌Ia、Ib、II、III、V或VIII型。
76.引起哺乳动物体内免疫反应的方法，所述方法包含给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗非肺炎链球菌的免疫反应的如权利要求74所述的组合物。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述非肺炎链球菌选自肺炎球菌；流感嗜血杆菌b型；脑膜炎球菌A、B、或C群；以及B群链球菌Ia、Ib、II、III、V或VIII型。
78.轭合于权利要求1所述的组合物上的纯化抗体。
79.治疗或预防哺乳动物肺炎链球菌感染的方法，所述的方法包含给予哺乳动物治疗性或预防性有效量的纯化抗体，所述纯化抗体轭合于权利要求1所述的组合物。
全文摘要
本发明提供用以治疗或预防肺炎球菌感染的多肽、多糖－多肽轭合物、以及表达载体。该组合物在给予哺乳动物时会引起抗肺炎球菌的免疫反应。该组合物可预防性作为接种个体的疫苗和/或治疗性在感染的个体内引起治疗性的免疫反应。
文档编号A61K39/02GK1711105SQ200380102758
公开日2005年12月21日 申请日期2003年11月6日 优先权日2002年11月7日
发明者麦可·C·陈, 邱创究, 李忠明, 陈东圣 申请人:新纳几美国公司